CN111643517B - 桑葚多糖衍生物s-mfp-30在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

桑葚多糖衍生物s-mfp-30在制备抗肿瘤药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了桑葚多糖衍生物S‑MFP‑30在制备抗胃癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌及肝癌的药物中的应用；S‑MFP‑30对前述各肿瘤细胞的增殖均表现出了较好的抑制活性，且具有明显的量效关系和时间依赖性，还具有抑制各肿瘤细胞迁移的作用，与其他植物多糖相比，以同等或更低的浓度达到了更好的效果；其作为天然提取物的衍生物，原料丰富易得，制备方法成熟稳定，为安全、低毒、高效的抗肿瘤药物的开发与应用奠定了基础；本发明也为桑葚作为功能性食品的开发和商业运用之外，提供了一个新的产业开发和应用方向。

Description

桑葚多糖衍生物S-MFP-30在制备抗肿瘤药物中的应用
技术领域
本发明属于植物提取物的应用技术领域，具体涉及桑葚多糖衍生物S-MFP-30在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
目前，最常见的癌症治疗方法基本是将手术切除与术后放疗、化疗相结合的综合治疗方案，而市场上的化学治疗药物通常不具有特异性，在杀死肿瘤细胞的同时也会对正常的机体细胞造成不可磨灭的损伤。当前主要研究方向是从植物中发现具有一定生物活性的先导化合物，植物多糖是由植物细胞代谢产生的聚合度超过十的大分子化合物，因其良好的生物活性和安全性而引起了国内外学者的关注。植物多糖存在于生物体中，来源广泛，种类繁多，包括淀粉、果胶、纤维素等重要的生物大分子，是维持生命活动正常运转的基本物质之一。自 20世纪50年代真菌多糖的免疫活性被发现以来，对于植物多糖的研究日益受到人们的关注。研究发现，许多植物多糖具有免疫调节作用，是天然的免疫调节剂，具有促进机体免疫器官的生长、激活免疫细胞、激活补体系统及释放细胞因子等免疫调节功能，因此对其免疫调节作用及机制研究逐步成为研究的热点。植物多糖具有多种生物活性，如抗氧化剂，降血，降血脂，免疫调节等，作为一种潜在的抗肿瘤先导化合物，具有很高的安全性，具有深入研究的意义和价值。
桑葚(Mori Fructus)，具有滋阴补血、生津润燥的药效，用于肝肾阴虚、眩晕耳鸣、心悸失眠、须发早白、津伤口渴、内热消渴、肠燥便秘等功效，记载于2015年版药典，并进入了药食同源原料目录(2017)中。桑葚多糖是桑葚中重要的生物活性物质，具有如抗氧化、抗衰老、抗病毒、抗菌，降血糖、降血脂以及免疫调节等多种生理活性。桑葚产量大，易于获得，其中多糖组分的生物活性较为广泛，因而受到医药、保健功能食品研发方向的科研人员的关注，是新药研发的主要目标之一。研究表明，许多植物多糖具有良好的抑制癌细胞增殖的作用，是安全、低毒的抗肿瘤天然活性药物。目前，世界上对于癌症的治疗手段虽然能显著减轻患者的相关症状，但治疗成本高、复发率高，会给患者带来极高的治疗负担。因此，对于新型、安全、低毒、高效的抗肿瘤药物的研究与开发具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供桑葚多糖衍生物S-MFP-30在制备抗肿瘤药物中的应用，其首次被发现具有抑制MKN-45、NCI-H1650、MCF-7、OVCAR-3、HepG-2细胞的活性，作为天然提取物的衍生物，高效、安全，原料丰富易得，且制备方法成熟稳定。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
桑葚多糖衍生物S-MFP-30在制备抗胃癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌及肝癌的药物中的应用。
前述桑葚多糖衍生物S-MFP-30的应用中，所述桑葚多糖衍生物S-MFP-30是桑葚多糖 MFP-30-1的硫酸化衍生物，其硫酸化取代度为0.39％；MFP-30-1的单糖组成为甘露糖6.46％-7.14％、鼠李糖7.03％-7.77％、葡萄糖34.77％-38.43％和木糖46.74％-51.66％。
前述桑葚多糖衍生物S-MFP-30的应用中，所述桑葚多糖衍生物S-MFP-30的制备方法如下：将桑葚粉碎，依次用索氏提取法进行脱脂，用热水浸提法提取桑葚多糖，用Sevag法脱蛋白，再以低浓度乙醇分级沉淀法分离得不同组分桑葚粗多糖，然后采用DEAE-52纤维素柱层析对乙醇分级沉淀时乙醇浓度为30％的桑葚粗多糖MFP-30进行纯化并除掉其中色素，用蒸馏水洗脱得到的即桑葚多糖MFP-30-1；采用浓硫酸法修饰MFP-30-1，即得S-MFP-30。
前述桑葚多糖衍生物S-MFP-30的应用中，所述桑葚多糖衍生物S-MFP-30的制备方法具体包括以下步骤：
(1)桑葚粉碎、脱脂：称取桑葚样品，粉碎成粉末，按料液比1∶2加入石油醚，用索氏提取法对其进行脱脂处理，每次2h，脱脂3次，脱脂后滤掉废液，得脱脂桑葚；
(2)桑葚多糖的提取：采用热水浸提法，将脱脂桑葚置于洁净容器中，按料液比1∶3加入蒸馏水，于90℃恒温条件下进行热水浸提，2h后用纱布过滤，保存滤液，滤渣继续在相同条件下进行热水浸提，反复3次并合并滤液，将滤液离心去除小颗粒杂质，收集上清液，在60℃条件下用旋转蒸发仪对其进行浓缩，即得桑葚多糖提取物，备用；
(3)桑葚多糖提取物脱蛋白：采用Sevag法，将桑葚多糖提取物置于分液漏斗中，按体积比1∶2加入V三氯甲烷∶V正丁醇＝4∶1的Sevag试剂，充分摇匀，静置，直至分液漏斗中的液体分层完毕后除去底层有机溶剂及中间层蛋白质，收集上层液，反复操作，直至分液漏斗中的溶液无明显絮状物沉淀析出为止，将收集的上层液离心除去蛋白质，收集上清液，备用；
(4)桑葚粗多糖的制备：采用低浓度乙醇分级沉淀的方法，向步骤(3)所得上清液中加入无水乙醇至乙醇浓度为30％，将其静置于4℃环境中24h，然后离心，收集上清液并获取沉淀，依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤沉淀3次，真空冷冻干燥，即得桑葚粗多糖MFP-30；
