CN113717296B

CN113717296B - 一种杜仲酸性多糖、提取方法及其在制备抗结肠癌药物中的应用

Info

Publication number: CN113717296B
Application number: CN202111145828.2A
Authority: CN
Inventors: 孙成新; 陈跃玲; 杜兴杰; 黄雪艳; 陈娇; 杨德志; 肖世基; 董敏健; 张涛; 杨建文; 丁侃
Original assignee: Zunyi Medical University
Current assignee: Zunyi Medical University
Priority date: 2021-09-28
Filing date: 2021-09-28
Publication date: 2022-07-22
Anticipated expiration: 2041-09-28
Also published as: CN113717296A

Abstract

本申请公开了中药材的分离提取制备领域中的一种杜仲酸性多糖，其主要由甘露糖、葡萄糖醛酸、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖组成，其摩尔比为13.45：1.05：4.21：67.4：9.72：4.17；还公开了杜仲酸性糖EUP‑A2‑3的提取方法，主要通过DEAE‑cellulose和SepharoseCL‑6B层析制备得到。研究发现，杜仲酸性多糖EUP‑A2‑3通过调控细胞周期阻滞起到抑制结肠癌细胞细胞活力的功效。

Description

一种杜仲酸性多糖、提取方法及其在制备抗结肠癌药物中的应用

技术领域

本发明涉及中药材的分离提取制备领域，具体涉及一种杜仲酸性多糖、提取方法及其在制备抗结肠癌药物中的应用。

背景技术

在现代快速的生产生活方式中，人们的不良生活习惯、日益严峻的环境污染、慢性刺激与创伤和免疫、遗传、内分泌等内、外源性因素是肿瘤的主要诱因。全球常见的恶性肿瘤有肝癌、胃癌等，其危害大、死亡率高。

目前，综合化学疗法、放射线治疗、手术治疗以及一些其他方法是恶性肿瘤的主要治疗手段，但这些传统的治疗方法因其特异性较低、易致机体产生耐药性，对机体会造成较大的不良反应。因此安全、高效且毒副作用小的抗肿瘤药物的需求仍很迫切，植物多糖因具有较强的抗肿瘤生物活性，对多种肿瘤细胞均有较好的抑制作用，且对正常细胞几乎没有毒副作用，因此成为了一种潜在的新型抗肿瘤药物资源。

杜仲科植物杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)的干燥树皮即为杜仲(Eucommiaecortex)。杜仲的主要功效为强筋骨、补肝肾、安胎等，可用于筋骨无力、腰痛肾虚、妊娠漏血、胎动不安、高血压等疾病的治疗。

文献记载，辛晓明等人以环磷酰胺为阳性对照药，发现对于S-180肉瘤的生长，杜仲总多糖可对其产生抑制作用，证实了杜仲总多糖具有一定的抗肿瘤活性(辛晓明,王大伟,赵娟,王浩,费洪荣,董峰.杜仲总多糖抗肿瘤作用的实验研究[J].医药导报.2009；28(06):719-21.)，但杜仲树皮总多糖由多种多糖级分组成，各多糖级分活性也不尽相同，因此如何找到针对特定肿瘤活性较好的多糖的精细化级分是目前的研究重点。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种对抗结肠癌具有较好活性的杜仲酸性多糖EUP-A2-3。

本发明的目的之一提供一种杜仲酸性多糖EUP-A2-3，所述杜仲酸性多糖EUP-A2-3主要由甘露糖、葡萄糖醛酸、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖组成，其摩尔比为13.45：1.05：4.21：67.4：9.72：4.17。

本发明的目的之二是提供一种杜仲酸性多糖EUP-A2-3的提取方法，包括以下步骤：

S1、取杜仲树皮，加入5～15倍重量的水浸泡过夜；

S2、取浸泡后的杜仲树皮水煮提取2～5次，每次2～5h；

S3、合并多次水煮液后浓缩，用乙醇醇沉，冻干得到杜仲总多糖；

S4、杜仲总多糖经过DEAE-Cellulose层析，依次经过水、0.1mol/L的NaCl、0.3mol/L的NaCl洗脱；

S5、取S4步骤0.3mol/LNaCl的洗脱液，浓缩透析后，冻干得到EUP-A2；

S6、取EUP-A2，经Sepharose CL-6B分子筛凝胶层析，用0.9％的NaCl洗脱，测定信号峰，收集第三个信号峰样品，浓缩透析冻干得到杜仲酸性多糖EUP-A2-3。

其中第三个信号峰样品如图1所示。

进一步，步骤S2杜仲树皮加水煮沸后过滤得水煮液，滤渣加水继续煮沸，煮沸3次，每次3小时。

进一步，步骤S3采用终浓度为80％的乙醇。

进一步，步骤S4依次洗脱3倍柱体积。

本发明得到的杜仲酸性多糖EUP-A2-3级分，在1mg/mL浓度下对肝细胞无毒副作用，同时具有较好的抑制结肠癌细胞细胞活力的生物功效，可以作为治疗结肠癌的潜在药物研发。

