CN102286450B - 一种从海滨锦葵籽中提取活性蛋白质的工艺及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种从海滨锦葵籽中提取活性蛋白质的工艺，其特征在于：海滨锦葵籽粉碎，去脂，超声，过滤；上DEAE-纤维素柱，洗涤杂质，分别用0.01PBS-0.1molNaCL/L、-0.25molNaCL/L洗脱，收集，透析，冻干，得产品。本发明工艺提取制得的活性蛋白质可以在制备增强体液免疫和抗肝脏肿瘤的保健食品或药品中应用，依据这些生物活性可根据需要制成胶囊、片剂、口服液、粉针剂等保健品、药品。
Description
技术领域
本发明属于生化分离技术领域，特别是涉及一种从海滨锦葵籽中提取活性蛋白质的工艺；本发明还涉及前述活性蛋白质的用途。
背景技术
海滨锦葵(Kostelezkya virginica)是适宜海滨地区生长的锦葵科锦葵属多年生宿根盐生植物,天然分布于美国东部沿海盐沼海岸带。1992年由南京大学引种至中国。有文献报导，因其耐盐水浇灌，种子产量高的耐盐油料作物而日益受到人们的重视。有实验表明海滨锦葵种子中营养成分有较高的营养价值,可以作为油料、食品、饲料、保健品和其他工业用途的原料；然而，基于探究其主要活性成分的研究较少,近年来仅有少量研究表明海滨锦葵种子具有增强免疫，降低血糖等功效的论文。而探明锦葵籽中的活性蛋白质成分的论文未见。从锦葵籽中提取制备锦葵生物活性蛋白质组分专利文献至今未有。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的、工艺更为简单合理的从海滨锦葵的籽中提取活性蛋白质的工艺。
本发明需要解决的另一技术问题是提供上述工艺提取活性蛋白质的用途。
本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种从海滨锦葵的籽中提取活性蛋白质的工艺，其特点是，其步骤如下：
一种从海滨锦葵籽中提取活性蛋白质的工艺，其特征在于，其步骤是：采集海滨锦葵的籽，粉碎，用石油醚或乙醚抽提去脂肪，得到无脂肪的干粉；将锦葵籽无脂肪干粉按1:20比例加入蒸馏水，混匀，用超声仪超声提取；超声条件为：温度40℃，功率200W，时间1小时；超声结束后，过滤，滤液存放，滤渣按比例1:20加入蒸馏水，再用上述超声条件重复提取一次；两次滤液合并，滤液减压蒸发，得超声提取浓缩液；
用DEAE-纤维素柱对超声提取浓缩液进行分离；DEAE-纤维素按常规方法处理，处理好后装柱，用磷酸缓冲液平衡，上样；先用0.01molPBS pH6.5洗涤柱子，再用0.01molPBS -0.1molNaCl pH6.5洗脱并第一次收集洗脱液；随后再用0.01molPBS -0.25molNaCl pH6.5洗脱并第二次收集洗脱液；将2次洗脱液分别装透析袋对水透析，透析后收集透析内液，冻干浓缩，分别得到两种活性蛋白质。
以下是发明人所做的关于本发明工艺提取得到的海滨锦葵的两种活性蛋白质的生物学活性试验。
1.）海滨锦葵两种蛋白质的免疫学活性
表1.锦葵籽活性蛋白对小鼠脾细胞和胸腺细胞增殖的影响
2.）海滨锦葵两种蛋白质的抗肿瘤活性
表2. 锦葵籽活性蛋白对Hep-S细胞生长的抑制作用
根据表1，海滨锦葵籽活性蛋白具有显著的提高小鼠免疫细胞增殖的作用；又据表2，海滨锦葵籽活性蛋白具有显著抑制Hep-S肿瘤细胞生长的作用。而且作用强度与浓度比成明显的正相关关系。
本发明工艺制得的2种蛋白质的含量测定方法可能使用Folin-酚法（Lowry法）。
