CN102276754B - 红芪多糖中的硫酸酯葡聚糖及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

红芪多糖中的硫酸酯葡聚糖及其制备方法和应用，涉及一种植物多糖、其制备方法和应用，属于天然药物研究技术领域，其以α-D-(1→4)葡萄糖为主链，每隔4-10个糖残基在O-6位有一个非还原末端的分枝，并且，在主链的O-6位每隔33～43个糖残基有一个硫酸酯基。由提取、纤维素阴离子交换剂DEAE系列柱色谱纯化、凝胶SephadexG系列柱色谱纯化制备而来。其可在抗辐射、抗凝血药物、保健品制备中应用。

Description

红芪多糖中的硫酸酯葡聚糖及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种植物多糖、其制备方法和应用，属于天然药物研究技术领域。

背景技术

红芪为豆科植物多序岩黄芪Hedysarum polybotrys Hand.-Mazz的干燥根。红芪味甘性温为补气中药，具有补气固表、利尿、托毒排脓、敛疮生肌等功效，是有名传统中药，并且在治疗各种疾病方面已有较长的历史。现代各种研究显示红芪多糖具有抗癌、抗衰老、抗氧化、抗肿瘤、降血糖、增强免疫力等功效。

红芪作为甘肃的道地药材，其药理活性方面开展工作较早的是甘肃省中医学院，他们于上世纪80年代就进行了红芪的增强免疫、抗衰老作用和对心脏功能影响的研究。红芪结构研究方面工作相对较少，1996年刘方明从红芪中提取出一种以α-D-(1→4)葡萄糖为主链，并在6-位氧上有短而少量分枝的葡聚糖。而随后的2008年李世刚从红芪中得到一种与之相同结构的葡聚糖。所以，迄今为止，红芪多糖中已阐明的结构主要还是(1→4)葡聚糖，其余类型的多糖较少发现。

发明内容

本发明要解决的技术问题：提供了一种植物的硫酸酯葡聚糖结构，其制备方法及其在抗辐射、抗凝血药物、保健品制备中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

红芪多糖中的硫酸酯葡聚糖，结构单元如下，

，

n=4-10

其以α-D-(1→4)葡萄糖为主链，每隔4-10个糖残基在O-6位有一个非还原末端的分枝，并且，在主链的O-6位每隔33～43个糖残基有一个硫酸酯基。

上述红芪多糖中的硫酸酯葡聚糖的制备方法，步骤如下，

（1）红芪多糖2的提取

红芪药材粉碎后，进行脱脂处理，在40～70℃的水中提取，浓缩提取液；将浓缩液首先用终浓度为10～30%乙醇沉淀，过滤，沉淀为红芪多糖1；上清液用终浓度为35%～65%乙醇沉淀，过滤，沉淀为红芪多糖2；

（2）红芪多糖2的分离纯化

红芪多糖2依次进行除蛋白、脱色素、透析处理，再将处理后的红芪多糖2溶于蒸馏水并离心，滤液进行纤维素阴离子交换剂DEAE系列柱色谱纯化，分别用蒸馏水、NaCl洗脱，流速为0.1～8mL/min，自动部分收集器按每管0.1～8mL收集；以苯酚-硫酸法测吸光度值A490nm示踪，作洗脱曲线，合并主峰部分，透析，冷冻干燥；

将上述 NaCl洗脱所得多糖用凝胶Sephadex G系列柱色谱进一步纯化，用蒸馏水洗脱，流速为0.1～8mL/min，每管收集0.1～8mL，以苯酚-硫酸法测A490nm示踪，作洗脱曲线，合并主峰，冷冻干燥，得到本发明的硫酸酯葡聚糖。

进一步地，所述纤维素阴离子交换剂DEAE系列柱处理为Clˉ型。过凝胶Sephadex G系列柱色谱时，洗脱溶液的PH值保持在5～8。

本发明与现有技术相比，具有如下有优点：

1. 是从红芪中发现一种新的硫酸酯多糖，经阴离子交换柱层析和凝胶柱层析可得到该多糖。因其来源于植物，故其来源广泛，获得途径方便快捷。

2. 本发明的硫酸酯葡聚糖与现有同类产品在分子量、取代度和分子结构上不同。本发明的硫酸酯葡聚糖具有中等分子量和低硫酸酯取代度等分子结构上的不同，该产品可进一步进行合理的硫酸酯化修饰制备出该类产品衍生物。