(5)桑葚多糖的纯化：采用DEAE-52纤维素柱层析对MFP-30进行纯化并除掉其中色素，具体为：准确称取MFP-30，加入蒸馏水搅拌溶解，配制浓度为6mg·mL-1的MFP-30溶液，将20mL 6mg·mL-1的MFP-30溶液用300mL蒸馏水经DEAE-52纤维素柱进行分段洗脱，每段每管各收集10mL洗脱液，收集30管，采用苯酚-硫酸法对每段洗脱液进行紫外跟踪测定，直至无多糖为止，按照吸收峰情况合并组分，浓缩，透析，真空冷冻干燥，即得桑葚多糖MFP-30-1；
(6)硫酸化修饰：向锥形瓶中依次加入12mL浓硫酸、3mL正丁醇和0.50g硫酸铵，充分搅拌，冰浴至0℃后，加入500mg桑葚多糖MFP-30-1，反应4h，反应完成后用5mol·L-1NaOH中和PH 至8，再用自来水透析2d，用蒸馏水透析1d，减压浓缩，再加入3倍95％乙醇于4℃环境下醇沉，离心，取沉淀，真空冷冻干燥后，即得硫酸化桑葚多糖S-MFP-30。
前述桑葚多糖衍生物S-MFP-30的应用中，所述胃癌为MKN-45细胞相关的胃淋巴结；所述非小细胞肺癌为NCI-H1650细胞相关的肺癌和细支气管肺泡癌；所述乳腺癌为MCF-7细胞相关的乳腺癌；所述卵巢癌为OVCAR-3细胞相关的卵巢癌；所述胰腺癌为NCI-H1650、MCF-7、 OVCAR-3细胞相关的胰腺癌；所述肝癌为HepG-2细胞相关的肝细胞癌。
发明人偶然发现桑葚多糖对于某种肿瘤细胞具有良好的抑制其增殖的作用，因而开展了相关研究。本发明重点研究了桑葚多糖衍生物S-MFP-30对人胃癌细胞MKN-45、人非小细胞肺癌细胞NCI-H1650、人乳腺癌细胞MCF-7、人卵巢癌细胞OVCAR-3和人肝癌细胞HepG-2的抑制活性，并研究了其抑制这些肿瘤细胞迁移能力，为寻找安全有效的抗肿瘤化合物提供了数据支持。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供了桑葚多糖衍生物S-MFP-30在制备抗胃癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌及肝癌的药物中的应用。本发明桑葚多糖衍生物S-MFP-30在制备上述抗肿瘤药物中的用途为首次发现，其对肿瘤细胞的增殖表现出了较好的抑制作用，且具有明显的量效关系和时间依赖性，还具有抑制肿瘤细胞迁移的作用，与其他植物多糖相比，以同等或更低的浓度达到了更好的效果。而且S-MFP-30作为天然提取物的衍生物，原料丰富易得，制备方法成熟稳定，为安全、低毒、高效的抗肿瘤药物的开发与应用奠定了基础。本发明也为桑葚作为功能性食品的开发和商业运用之外，提供了一个新的产业开发和应用方向。
附图说明
图1是MTT法测定桑葚多糖衍生物S-MFP-30等(2.0mg·mL-1)对MKN-45细胞增殖的抑制作用；
图2是MTT法测定不同浓度的桑葚多糖衍生物S-MFP-30对MKN-45细胞生长抑制作用的量效关系；
图3是桑葚多糖衍生物S-MFP-30抑制MKN-45细胞迁移作用对比图(40×)；
图4是MTT法测定桑葚多糖衍生物S-MFP-30等(2.0mg·mL-1)对NCI-H1650细胞增殖的抑制作用；
图5是MTT法测定不同浓度的桑葚多糖衍生物S-MFP-30对NCI-H1650细胞生长抑制作用的量效关系；
图6是桑葚多糖衍生物S-MFP-30抑制NCI-H1650细胞迁移作用对比图(40×)；
图7是MTT法测定桑葚多糖衍生物S-MFP-30等(2.0mg·mL-1)对MCF-7细胞增殖的抑制作用；
图8是MTT法测定不同浓度的桑葚多糖衍生物S-MFP-30对MCF-7细胞生长抑制作用的量效关系；
图9是桑葚多糖衍生物S-MFP-30抑制MCF-7细胞迁移作用对比图(40×)；
图10是MTT法测定桑葚多糖衍生物S-MFP-30等(2.0mg·mL-1)对OVCAR-3细胞增殖的抑制作用；
图11是MTT法测定不同浓度的桑葚多糖衍生物S-MFP-30对OVCAR-3细胞生长抑制作用的量效关系；
图12是桑葚多糖衍生物S-MFP-30抑制OVCAR-3细胞迁移作用对比图(40×)；
图13是MTT法测定桑葚多糖衍生物S-MFP-30等(2.0mg·mL-1)对HepG-2细胞增殖的抑制作用；
图14是MTT法测定不同浓度的桑葚多糖衍生物S-MFP-30对HepG-2细胞生长抑制作用的量效关系；
图15是桑葚多糖衍生物S-MFP-30抑制HepG-2细胞迁移作用对比图(40×)。
具体实施方式
实施例1：桑葚多糖衍生物S-MFP-30的制备：
将桑葚粉碎，依次用索氏提取法进行脱脂，用热水浸提法提取桑葚多糖，用Sevag法脱蛋白，再以低浓度乙醇分级沉淀法分离得不同组分桑葚粗多糖，然后采用DEAE-52纤维素柱层析对乙醇分级沉淀时乙醇浓度为30％的桑葚粗多糖MFP-30进行纯化并除掉其中色素，用蒸馏水洗脱得到的即桑葚多糖MFP-30-1；采用浓硫酸法修饰MFP-30-1，即得S-MFP-30。S-MFP-30 的硫酸化取代度为0.39％；MFP-30-1的单糖组成为甘露糖6.8％、鼠李糖7.4％、葡萄糖36.6％和木糖49.2％。
实施例2：桑葚多糖衍生物S-MFP-30的制备，具体包括以下步骤：
(1)桑葚粉碎、脱脂：称取桑葚样品，粉碎成粉末，按料液比1∶2加入石油醚，用索氏提取法对其进行脱脂处理，每次2h，脱脂3次，脱脂后滤掉废液，得脱脂桑葚；
(2)桑葚多糖的提取：采用热水浸提法，将脱脂桑葚置于洁净容器中，按料液比1∶3加入蒸馏水，于90℃恒温条件下进行热水浸提，2h后用纱布过滤，保存滤液，滤渣继续在相同条件下进行热水浸提，反复3次并合并滤液，将滤液离心(3500r·min-1,10min)去除小颗粒杂质，收集上清液，在60℃条件下用旋转蒸发仪对其进行浓缩，即得桑葚多糖提取物，备用；
(3)桑葚多糖提取物脱蛋白：采用Sevag法，将桑葚多糖提取物置于分液漏斗中，按体积比1∶2加入V三氯甲烷∶V正丁醇＝4∶1的Sevag试剂，充分摇匀，静置，直至分液漏斗中的液体分层完毕后除去底层有机溶剂及中间层蛋白质，收集上层液，反复操作，直至分液漏斗中的溶液无明显絮状物沉淀析出为止，将收集的上层液离心(3500r·min-1,10min)除去蛋白质，收集上清液，备用；