附图说明

图1为EUP-A2经Sepharose CL-6B洗脱纯化曲线图；

图2为杜仲酸性多糖EUP-N，EUP-A1，EUP-A2，EUP-A3对HCT-116细胞活力的影响示意图；

图3为杜仲酸性多糖EUP-A2-1，EUP-A2-2，EUP-A2-3对HCT-116细胞活力的影响示意图；

图4为杜仲酸性糖EPU-A2-3调控结肠癌HCT-116细胞周期流式细胞仪测定结果示意图，其中A为空白对照组，B为给药组(EPU-A2-3，1mg/mL)；

图5为杜仲酸性糖EPU-A2-3调控结肠癌HCT-116细胞周期统计结果示意图；

图6为杜仲酸性糖EPU-A2-3对正常肝细胞活力影响结果示意图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式进一步详细说明：

1、一种杜仲酸性多糖的提取方法，包括以下步骤：

1.1杜仲总多糖的提取：

取干燥杜仲树皮(重量为985g)，剪成小段，加入10L超纯水浸泡过夜。第二天，杜仲树皮经水煮提取3h后用纱布过滤。往残渣中加入10L超纯水继续煮提2h，同法重复。提取过滤后，往过滤后的残渣中加入5L超纯水继续提取1h，过滤、合并3次煮提液。经4000rpm离心20min，上清合并，将沉淀弃用。将95％乙醇加入上清中(乙醇终浓度80％)，4℃静置隔夜。

小心倾倒弃去醇沉上清，沉淀4000rpm离心20min，合并后加入适量超纯水溶解。加热挥尽多余的乙醇，静置，待其冷却后分装至塑料杯中，至-80℃冰箱中冷冻成固体。取出进行冷冻干燥。干燥后，合并称重，得到杜仲总多糖(EUP)，32.52g。

1.2杜仲多糖分级制备：

取250g DEAE-纤维素(DEAE-Cellulose)，分多次加入，使其充分溶胀10L蒸馏水中(加入时边加边搅拌)，用纱布过滤，尽可能除去水分。浸泡至0.5M的HCl中1h，纱布过滤，用蒸馏水浸泡清洗，使其成中性，再浸泡至0.5M的NaOH中1h，纱布过滤，用蒸馏水浸泡清洗，使其成中性。其中的气泡经真空泵减压脱气除去，浸泡于蒸馏水中，置于4℃环境中备用。

填料装柱前处理：从4℃冰箱中取出适量填料，经减压脱气处理后即可装柱，采用6X 80cm层析柱，用两倍柱体积的高纯水平衡后即可上样。

取杜仲总多糖EUP，1g，分别经0mol/L、0.1mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L NaCl洗脱，每个洗脱条件洗脱3倍柱体积，水洗级分(0mol/L的NaCl)经浓缩后冻干，得到EUP-N级分(0.332g)，各NaCl洗脱部分，透析后浓缩，冻干，分别得到EUP-A1(0.112g)，EUP-A2(0.08g)，EUP-A3(0.015g)。

1.3杜仲酸性糖EUP-A2-3的纯化制备：

取杜仲酸性多糖EUP-A2级分样品100mg，溶于超纯水中，过Sepharose CL-6B分子筛凝胶(层析柱规格2.6X 80cm)，0.9％的NaCl溶液作为洗脱液，0.3mL/min流速，自动收集器收集洗脱液，10mL/管，硫酸苯酚法测定信号峰。结果如图1所示，EUP-A2经过SepharoseCL-6B分离共计得到3个信号峰(3个多糖级分)，分别为EUP-A2-1，EUP-A2-2，EUP-A2-3。分别将3个级分多糖进行浓缩，透析，冻干。分别得到EUP-A2-1：5mg；EUP-A2-2：45mg，EUP-A2-3：30mg。

2、杜仲酸性糖EUP-A2-3的单糖组成分析：

HPLC条件：流动相组成为乙腈：磷酸缓冲盐＝18.2:81.8。检测器型号：VarianProstar325，检测波长：245nm。色谱柱型号：Thermo ScientificODS-2(c18)Hypersil Dim.(mm)150×4.6；柱温：30℃。进样量：15μL，流速：1mL/min。

样品前处理：

(1)酸水解：称取2mg杜仲酸性多糖EUP-A2-3样品置于棕色小瓶中，使其溶于2mL4M的三氟乙酸(TFA)，加盖密封。在110℃的条件下加热水解4h，取出冷却至室温，使用甲醇减压浓缩，重复操作直至除尽TFA。蒸干后，残渣溶解200μL蒸馏水中。