3.本发明的硫酸酯葡聚糖提取方法简单，科学合理，只需以水做溶剂提取，节能环保，能够得到较高的收率和较纯的产品。

4.本发明的硫酸酯葡聚糖具有抗辐射作用，在临床上具有很高的应用价值。同时，该产品还具有抗凝血作用。这说明本发明的硫酸酯葡聚糖具有很广泛的潜在应用，该硫酸酯葡聚糖具有多种作用，加之来源于天然植物，绿色环保，作用安全可靠。红芪多糖2作为红芪中主要成分，有关该组分调节免疫、抗肿瘤、降血糖的报道较多，但有关抗凝血作用的研究，至今很少有人涉足。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为SHG紫外光谱图；

图2为SHG高效凝胶液相色谱图，a为示差折光检测器；b为紫外检测器；

图3为多糖标准品的标准曲线图；

图4为高效凝胶液相色谱图，1为SHG，其他为Dextran葡聚糖标准品；

图5为SEC-MALLS图(红色代为激光散射信号（90°），绿色为紫外检测信号，蓝色为示差折光检测信号)；

图6为SHG摩尔质量对洗脱时间图；

图7为旋根半径对摩尔质量图；

图8为SHG糖腈乙酸酯气相色谱图。（A）标准单糖（1. 鼠李糖rhamnose; 2. 阿拉伯糖arabinose; 3木糖xylose; 4.葡萄糖glucose; 5. 半乳糖galactose; 6.内标inositol.）（B）SHG；

图9为SHG三甲基硅醚衍生物的气相色谱图，（A）标准单糖的三甲基硅醚衍生物气相色谱图，（B）SHG甲醇解后三甲基硅醚衍生物气相色谱图；

图10为SHG（A）和SHGp（B）的GC-MS总离子流图，(1) 1,5-di-O-acetyl-2,3,4,6-tetra-O-methyl-D-glucitol; (2) 2,3-tri-O-methyl-D-Glucose; (3) 2,3,6-tri-O-methyl-D-Glucose；

图11为SHG部分甲基化糖醇乙酰酯的质谱图，

1为1,5-di-O-acetyl-2,3,4,6-tetra-O-methyl-D-glucitol;

2为2,3-tri-O-methyl-D-Glucose; 3为2,3,6-tri-O-methyl-D-Glucose；

图12 SHG（A）和SHGp（B）的红外光谱图；

图13 SHGp ¹H NMR谱图(600 MHz, D₂O, 25 ℃)；

图14 SHGp ¹³C NMR谱图(150 MHz, D₂O, 25 ℃)；

图15 SHGp的β-COSY谱图；

图16 SHGp的TOCSY谱图；

图17 SHGp的HSQC 谱图；

图18 SHGp的HMBC谱图；

图19 50%红芪多糖对4.0Gy X-射线照射后小鼠外周血白细胞变化的影响；

图20 50%红芪多糖对4.0Gy X-射线照射后小鼠外周血淋巴细胞变化的影响。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

1、硫酸酯葡聚糖的制备

方法Ⅰ：

（1）红芪多糖2的提取

红芪药材粉碎后，用95%乙醇脱脂1h。5倍水量在70℃下提取3次，每次2h。合并两次提取液，浓缩成一定体积。将浓缩液首先用终浓度为10%乙醇沉淀，过滤，沉淀为红芪多糖1（HPS-1）；上清液用终浓度为65%乙醇沉淀，过滤，沉淀为红芪多糖2（HPS-2）。

（2）红芪多糖2的分离纯化                        

将Savag法除蛋白，H₂0₂除色素， 3500截留透析袋透析后的HPS2溶于蒸馏水离心后，进行纤维素阴离子交换剂DEAE系列柱色谱（Clˉ，2.6 × 30cm）纯化。纤维素阴离子交换剂DEAE经0.5mol/L NaOH、0.5mol/L HCl和蒸馏水依次处理至中性，重复处理3次后用蒸馏水洗至中性，抽气装柱，先用蒸馏水平衡，上样，分别用蒸馏水、NaCI梯度洗脱，流速为0.1mL/min，自动部分收集器按每管8mL收集。以苯酚-硫酸法测吸光度值（A 490nm）示踪，作洗脱曲线，合并主峰部分，透析，冷冻干燥。

将上述主峰部分所得多糖用凝胶Sephadex G系列柱色谱（3 × 50cm）进一步纯化，Sephadex G系列葡聚糖凝胶用适量蒸馏水浸泡48h，再100℃溶胀2h后，抽气装柱，用0.1mol/L NaCl溶液平衡48h，上样，用蒸馏水洗脱，流速为0.1mL/min，每管收集8mL，以苯酚-硫酸法示踪，作洗脱曲线，合并主峰，冷冻干燥。