(4)桑葚粗多糖的制备：采用低浓度乙醇分级沉淀的方法，向步骤(3)所得上清液中加入无水乙醇至乙醇浓度为30％，将其静置于4℃环境中24h，然后离心(3500r·min-1,10min)，收集上清液并获取沉淀，依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤沉淀3次，真空冷冻干燥，即得桑葚粗多糖MFP-30；
(5)桑葚多糖的纯化：采用DEAE-52纤维素柱层析对MFP-30进行纯化并除掉其中色素，具体为：准确称取MFP-30，加入蒸馏水搅拌溶解，配制浓度为6mg·mL-1的MFP-30溶液，将20mL 6mg·mL-1的MFP-30溶液用300mL蒸馏水经DEAE-52纤维素柱(3×50cm)进行分段洗脱(流速2.5mL·min-1)，每段每管各收集10mL洗脱液，收集30管，采用苯酚-硫酸法对每段洗脱液进行紫外跟踪测定，直至无多糖为止，按照吸收峰情况合并组分，浓缩，透析，真空冷冻干燥，即得桑葚多糖MFP-30-1；MFP-30-1的单糖组成为甘露糖7.1％、鼠李糖7.7％、葡萄糖35.3％和木糖49.9％；
(6)硫酸化修饰：向锥形瓶中依次加入12mL浓硫酸、3mL正丁醇和0.50g硫酸铵，充分搅拌，冰浴至0℃后，加入500mg桑葚多糖MFP-30-1，反应4h，反应完成后用5mol·L-1NaOH中和PH 至8，再用自来水透析2d，用蒸馏水透析1d，减压浓缩，再加入3倍95％乙醇于4℃环境下醇沉，离心(3500r·min-1,10min)，取沉淀，真空冷冻干燥后，即得硫酸化桑葚多糖S-MFP-30； S-MFP-30的硫酸化取代度为0.39％。
实验例：
主要缩写符号说明
Figure RE-GDA0002614733160000051
Figure RE-GDA0002614733160000061
一、桑葚多糖衍生物S-MFP-30抑制MKN-45、NCI-H1650、MCF-7、OVCAR-3、HepG-2细胞增殖活性的研究
1.1试验材料与仪器
1.1.1试验材料与试剂
桑葚多糖经分离纯化、化学修饰得到：MPF-30-1、MPF-30-2、S-MPF-30、MPF-50-1、MPF-50-2、S-MPF-50、MPF-70-1、MPF-70-2、MPF-90-1和MPF-90-2。研究中所使用的桑葚多糖及其衍生物的具体信息见表1-1：
表1-1桑葚多糖及其衍生物信息
Figure RE-GDA0002614733160000062
DMEM basic(1X)，RPMI 1640(1X)，MEM basic(1X)，Ham’sF-12K(1X)细胞培养基，胰蛋白酶-EDTA，赛默飞(中国)世尔科技有限公司；
3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide(MTT)、dimethyl sulfoxide(DMSO，细胞培养级)，索莱宝生物科技有限公司；胎牛血清，PBS，100U·mL-1链霉素和青霉素(细胞培养级)，生物科技有限公司。
1.1.2试验主要仪器设备
分析天平，二氧化碳培养箱，细胞计数仪，酶标仪，离心机，超净工作台，液氮罐等。
1.1.3试验中使用的细胞
人胃癌MKN-45细胞，中国武汉细胞库；人非小细胞肺癌NCI-H1650细胞、人乳腺癌MCF-7 细胞、人卵巢癌NCI：OVCAR-3细胞、人肝癌HepG-2细胞，普诺赛生命科技有限公司。
1.2实验方法
1.2.1细胞复苏
将无菌室中的恒温水浴锅事先预热至37℃，将细胞从液氮罐中迅速取出，尽快放入水浴锅中，使冻存管内的液体在3min内全部溶解，消毒后进入超净工作台，将冻存管中溶解后的细胞悬液复悬后加入放有5mL相对应细胞培养基的10mL离心管中，复悬后放入离心机中， 1000r·min-1离心5min。吸弃上清液，加入1mL培养基后复悬，将得到的细胞悬液放入T25 培养瓶中，再向其中加入2mL培养基振荡瓶身，使细胞悬液均匀覆盖底部后，放入37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。培养24h、细胞贴壁后，将培养基吸弃，加入2mL PBS溶液，轻轻振荡，吸弃PBS溶液，重复两次后加入3mL完全培养基，放入37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。培养至细胞密度为80-90％后，可以进行传代(防止因细胞密度过高而引起的营养不足或生存空间过小，进而引发细胞凋亡)。
1.2.2细胞传代与冻存
细胞密度长至80-90％时，可以进行细胞传代或冻存。将细胞培养瓶从细胞培养箱中取出，吸弃旧细胞培养基，加入2mL PBS溶液，轻轻振荡，吸弃PBS溶液，重复两次后加入1mL胰蛋白酶，放入37℃，5％CO2细胞培养箱中进行孵育，不同细胞孵育时间如表1-2所示。孵育结束后，迅速向其中加入2mL细胞完全培养基以终止消化，并轻柔吹打细胞培养瓶底部，将底部的细胞完全吹打下来后，将得到细胞悬液吸至10mL离心管中，1000r·min-1离心5min。
(1)传代
将上清液吸弃，加入2mL细胞完全培养基，复悬后，将得到的细胞悬液放入T25培养瓶中，再向其中加入2mL细胞完全培养基振荡瓶身，使细胞悬液均匀覆盖底部后，放入37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。
表1-2肿瘤细胞加入胰蛋白酶后的孵化时间
Figure RE-GDA0002614733160000071
(2)冻存
将上清液吸弃，加入1mL细胞冻存液(90％胎牛血清+10％DMSO)，复悬后加入2mL细胞冻存管中，写上冻存的细胞种类、冻存日期后，进行梯度程序降温(4℃放置30min；-20℃放置30min，-80℃放置30min后，放入-160℃液氮罐)即可。
1.2.3细胞培养