(2)PMP衍生化：取100μL(1)中的完全酸水解溶液，加入浓度为0.6M的NaOH溶液100μL混匀，再加入200μL现配置的浓度为0.5M的PMP甲醇溶液，密封后涡漩混匀。水浴温度为70℃条件下反应100min后，冷却至室温，用浓度为0.3M的HCl 200μL进行中和，加蒸馏水补足至1mL。再加入1mL三氯甲烷萃取，取出上层水相，多次重复萃取，尽量除尽PMP。涡旋后取15μL上清液进样分析。

(3)取100μL 1mg/mL单糖标准品(Man，Rha，Gal，GalA，Glc，GlcA，Xyl，Ara，Fuc)混合液，按样品PMP衍生同法处理，然后进样分析。

结果显示杜仲酸性糖EUP-A2-3主要由甘露糖、葡萄糖醛酸、鼠李糖，葡萄糖，半乳糖，阿拉伯糖组成，含量比为：13.45：1.05：4.21：67.4：9.72：4.17。

3、杜仲多糖各级分抗结肠癌活性实验

HCT-116结肠癌细胞，细胞密度为3*10³个细胞/mL铺板至96孔板，放入37℃，5％CO₂中培养继续培养过夜，换培养基，加入不同浓度不同级分杜仲多糖，多糖药物处理48小时。然后每孔加入20μL的MTT溶液(5mg/mL)继续培养4h，弃去上清液。最后，每孔加入150μL的DMSO，在490nm波长处检测吸光值。结果如图2所示，杜仲酸性多糖EUP-A2对HCT-116结肠癌细胞的细胞活力具有显著的抑制活性，且呈浓度梯度依赖性；而其他级分，包括EUP-N，EUP-A1，EUP-A3均对HCT-116结肠癌细胞的细胞活力无显著影响。进一步通过Sepharose CL-6B纯化EUP-A2，得到3个纯化的多糖级分EUP-A2-1，EUP-A2-2，EUP-A2-3，实验结果显示，如图3所示，EUP-A2-3对HCT-116结肠癌细胞的细胞活力具有显著的抑制活性，且呈浓度梯度依赖性；而EUP-A2-1，EUP-A2-2均对HCT-116结肠癌细胞的细胞活力无显著影响。以上结果显示杜仲酸性糖EUP-A2-3级分是杜仲多糖的抗结肠癌功能的主要活性成分。

4、杜仲酸性糖EPU-A2-3对结肠癌细胞周期的影响实验

HCT-116结肠癌细胞，细胞密度为3*10⁵个细胞/mL铺板至6孔板，放入37℃，5％CO₂中培养继续培养过夜，换培养基，药物处理组含1mg/mL杜仲酸性糖EPU-A2-3，多糖药物处理48小时。后续步骤按照细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒(碧云天，产品编号:C1052)说明书进行。结果如图4和图5所示，杜仲酸性糖EPU-A2-3在1mg/mL浓度下(图4-B和图5)，可以显著降低HCT-116细胞的G2/M期比例和S期比例，提高G0/G1期比例，阻止细胞有丝分裂的发生。实验数据表明杜仲酸性糖EPU-A2-3通过调控HCT-116细胞周期阻滞，起到了抗HCT-116结肠癌细胞的生物活性。

5、杜仲酸性糖EPU-A2-3对正常肝细胞活力影响实验

L02人正常肝细胞，细胞密度为3*10³个细胞/mL铺板至96孔板，放入37℃，5％CO₂中培养继续培养过夜，换培养基，加入不同浓度杜仲酸性糖EPU-A2-3，多糖药物处理48小时。然后每孔加入20μL的MTT溶液(5mg/mL)继续培养4h，弃去上清液。最后，每孔加入150μL的DMSO，在490nm波长处检测吸光值。结果如图6显示，杜仲酸性糖EPU-A2-3对L02肝细胞的细胞活力在1mg/mL浓度下无影响。

以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

Claims

1.一种杜仲酸性多糖EUP-A2-3，其特征在于：所述杜仲酸性多糖EUP-A2-3主要由甘露糖、葡萄糖醛酸、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖组成，各单糖的摩尔比为13.45：1.05：4.21：67.4：9.72：4.17。

2.根据权利要求1所述的一种杜仲酸性多糖EUP-A2-3的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、取杜仲树皮，加入5～15倍重量的水浸泡过夜；

S2、取浸泡后的杜仲树皮水煮提取2～5次，每次2～5h；

S5、取S4步骤0.3mol/L的NaCl的洗脱液，浓缩透析后，冻干得到EUP-A2；

3.根据权利要求2所述的一种杜仲酸性多糖EUP-A2-3的提取方法，其特征在于：步骤S2杜仲树皮加水煮沸后过滤得水煮液，滤渣加水继续煮沸，煮沸3次，每次3小时。

4.根据权利要求1所述的杜仲酸性多糖EUP-A2-3在制备抗结肠癌药物中的应用。