方法Ⅱ：

（1）红芪多糖2的提取

红芪药材粉碎后，用95%乙醇脱脂3h。20倍水量在40℃下提取5次，每次1h。合并两次提取液，浓缩成一定体积。将浓缩液首先用终浓度为30%乙醇沉淀，过滤，沉淀为红芪多糖1（HPS-1）；上清液用终浓度为50%乙醇沉淀，过滤，沉淀为红芪多糖2（HPS-2）。

（2）红芪多糖2的分离纯化                        

将Savag法除蛋白，H₂0₂除色素， 3500截留透析袋透析后的HPS2溶于蒸馏水离心后，进行纤维素阴离子交换剂DEAE系列柱色谱（Clˉ，2.6 × 30cm）纯化。纤维素阴离子交换剂DEAE经0.5mol/L NaOH、0.5mol/L HCl和蒸馏水依次处理至中性，重复处理3次后用蒸馏水洗至中性，抽气装柱，先用蒸馏水平衡，上样，分别用蒸馏水、NaCI梯度洗脱，流速为4mL/min，自动部分收集器按每管4mL收集。以苯酚-硫酸法测吸光度值（A 490nm）示踪，作洗脱曲线，合并主峰部分，透析，冷冻干燥。

将上述主峰部分所得多糖用凝胶Sephadex G系列柱色谱（3 × 50cm）进一步纯化，Sephadex G系列葡聚糖凝胶用适量蒸馏水浸泡48h，再100℃溶胀2h后，抽气装柱，用0.1mol/L NaCl溶液平衡48h，上样，用蒸馏水洗脱，流速为0.45mL/min，每管收集4mL，以苯酚-硫酸法示踪，作洗脱曲线，合并主峰，冷冻干燥。

方法Ⅲ：

（1）红芪多糖2的提取

红芪药材粉碎后，用95%乙醇脱脂2h。12倍水量在55℃下提取3次，每次3h。合并两次提取液，浓缩成一定体积。将浓缩液首先用终浓度为20%乙醇沉淀，过滤，沉淀为红芪多糖1（HPS-1）；上清液用终浓度为35%乙醇沉淀，过滤，沉淀为红芪多糖2（HPS-2）。

（2）红芪多糖2的分离纯化                        

将Savag法除蛋白，H₂0₂除色素， 3500截留透析袋透析后的HPS2溶于蒸馏水离心后，进行纤维素阴离子交换剂DEAE系列柱色谱（Clˉ，2.6 × 30cm）纯化。纤维素阴离子交换剂DEAE经0.5mol/L NaOH、0.5mol/L HCl和蒸馏水依次处理至中性，重复处理3次后用蒸馏水洗至中性，抽气装柱，先用蒸馏水平衡，上样，分别用蒸馏水、NaCI梯度洗脱，流速为8mL/min，自动部分收集器按每管8mL收集。以苯酚-硫酸法测吸光度值（A 490nm）示踪，作洗脱曲线，合并主峰部分，透析，冷冻干燥。

将上述主峰部分所得多糖用凝胶Sephadex G系列柱色谱（3 × 50cm）进一步纯化，Sephadex G系列葡聚糖凝胶用适量蒸馏水浸泡48h，再100℃溶胀2h后，抽气装柱，用0.1mol/L NaCl溶液平衡48h，上样，用蒸馏水洗脱，流速为0.8mL/min，每管收集0.1mL，以苯酚-硫酸法示踪，作洗脱曲线，合并主峰，冷冻干燥。

2、硫酸酯葡聚糖(SHG)的理化鉴定

（1）性状：纯化得到的SHG呈现白色絮状物。

（2）元素分析

对SHG中碳（C），氢（H），氧（O），硫（S），氮（N）进行分析。硫酸酯基（-SO₂ONa，sodium salt）根据硫含量按下列公式计算：硫酸酯含量% = 3.22 × S%。结果为： C（40.11%，in mass）， H（6.65%）， O（52.77%），S（0.47%），N（0.00%）； 结果显示SHG的C，H，O含量分别为40.11%，6.64%和52.77%，含有少量的S。经计算C，H，O的摩尔比为1:2:1，每33-43个糖残基含有一个硫酸基，根据硫酸酯含量计算公式得硫酸基含量为1.28%～1.66% 。