MKN-45细胞在培养过程中的换液频率、完全培养基配制方法如表1-3所示。细胞均放于 37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。细胞中处于对数生长期的将用于进一步的实验。
表1-3肿瘤细胞换液频率、完全培养基配制方法
Figure RE-GDA0002614733160000081
1.2.4桑葚多糖衍生物S-MFP-30抗肿瘤活性初筛
通过MTT法对桑葚多糖及其衍生物的抗肿瘤活性进行初步筛选，具体步骤如下。选择在对数生长期的肿瘤细胞，参考表1-2用1mL0.25％胰蛋白酶对各细胞进行消化，消化对应时长后，加入2mL含有10％胎牛血清的细胞培养基以终止消化，并轻柔吹打细胞培养瓶底部，将底部的细胞完全吹打下来后，将得到细胞悬液吸至10mL离心管中，1000r·min-1离心5min。吸弃细胞上清液，加入上述细胞培养基复悬后测定细胞浓度，并将细胞浓度调整至1×105个·mL-1。96孔板四周加入100μL PBS溶液，选取五个孔为对照组，仅含细胞培养基；将100μL细胞悬浮液接种至96孔板剩余孔中，放入培养箱中孵育24h。24h后，吸弃细胞上清液，将贴壁后的细胞分为以下几组：①对照组：加入无血清培养基；②实验组：加入若干种桑葚多糖及其衍生物溶液(2.0mg·mL-1)处理。24h后，将5mg·mL-1 20μL MTT溶液添加到每个孔中，再孵育4h。将形成的紫色的甲瓒晶体溶解在150μL的DMSO中，振荡10min后，在490nm处，使用酶标仪读取各孔的吸光度值，并通过使用以下公式计算抑制百分比。
Figure RE-GDA0002614733160000082
上述Aexperiment代表的是实验组的吸光度值；Ablank代表的是对照组的吸光度值；Acontrol代表的是对照组的吸光度值。
选择抑制率大于60％的桑葚多糖及其衍生物进行进一步的研究。
1.2.5桑葚多糖衍生物S-MFP-30抗肿瘤活性的量效关系研究
通过MTT法研究初筛后的桑葚多糖衍生物S-MFP-30抗肿瘤活性的量效关系，具体步骤如下：选择在对数生长期的肿瘤细胞进行实验，参照1.2.4进行细胞铺板，将贴壁后的细胞分为以下2组：①对照组：加入无血清培养基；②实验组：加入有活性的桑葚多糖衍生物S-MFP-30溶液(15.625，31.25，62.5，125，250，500，1000，2000μg·mL-1)处理。24h 后，将5mg·mL-1 20μL MTT溶液添加到每个孔中，再孵育4h。将形成的紫色的甲瓒晶体溶解在150μL的DMSO中，振荡10min后，在490nm处，使用酶标仪读取各孔的吸光度值，使用公式(1)计算抑制百分比，并通过不同浓度桑葚多糖衍生物S-MFP-30溶液的抑制率计算桑葚多糖衍生物S-MFP-30对于相应肿瘤细胞的IC50值。
1.2.6桑葚多糖衍生物S-MFP-30抗肿瘤活性的时效关系研究
通过MTT法研究初筛后的桑葚多糖衍生物S-MFP-30抗肿瘤活性的时效关系，根据桑葚多糖衍生物S-MFP-30作用时间长度不同，测定对应时间点下的抑制率，从而得到对肿瘤细胞的时效关系，具体步骤如下：选择在对数生长期的肿瘤细胞进行实验，参照1.2.4进行细胞铺板，贴壁24h后，将贴壁后的细胞分为以下2组：①对照组：加入无血清培养基；②实验组：加入如表1-4对应浓度的桑葚多糖衍生物S-MFP-30溶液进行处理。于12、24及48h 后，分别将5mg·mL-1 20μL MTT溶液添加到每个孔中，再孵育4h。将形成的紫色的甲瓒晶体溶解在150μL的DMSO中，振荡10min后，在490nm处，使用酶标仪读取各孔的吸光度值，通过公式(1)计算抑制百分比，对比不同时间点S-MFP-30对于肿瘤细胞的抑制率，得到S-MFP-30抗肿瘤活性的时效关系。
表1-4对肿瘤细胞具有抑制作用的桑葚多糖衍生物S-MFP-30及浓度信息(μg·mL-1)
Figure RE-GDA0002614733160000091
1.3数据统计分析
使用软件Office 2016、SPSS statistics 21对实验结果进行数据处理，并通过Origin Pro 8.0软件以
Figure RE-GDA0002614733160000092
表示实验结果，使用Student t检验分析了两组之间的差异，P<0.05 即为具有统计学意义。
二、桑葚多糖衍生物S-MFP-30抑制肿瘤细胞迁移能力的研究
有些肿瘤细胞具有较强的迁移活性，而其不断迁移会影响机体正常组织的生理活动，对机体健康产生严重后果，因此研究桑葚多糖及其衍生物对于肿瘤细胞迁移作用的影响具有十分重要的意义。为了探索桑葚多糖衍生物S-MFP-30对肿瘤细胞迁移能力的影响，发明人设计了细胞划痕实验。使用Image J软件对不同时间点细胞划痕中的划痕面积大小进行测量，并计算不同时间点的迁移率，从而得到桑葚多糖衍生物S-MFP-30对于肿瘤细胞迁移的抑制作用，直观地显示对细胞迁移的影响。
2.1试验材料与仪器
2.1.1试验材料与试剂
实验材料为对肿瘤细胞具有较强抑制活性的桑葚多糖衍生物S-MFP-30，选取与IC50值最为接近的浓度作为实验浓度。多糖名称及相应浓度见表1-4。
实验试剂：MTT，75°酒精，84消毒液，MEM、RPMI 1640、Ham 12-K细胞培养基，胎牛血清，PBS缓冲盐，双抗，胰酶。
2.1.2试验主要仪器设备
冷冻干燥机，十万分之一天平，离心机，恒温数显水浴锅，超声清洗器，摇床，酶标仪，二氧化碳培养箱(赛默飞，ESCO)，移液枪，冰箱，液氮罐，细胞计数仪，显微镜，超净工作台。
2.2实验方法
2.2.1细胞复苏
方法同1.2.1进行。
2.2.2细胞传代和冻存
方法同1.2.2进行。
2.2.3细胞培养
方法同1.2.3进行。
2.2.4桑葚多糖衍生物S-MFP-30抗肿瘤细胞迁移的能力研究
将对数生长期的肿瘤细胞(400μL中每孔6×105个细胞)接种到24孔板中。当细胞融合度达到约90％时，在每孔中用10μL移液器吸头以直线刮擦。通过用PBS洗涤每个孔两次来除去细胞碎片，向对照组的每个孔中添加400μL无FBS的培养基，将400μL S-MFP-30 溶液添加至实验组。将其在37℃下培养12、24和48小时。使用明美MShot倒置荧光显微镜在0、12、24和48h观察划痕，并捕获相应的图像。通过比较从0h到48h的图像，测量每个划痕闭合的面积，并使用以下公式计算细胞运动性。