本发明第一次使用超声技术提取出了海滨锦葵籽水溶性蛋白质，并且初步做了免疫学、抗肿瘤的生物学活性。根据这些生物活性可制成胶囊、片剂、口服液、粉针剂等保健品、药品，供有关患者使用。
具体实施方案
以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。
实施例1。从海滨锦葵籽中提取活性蛋白质的工艺，其步骤如下：
1．取60 g干燥的锦葵籽，研成粉末样品，石油醚（100 mL×3）80℃ 回流萃取，去脂籽粒粉室温阴干，得去脂肪样品51.7g。
取所得去脂籽粉样，以1：20（w:v）的比例加蒸馏水1100ml，然后采用超声仪超声破坏细胞膜辅助蛋白提取，超声条件：温度40℃，功率200W，时间1h，超声后用纱布过滤，重复以上步骤，收集滤液1700ml。
取DEAE-纤维素，按常规处理，处理好的DEAE纤维素装填25×4cm柱子，以水覆盖，装柱完毕后用0.01mol/L PBS (pH6.5) 以稳定流速通过柱体直至达到平衡。
将收集好的滤液以稳定流速缓慢的流入柱中，使其吸附于柱上。上样完毕后采用0.01mol/L PBS (pH6.5) 洗涤柱子，用量为2-3个床体积。
依次用0.01mol PBS pH6.5-0.1mol NaCL/L，0.01mol PBS pH6.5-0.25mol NaCL/L的洗脱液洗脱。收集洗脱液，采用紫外检测仪（波长280nm）检测,收集0.01mol PBS pH6.5-0.1mol NaCL/L洗脱液得470ml，0.01mol PBS pH6.5-0.25mol NaCL/L洗脱液得400ml。分别装透析袋，对蒸馏水透析，透析后收集，然后用冻干机冻干。
冷冻干燥得到0.01mol PBS pH6.5-0.1mol NaCL/L洗脱峰冻干样品0.326g,含量31.9%，0.01mol PBS pH6.5-0.25mol NaCL/L洗脱峰冻干样品0.89g,含量58.8%两种活性蛋白样品。
2．海滨锦葵籽活性蛋白质的测定方法
从海滨锦葵中分离制备的活性蛋白质，按常规方法Folin-酚法（Lowry法）测定含量，鉴定纯度。活性蛋白组分经质谱分析初步确定，主要有三种已知蛋白分别是-乳糖酰基谷胱甘肽裂解酶；苹果酸脱氢酶；烯醇化酶等。
本实施例制得的活性蛋白质可以按常规方法单独用于或组合用于制成胶囊、片剂、口服液、粉针剂等保健品、药品。
Claims (2)
1.一种从海滨锦葵籽中提取活性蛋白质的工艺，其特征在于，其步骤是：采集海滨锦葵的籽，粉碎，用石油醚或乙醚抽提去脂肪，得到无脂肪的干粉；将锦葵籽无脂肪干粉按1:20比例加入蒸馏水，混匀，用超声仪超声提取；超声条件为：温度40℃，功率200W，时间1小时；超声结束后，过滤，滤液存放，滤渣按比例1:20加入蒸馏水，再用上述超声条件重复提取一次；两次滤液合并，滤液减压蒸发，得超声提取浓缩液；
用DEAE-纤维素柱对超声提取浓缩液进行分离；DEAE-纤维素按常规方法处理，处理好后装柱，用磷酸缓冲液平衡，上样；先用0.01molPBSpH6.5洗涤柱子，再用0.01molPBS -0.1molNaCl pH6.5洗脱并第一次收集洗脱液；随后再用0.01molPBS -0.25molNaCl pH6.5洗脱并第二次收集洗脱液；将2次洗脱液分别装透析袋对水透析，透析后收集透析内液，冻干浓缩，分别得到两种活性蛋白质。
2.一种如权利要求1所述的方法提取得到的第一次收集洗脱液制得的活性蛋白质在制备增强体液免疫和抗肝脏肿瘤的药品中的应用；第二次收集洗脱液制得的活性蛋白质在制备抗肝脏肿瘤的药品中的应用。
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