（3）旋光度测定

配制SHG 0.2mL/mg 2mL，以水为空白，测定旋光度，温度为25±1℃。结果为：SHG旋光度为+164.19°（c 0.2, H₂O），旋光度值相对较高与红外的852.6 cm^-1处的特征吸收一致，表明存在α-型糖苷键。

（4）紫外扫描

多糖复合物常用紫外光谱扫描，观察260nm或280nm有无特征吸收峰，以判断是否含有核酸或蛋白质缀合物。配制1mg/mLSHG，以去离子水作空白对照，在190～800nm波长范围内作紫外-可见光谱扫描，观察260nm及280nm吸收峰情况。

结果为：如图1所示，SHG在260～280nm处有吸收，显示可能含有蛋白质或核酸，但元素分析显示不含氮，而含有硫，所以推测该吸收峰为硫酸基；结合硫酸基紫外吸收特点，确认SHG为硫酸酯多糖。

（5）碘-碘化钾反应

向SHG水溶液(1 mg/mL)中加入碘-碘化钾溶液，观察颜色变化。以蒸馏水作阴性对照，淀粉溶液(1 mg/mL)作阳性对照。结果为：碘-碘化钾反应呈阴性，说明不是淀粉或类淀粉结构。

（6）总糖、糖醛酸和蛋白质含量测定

a.总糖测定（苯酚-硫酸法）：

标准溶液制备：精密称取已干燥葡萄糖标准品25mg，置100mL容量瓶中，定容。吸取上述葡萄糖溶液2mL置10mL容量瓶中定容得标准工作液。

用移液枪移取葡萄糖标准工作液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4mL，补加蒸馏水至2mL，再加入5%苯酚1mL及浓硫酸5mL，静置5分钟，充分摇匀后，室温放置20分钟，于490nm处测吸光度。

供试品溶液的配制：精密称取10mg多糖溶于100mL容量瓶中。分别取此多糖溶液0.6mL，0.8mL，1mL，加蒸馏水至2mL，以2mL蒸馏水作为空白，按上述方法测定总糖含量。

结果为：多糖的标准曲线为y=15.591x+0.0004，R²=0.9993，含量为97.19%。

b.糖醛酸含量测定（硫酸-咔唑法）：

糖醛酸标准液：精密称取葡萄糖醛酸12 mg溶于25mL容量瓶中。

准确移取葡萄糖醛酸标准溶液0.0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.6，0.8mL于具塞试管中，加蒸馏水至1mL，置于冰浴中，分别加入6mL浓硫酸，摇匀，85℃水浴中保持20min，取出后冷却至室温，分别加0.2mL 0.1%咔唑液，室温下保持2h，于530nm处测定吸光度。

供试品溶液配制：称取多糖样品10mg溶于10mL容量瓶中。分别取此溶液0.1mL，0.3mL，0.5mL于具塞试管中定容至1mL，按上同法测定糖醛酸含量。

结果为：糖醛酸的标准曲线为y=11.275x+0.772，R²=0.9881，糖醛酸测定结果显阴性。

c.蛋白质含量测定（Bradford法）：

蛋白质标准溶液：精确称取牛血清白蛋白10mg，用少量蒸馏水溶解定容至100mL，即为0.1mg/mL蛋白质标准液，4～5℃冰箱中保存。

蛋白质测定方法：分别精密吸取标准蛋白质溶液0.0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL于10mL具塞试管中，分别加水至1mL，加入考马斯亮蓝G-250溶液5mL，混合均匀后30℃水浴加热5min，于595nm处测定其吸光度。

供试品溶液的制备：精确称取多糖5mg，加蒸馏水溶解定容至25mL，即为0.2 mg/mL供试品溶液，加蒸馏水至1mL，按上述同法测定蛋白质含量。

结果为：蛋白质的标准曲线为y=6.6005x+0.0847，R²=0.9974，测定蛋白质显阴性，与元素分析结果一致。

3、纯度及分子量测定

多糖的纯度和分子量测定采用两种方法，分别为高效凝胶色谱法和空间排阻色谱-多角度激光散射仪联用法。

高效凝胶色谱法（HPGPC）

HPGPC条件：

仪器：美国Waters 高效液相色谱仪，600泵；

检测器：2414示差折光检测器（RI），2998二极管阵列检测器(PDA)；

工作站：Empower；

色谱柱：Ultrahydrogel^TM 1000 and Ultrahydrogel^TM 500 columns, 7.8(ID)×30.0cm(L), 美国Waters公司；

流动相：去离子水；

流速：0.8mL/min；

温度：柱温40℃；检测器35℃；

进样量：20μL；

①回归方程的建立：将Dextran标准品5200，11,600，23,800，48,600，148,000，273,000，410,000，668,000Da用流动相配成浓度为0.5mg/mL 标准溶液，进样，测定保留时间T。以T对lgMw（相对分子质量对数）绘制标准曲线。

②样品分子量测定：将SHG样品用流动相配成浓度为0.5mg/mL的溶液，进样，测定保留时间，代入回归方程计算样品分子量。

空间排阻色谱-多角度激光散射仪联用法

SEC-MALLS分析条件：

HPLC仪器系统：1500 pump HPLC system SSI, USA. 