Figure RE-GDA0002614733160000101
上述Areaexperiment代表的是实验时间点处划痕面积，Area0h代表的是0h时划痕面积。通过 Image J Plus对每个样品采集的图像进行定量分析。
2.3数据统计分析
使用软件Office 2016、SPSS statistics 21对实验结果进行数据处理，并通过Origin Pro 8.0软件以
Figure RE-GDA0002614733160000111
表示实验结果，使用Student t检验分析了两组之间的差异，P<0.05 即为具有统计学意义。
三、结果与分析
实验采用MTT法对桑葚多糖衍生物S-MFP-30的体外抗肿瘤活性进行初筛。
3.1桑葚多糖衍生物S-MFP-30对MKN-45细胞的抑制活性
3.1.1桑葚多糖衍生物S-MFP-30抑制MKN-45细胞增殖的活性
桑葚多糖衍生物S-MFP-30体外抑制MKN-45细胞增殖活性如图1所示，在2.0mg·mL-1的浓度下，桑葚多糖衍生物S-MFP-30对MKN-45细胞显示出较好的抑制作用，抑制率为91.35±0.49％，P<0.01。
3.1.2桑葚多糖衍生物S-MFP-30抑制MKN-45细胞增殖作用的量效关系
桑葚多糖衍生物S-MFP-30体外抑制MKN-45细胞增殖作用的量效关系如图2所示，随着桑葚多糖衍生物S-MFP-30的浓度不断上升，对MKN-45细胞的抑制效果越加明显。
根据不同浓度桑葚多糖衍生物S-MFP-30对MKN-45细胞的增殖抑制率曲线，可以计算得出S-MFP-30抑制MKN-45细胞的IC50值为486.74μg·mL-1，见表3-1。
综上所述，桑葚多糖衍生物S-MFP-30对于MKN-45细胞具有较好的抑制作用，且抑制作用呈现出一定的量效关系。
表3-1桑葚多糖衍生物S-MFP-30对于各肿瘤细胞的细胞毒性
Figure RE-GDA0002614733160000112
3.1.3桑葚多糖衍生物S-MFP-30抑制MKN-45细胞增殖作用的时效关系
通过对桑葚多糖衍生物S-MFP-30抑制MKN-45细胞的时效关系进行研究，实验结果表明，桑葚多糖衍生物S-MFP-30对MKN-45细胞抑制作用随着时间的延长逐渐增强，结果如表3-2 所示，桑葚多糖衍生物S-MFP-30对于MKN-45细胞的抑制活性在48h后增长至70％左右。
表3-2桑葚多糖衍生物S-MFP-30对MKN-45细胞抑制率的时间效应(mean±S.D.(％)，n＝5)
Figure RE-GDA0002614733160000113
注：*：各组之间P<0.01。
综上所述，桑葚多糖衍生物S-MFP-30对于MKN-45细胞增殖具有较好的抑制作用，且抑制作用呈现出一定的时效关系。
现代医学研究表明，多种多糖对于MKN-45细胞具有较好的抑制增殖的作用。例如：S-PCS3-Ⅱ是一种从茯苓新鲜菌核中分离得到的(1→3)-β-D-glucan的硫酸化产物，研究表明，S-PCS3-Ⅱ对于MKN-45具有一定的抑制作用，在5g·L-1的浓度时对于MKN-45的抑制率为48.9％。有研究者对绿藻(Ulva fasciata)、红藻(Gloiopeltis furcataand)以及棕藻(Sargassum henslouianum)中分离得到的多糖进行硫酸化得到UFP、GFP和SFP进行研究，研究结果表明，三种硫酸化多糖在1.00mg·mL-1的浓度下对于MKN-45细胞的抑制率仍低于50％。此外，不断增加岩藻依聚糖(一种主要成分为硫酸岩藻糖的高分子多糖)的浓度，并未影响到MKN-45细胞的凋亡速度，即使在20mg·mL-1的高浓度下，该多糖对于MKN-45细胞的抑制率仍低于30％。与上述研究结果相比，桑葚多糖衍生物S-MFP-30以同等或更低的浓度对MKN-45细胞的抑制率更高(大于70％)，展示出了极好的抑制增殖作用。
3.1.4桑葚多糖衍生物S-MFP-30抑制MKN-45细胞迁移能力的时效关系
细胞划痕实验结果如表3-3所示，桑葚多糖衍生物S-MFP-30处理MKN-45细胞12、24h 后，其迁移率高于空白组，但时间延长至48h后，迁移率增长至26.72％，相比空白组，迁移率下降了17.99％。细胞不同时间点迁移图像经明美倒置荧光显微镜拍摄可得，具体图像见图 3。
表3-3桑葚多糖衍生物S-MFP-30对MKN-45细胞迁移速率的时间效应(mean±S.D.(％)，n＝5)
Figure RE-GDA0002614733160000121
注：*：在相同的桑葚多糖衍生物S-MFP-30处理下，两个不同时间点的迁移率具有统计学意义(P<0.05)。
3.2桑葚多糖衍生物S-MFP-30对NCI-H1650细胞的抑制活性
3.2.1桑葚多糖衍生物S-MFP-30抑制NCI-H1650细胞增殖的活性
桑葚多糖衍生物S-MFP-30体外抑制NCI-H1650细胞增殖活性如图4所示。使用浓度为 2mg·mL-1的桑葚多糖衍生物S-MFP-30处理NCI-H1650细胞24h，结果显示，S-MFP-30的抑制率为95.06±0.43％(P<0.01)，其对NCI-H1650细胞具有较好的抑制作用。
3.2.2桑葚多糖衍生物S-MFP-30抑制NCI-H1650细胞增殖作用的量效关系
桑葚多糖衍生物S-MFP-30体外对NCI-H1650细胞增殖抑制作用的量效关系如图5所示，随着桑葚多糖衍生物S-MFP-30的浓度不断上升，对NCI-H1650细胞的抑制效果越加明显。
根据不同浓度桑葚多糖衍生物S-MFP-30对NCI-H1650细胞的增殖抑制率曲线，可以计算得出S-MFP-30抑制NCI-H1650细胞的IC50值为310.80μg·mL-1，见表3-1。
结果表明，桑葚多糖衍生物S-MFP-30对于NCI-H1650细胞的体外抗肿瘤活性呈现出明显的量效关系。
3.2.3桑葚多糖衍生物S-MFP-30抑制NCI-H1650细胞增殖作用的时效关系
采用表1-4中相应浓度的桑葚多糖衍生物S-MFP-30处理NCI-H1650细胞12、24、48h，并使用MTT法测得S-MFP-30对NCI-H1650细胞的抑制率。结果表明，随着处理时间的延长， S-MFP-30的抑制作用会有显著的增强，表明S-MFP-30抑制NCI-H1650细胞增殖的活性具有一定的时间依赖性，实验结果如表3-4所示。
表3-4桑葚多糖衍生物S-MFP-30对NCI-H1650细胞抑制率的时间效应(mean±S.D.(％)，n＝5)
Figure RE-GDA0002614733160000131
注：*：各组之间P<0.01。
综上所述，桑葚多糖衍生物S-MFP-30对于NCI-H1650细胞增殖具有较好的抑制作用，且抑制作用呈现显著的时效关系。
目前对NCI-H1650细胞的研究主要是在小分子化合物的抑制活性上，很少有多糖抑制 NCI-H1650细胞活性的相关研究，本发明的研究弥补了这一缺失。一项研究表明，冠状阿里索球菌根茎中的一种马兜铃酸的衍生物被标记为化合物1，这种化合物对于NCI-H1650细胞具有较为明显的抑制作用，使用该化合物对NCI-H1650细胞处理24h后，其对应的IC50值为 0.75μM。藤黄属植物中的33-羟基异戊二酸和35-羟基异戊二酸对NCI-H1650细胞的IC50值小于1μM。有研究人员对桑树中提取的五种黄酮类物质(其中一种新分离纯化的黄酮类化合物：notabilisins K以及四种已知的黄酮类化合物：mulberry,mulberry furan A,neocyclomorusin and mornigrol F)体外抗NCI-H1650细胞活性进行研究，结果显示，其中的桑辛素的IC50值为0.74μmol·L-1。从实验结果上看，小分子化合物确实具有更好的抑制活性，但是，桑葚多糖的提取、纯化结果更为简单有效，因此，S-MFP-30对于NCI-H1650 细胞的抑制活性有深入研究价值。
3.2.4桑葚多糖衍生物S-MFP-30抑制NCI-H1650细胞迁移能力的时效关系
细胞划痕实验结果如表3-5所示，桑葚多糖衍生物S-MFP-30处理NCI-H1650细胞48h 后，其迁移率为32.9±0.95％，与空白组(64.26±2.1％)相比下降了48.80％，有显著抑制 NCI-H1650细胞迁移能力，相应的细胞迁移图像如图6所示。
表3-5桑葚多糖衍生物S-MFP-30对NCI-H1650细胞迁移速率的时间效应(mean±S.D.(％)，n＝5)
Figure RE-GDA0002614733160000141
注：*：在相同的桑葚多糖衍生物S-MFP-30处理下，两个不同时间点的迁移率具有统计学意义(P<0.05)。
3.3桑葚多糖衍生物S-MFP-30对MCF-7细胞的抑制活性
3.3.1桑葚多糖衍生物S-MFP-30抑制MCF-7细胞增殖的活性
桑葚多糖衍生物S-MFP-30体外抑制MCF-7细胞增殖活性如图7所示，MTT法检测结果显示，浓度为2mg·mL-1的S-MFP-30对MCF-7细胞的抑制率为99.95±0.03％(P<0.01)，其对 MCF-7细胞显示出了强大的抑制细胞增殖的能力。
3.3.2桑葚多糖衍生物S-MFP-30抑制MCF-7细胞增殖作用的量效关系
桑葚多糖衍生物S-MFP-30体外对MCF-7细胞增殖抑制作用的量效关系如图8所示，随着桑葚多糖衍生物S-MFP-30的浓度不断上升，对MCF-7细胞的抑制作用显著增强。
根据不同浓度桑葚多糖衍生物S-MFP-30对MCF-7细胞的增殖抑制率曲线，可以计算得出 S-MFP-30抑制MCF-7细胞的IC50值为398.21μg·mL-1，见表3-1。
上述结果表明，桑葚多糖衍生物S-MFP-30具有较好的抑制MCF-7细胞增殖的作用，且其作用效果呈现出显著的量效关系。
3.3.3桑葚多糖衍生物S-MFP-30抑制MCF-7细胞增殖作用的时效关系
时效关系实验结果表明，桑葚多糖衍生物S-MFP-30对MCF-7细胞的抑制作用随着时间的延长而增强，表明S-MFP-30抑制MCF-7细胞增殖作用呈现明显的时间依赖性，结果如表 3-6所示。
表3-6桑葚多糖衍生物S-MFP-30对MCF-7细胞抑制率的时间效应(mean±S.D.(％)，n＝5)
Figure RE-GDA0002614733160000142
注：*：各组之间P<0.01。
综上所述，桑葚多糖衍生物S-MFP-30对于MCF-7细胞增殖具有较好的抑制作用，且抑制作用呈现显著的时效关系。
现代医学研究表明，许多植物多糖对于MCF-7细胞系具有较好的抑制作用。一项研究表明，一种硫酸化的黄金巨藻多糖具有较好的抑制MCF-7细胞活性的作用，MTT实验结果显示，使用硫酸化的黄金巨藻多糖作用24h后的IC50值为8.32mg·mL-1，此结果比S-MFP-30抗 MCF-7细胞活性的IC50值要高。此外，一种辣椒多糖作用48h后的IC50值为0.71mg·mL-1。还有研究者对于柑橘果胶和苹果果胶抗MCF-7细胞活性进行研究，其中柑橘果胶48h IC50值为>500μg·mL-1，而其72h IC50值则无法进行测量；苹果果胶对于MCF-7细胞的48h IC50值为>210.2μg·mL-1，而其72h IC50值则>500μg·mL-1。对比上面这些研究，桑葚多糖衍生物 S-MFP-30具有更低的IC50值和更好的效率。综上所述，桑葚多糖衍生物S-MFP-30对于MCF-7 细胞抑制作用较好，有深入研究价值。
3.3.4桑葚多糖衍生物S-MFP-30抑制MCF-7细胞迁移能力的时效关系
细胞划痕实验结果如表3-7所示，桑葚多糖衍生物S-MFP-30具有较强的抑制MCF-7细胞迁移能力的作用，当处理MCF-7细胞时长延长至48h时，迁移率增长至4.82±0.22％，对比空白组(28.89±0.4％)下降了83.32％，相应的细胞迁移图像如图9所示。
表3-7桑葚多糖衍生物S-MFP-30对MCF-7细胞迁移速率的时间效应(mean±S.D.(％)，n＝5)
Figure RE-GDA0002614733160000151
注：*：在相同的桑葚多糖衍生物S-MFP-30处理下，两个不同时间点的迁移率具有统计学意义(P<0.05)。
3.4桑葚多糖衍生物S-MFP-30对OVCAR-3细胞的抑制活性
3.4.1桑葚多糖衍生物S-MFP-30抑制OVCAR-3细胞增殖的活性
MTT法实验结果显示，浓度为2mg·mL-1的桑葚多糖衍生物S-MFP-30对OVCAR-3细胞的抑制率为95.78±0.64％(P<0.01)，其对OVCAR-3细胞显示出了良好的抑制细胞增殖的能力。 S-MFP-30体外抑制OVCAR-3细胞增殖活性如图10所示。
3.4.2桑葚多糖衍生物S-MFP-30抑制OVCAR-3细胞增殖作用的量效关系
桑葚多糖衍生物S-MFP-30体外对OVCAR-3细胞增殖抑制作用的量效关系如图11所示，随着桑葚多糖衍生物S-MFP-30的浓度不断上升，对OVCAR-3细胞的抑制效果越加明显。
根据不同浓度桑葚多糖衍生物S-MFP-30对OVCAR-3细胞的增殖抑制率曲线，可以计算得出S-MFP-30抑制OVCAR-3细胞的IC50值为1124.58μg·mL-1，见表3-1。
上述结果表明，桑葚多糖衍生物S-MFP-30具有较好的抑制OVCAR-3细胞增殖的作用，且其作用效果呈现出显著的量效关系。
3.4.3桑葚多糖衍生物S-MFP-30抑制OVCAR-3细胞增殖作用的时效关系
时效关系实验结果表明，桑葚多糖衍生物S-MFP-30对OVCAR-3细胞抑制作用有显著的时间依赖性，随着作用时间不断增加，对细胞的抑制作用有显著的提升，结果如表3-8所示。
表3-8桑葚多糖衍生物S-MFP-30对OVCAR-3细胞抑制率的时间效应(mean±S.D.(％)，n＝5)
Figure RE-GDA0002614733160000161
注：*：各组之间P<0.01。
综上所述，桑葚多糖衍生物S-MFP-30对于OVCAR-3细胞增殖具有较好的抑制作用，且抑制作用呈现显著的时效关系。
根据国内外相关研究结果，部分植物多糖对OVCAR-3细胞具有较好的抑制细胞增殖作用。国外研究者提取分离出清半夏中的两种多糖TPN-II、TPA-II，其对OVCAR-3细胞并无明显的体外抑制活性。Zhang等研究了Polygala tenuifolia多糖(PTP)48h对多种癌细胞的体外抑制活性，结果显示，PTP对于OVCAR-3细胞具有较好的抑制其增殖作用，在PTP浓度为2mg·mL-1时的抑制率为76.11％，与桑葚多糖衍生物S-MFP-30的抑制活性相当，但其作用时间较长。国内有学者发现，四组分黄秋葵多糖(粗多糖、E1、E2、E3)中的粗多糖以及E1 组分对于OVCAR-3细胞具有一定的抑制作用，其中粗多糖、E1组分可以分别降低OVCAR-3细胞的活性至72.30％和52.31％。与上述研究结果对比，桑葚多糖衍生物S-MFP-30对于 OVCAR-3细胞的抑制活性更好，而且作用时间更短。
3.4.4桑葚多糖衍生物S-MFP-30抑制OVCAR-3细胞迁移能力的时效关系
细胞划痕实验结果如表3-9所示，S-MFP-30具有较强的抑制OVCAR-3细胞迁移能力的作用，当处理OVCAR-3细胞时长延长至48h时，对于OVCAR-3细胞的迁移率增长至12.75±1.05％，对比空白组(31.65±0.75％)下降了59.72％，相应的细胞迁移图像如图12所示。
表3-9桑葚多糖衍生物S-MFP-30对OVCAR-3细胞迁移速率的时间效应(mean±S.D.(％)，n＝5)
Figure RE-GDA0002614733160000162
注：*：在相同的桑葚多糖衍生物S-MFP-30处理下，两个不同时间点的迁移率具有统计学意义(P<0.05)。
3.5桑葚多糖衍生物S-MFP-30对HepG-2细胞的抑制活性
3.5.1桑葚多糖衍生物S-MFP-30抑制HepG-2细胞增殖的活性
MTT法实验结果显示，浓度为2mg·mL-1的桑葚多糖衍生物S-MFP-30对HepG-2细胞具有极好的抑制作用，其对HepG-2细胞的抑制率最高，抑制率为90.32±1.23％(P<0.01)。S-MFP-30体外抑制HepG-2细胞增殖活性如图13所示。
3.5.2桑葚多糖衍生物S-MFP-30抑制HepG-2细胞增殖作用的量效关系
桑葚多糖衍生物S-MFP-30体外对HepG-2细胞增殖抑制作用的量效关系如图14所示，随着桑葚多糖衍生物S-MFP-30的浓度不断上升，对于HepG-2细胞的抑制作用也不断加强。
根据不同浓度桑葚多糖衍生物S-MFP-30对HepG-2细胞的增殖抑制率曲线，可以计算得出S-MFP-30抑制HepG-2细胞的IC50值为171.88μg·mL-1，见表3-1。
结果表明，桑葚多糖衍生物S-MFP-30对于HepG-2细胞的抑制作用呈现出明显的量效关系。
3.5.3桑葚多糖衍生物S-MFP-30抑制HepG-2细胞增殖作用的时效关系
桑葚多糖衍生物S-MFP-30对HepG-2细胞的时效关系实验结果表明，其对HepG-2细胞抑制作用具有一定的时间依赖性，时间延长至48h后，S-MFP-30对于HepG-2细胞抑制率上升至58.88％，表现出一定的时间依赖性，结果如表3-10所示。
表3-10桑葚多糖衍生物S-MFP-30对HepG-2细胞抑制率的时间效应(mean±S.D.(％)，n＝5)
Figure RE-GDA0002614733160000171
注：*：各组之间P<0.01。
国内外对于HepG-2细胞的相关研究较多，对于多糖抑制HepG-2细胞增殖的研究也有较为广泛的涉及，事实表明，多种植物多糖均有较好的抑制HepG-2细胞增殖的活性。有中国的研究者表明，鸡腿菇子实体粗多糖对于HepG-2细胞具有较好的抑制作用，当鸡腿菇子实体粗多糖的浓度为400μg·mL-1时，HepG-2细胞的存活率为79.27±0.50％。李龙昱等使用MTT法对唐古特大黄多糖对不同癌细胞的抑制作用进行了研究，结果表明，作用时间为72h、浓度为500μg·mL-1时唐古特大黄多糖对于HepG-2细胞的抑制率为88.23±2.12％。张爱龙等研究了不同浓度的金针菇多糖对于HepG-2细胞增殖作用以及凋亡作用的影响，结果显示，当金针菇多糖浓度升高为500μg·mL-1和1000μg·mL-1，连续处理48h时，细胞增殖抑制率达到47.2％以及57.1％。对比上述植物多糖对于HepG-2细胞的抑制活性，S-MFP-30对于HepG-2细胞表现出了极佳的抑制活性，抑制率为90.32±1.23％(P<0.01)，有进一步研究价值。
3.5.4桑葚多糖衍生物S-MFP-30抑制HepG-2细胞迁移能力的时效关系
细胞划痕实验结果如表3-11所示，S-MFP-30具有极好的抑制HepG-2细胞迁移的活性，当S-MFP-30处理HepG-2细胞时长延长至48h时，HepG-2细胞的迁移率增长至13.15±0.54％，对比空白组(33.23±0.52％)下降了60.43％，相应的细胞迁移图像如图15所示。
表3-11桑葚多糖衍生物S-MFP-30对HepG-2细胞迁移速率的时间效应(mean±S.D.(％)，n＝5)
Figure RE-GDA0002614733160000172
Figure RE-GDA0002614733160000181
注：*：在相同的桑葚多糖衍生物S-MFP-30处理下，两个不同时间点的迁移率具有统计学意义(P<0.05)。
本发明提供了桑葚多糖衍生物S-MFP-30在制备抗胃癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌及肝癌的药物中的应用。通过MTT法和细胞划痕实验对S-MFP-30抑制各肿瘤细胞活性进行了研究，实验结果显示S-MFP-30对MKN-45、NCI-H1650、MCF-7、OVCAR-3、HepG-2细胞均表现出了较好的抑制作用，不仅呈现出量效关系和时间依赖性，而且还有抑制肿瘤细胞迁移的作用，为以桑葚多糖衍生物为原料制备抗癌药物的应用提供了重要的科学依据，也为桑葚作为抗肿瘤药物的新应用及其深度开发与利用提供了数据支撑和理论依据。

Claims (3)

1.桑葚多糖衍生物S-MFP-30在制备抗胃癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌及肝癌的药物中的应用；所述桑葚多糖衍生物S-MFP-30是桑葚多糖MFP-30-1的硫酸化衍生物，其硫酸化取代度为0.39％；MFP-30-1的单糖组成为甘露糖6.46％-7.14％、鼠李糖7.03％-7.77％、葡萄糖34.77％-38.43％和木糖46.74％-51.66％；所述桑葚多糖衍生物S-MFP-30的制备方法如下：将桑葚粉碎，依次用索氏提取法进行脱脂，用热水浸提法提取桑葚多糖，用Sevag法脱蛋白，再以低浓度乙醇分级沉淀法分离得不同组分桑葚粗多糖，然后采用DEAE-52纤维素柱层析对乙醇分级沉淀时乙醇浓度为30％的桑葚粗多糖MFP-30进行纯化并除掉其中色素，用蒸馏水洗脱得到的即桑葚多糖MFP-30-1；采用浓硫酸法修饰MFP-30-1，即得S-MFP-30。
2.根据权利要求1所述桑葚多糖衍生物S-MFP-30的应用，其特征在于，所述桑葚多糖衍生物S-MFP-30的制备方法具体包括以下步骤：
(1)桑葚粉碎、脱脂：称取桑葚样品，粉碎成粉末，按料液比1∶2加入石油醚，用索氏提取法对其进行脱脂处理，每次2h，脱脂3次，脱脂后滤掉废液，得脱脂桑葚；
(2)桑葚多糖的提取：采用热水浸提法，将脱脂桑葚置于洁净容器中，按料液比1∶3加入蒸馏水，于90℃恒温条件下进行热水浸提，2h后用纱布过滤，保存滤液，滤渣继续在相同条件下进行热水浸提，反复3次并合并滤液，将滤液离心去除小颗粒杂质，收集上清液，在60℃条件下用旋转蒸发仪对其进行浓缩，即得桑葚多糖提取物，备用；
(3)桑葚多糖提取物脱蛋白：采用Sevag法，将桑葚多糖提取物置于分液漏斗中，按体积比1∶2加入V三氯甲烷∶V正丁醇＝4∶1的Sevag试剂，充分摇匀，静置，直至分液漏斗中的液体分层完毕后除去底层有机溶剂及中间层蛋白质，收集上层液，反复操作，直至分液漏斗中的溶液无明显絮状物沉淀析出为止，将收集的上层液离心除去蛋白质，收集上清液，备用；
(4)桑葚粗多糖的制备：采用低浓度乙醇分级沉淀的方法，向步骤(3)所得上清液中加入无水乙醇至乙醇浓度为30％，将其静置于4℃环境中24h，然后离心，收集上清液并获取沉淀，依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤沉淀3次，真空冷冻干燥，即得桑葚粗多糖MFP-30；
(5)桑葚多糖的纯化：采用DEAE-52纤维素柱层析对MFP-30进行纯化并除掉其中色素，具体为：准确称取MFP-30，加入蒸馏水搅拌溶解，配制浓度为6mg·mL-1的MFP-30溶液，将20mL 6mg·mL-1的MFP-30溶液用300mL蒸馏水经DEAE-52纤维素柱进行分段洗脱，每段每管各收集10mL洗脱液，收集30管，采用苯酚-硫酸法对每段洗脱液进行紫外跟踪测定，直至无多糖为止，按照吸收峰情况合并组分，浓缩，透析，真空冷冻干燥，即得桑葚多糖MFP-30-1；
(6)硫酸化修饰：向锥形瓶中依次加入12mL浓硫酸、3mL正丁醇和0.50g硫酸铵，充分搅拌，冰浴至0℃后，加入500mg桑葚多糖MFP-30-1，反应4h，反应完成后用5mol·L-1NaOH中和PH至8，再用自来水透析2d，用蒸馏水透析1d，减压浓缩，再加入3倍95％乙醇于4℃环境下醇沉，离心，取沉淀，真空冷冻干燥后，即得硫酸化桑葚多糖S-MFP-30。
3.根据权利要求1所述桑葚多糖衍生物S-MFP-30的应用，其特征在于：所述胃癌为MKN-45细胞相关的胃癌；所述非小细胞肺癌为NCI-H1650细胞相关的肺癌和细支气管肺泡癌；所述乳腺癌为MCF-7细胞相关的乳腺癌；所述卵巢癌为OVCAR-3细胞相关的卵巢癌；所述肝癌为HepG-2细胞相关的肝细胞癌。
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CN115894728B (zh) * 2022-10-11 2024-04-30 贵州师范大学 一种米邦塔仙人掌多糖map-2和制备方法及其应用

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CN104211828B (zh) * 2014-09-17 2016-08-24 上海交通大学 一种桑椹抗氧化多糖及其制备方法
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