色谱柱：Shodex OH pak SB-804 and 803(8.0 × 300 mm, Showa Denko k.k, Japan)；

流动相：0.1M NaNO₃和0.02%NaN_；

流速：0.8mL/min；

MALS 检测器： DAWN HELEOS-II 美国Wyatt 公司；

DRI 检测器：Optilab rEX美国Wyatt 公司；

UV 检测器：SSI 500；

温度：柱温 40℃；检测器 35℃；

工作站：ASTRA V 美国Wyatt 公司；

样品溶液的配制：SHG样品溶于0.1mol/mL NaNO₃溶液中，静置过夜溶解，样品溶液和流动相在使用前通过0.2μm滤膜过滤。 

样品测定：取样品溶液200μL，注入液相色谱仪，同时记录MALLS、UV和RI色谱图。经ASTRA数据图形分析软件计算得出重均分子量Mw、分布系数D及其构象。

结果为：

分子量测定采用相对方法--GPC法和绝对方法--SEC-MALLS法。前者根据一系列已知分子量的标准品的标准曲线测得相对分子量；后者根据大分子物质的散射性质测得绝对分子量。

高效凝胶色谱结果见图2，SHG显示单一对称的尖峰，说明SHG为较纯的均一组分。

标准曲线：logMw = s-3.87e-001T+2.72e-003T²，R² = 0.9972，T为保留时间，Mw为重均分子量，见图3。

天然大分子聚合物的化学组成、分子量、分子链构象因其在阐释构效方面十分重要而受到广泛研究，SEC–MALLS作为一种测定高分子化合物绝对分子量和分布的方法，非常方便，而且不需要标准品，并对高分子聚合物灵敏度高。

SHG在0.1 mol/L NaNO₃溶液（40℃）中的SEC-LLS谱图见图5，在激光散射仪、示差折光检测器和紫外检测器检测结果中可见SHG为单一对称的尖峰。图6可见SHG用凝胶色谱柱分离线性关系良好，说明分子量是连续的均一组分，所选色谱柱对样品分离效果较好。分子量和构象经SEC-MALLS测定后，SHG在0.1mol/L的NaNO₃的溶液中的旋根半径、重均分子量、分散度（Mw/Mn，Mn = 88.73 kD，Mw = 172.0 kD）分别为9.0 nm（Rz），3000～1 × 10⁶ Da和1.94。根据所测得分子量推测SHG每条链平均含有950-1150个糖残基。

通过MALLS与SEC联用，我们可以看出该样品的成分较为复杂，3种检测器检测测定的图SHG都有明显的肩峰，激光信号是分子量与浓度共同作用的结果，而dRI和UV都是浓度关系的反应，所以可以看出LS信号与dRI和UV的信号有较大差异；MALLS和RI的色谱峰出峰时间和峰形均有一定的差异，这是因为MALLS是分子量响应型检测器，RI是浓度响应型检测器，当样品中大分子部分被优先洗脱出来的时候，由于浓度较低，RI没有响应，而MALLS对大分子更灵敏，所以响应值高。

图5中激光散射主峰显示很强的LS信号，而RI信号较弱，表明LS中的主峰是含量较低的大分子部分。而LS中肩峰则和RI中的主峰为含量较高的小分子部分。同时，由于SHG含有硫酸酯基，所以与一般常见的多糖不同在254nm有比较强的紫外吸收。

用构象斜率可以描述分子量和旋根半径的关系，不论是分布较宽或是多峰分布的样品，皆可通过测量分子量及分子旋转半径得到分子形状的数据。通常，溶液中分子构象可以通过斜率来判断，斜率是0.3的分子为球形构象，斜率介于0.5和0.6之间，表明分子是具有无规则线团构象的线性聚合物；聚合物斜率大于0.6，表明分子是具有伸展结构；斜率为1.0的分子为棒状结构；U型曲线表明为典型的高支化度结构。

因为静态光散射仪对于Rg的检测下限为10nm，所以我们对谱图中较大的分子量部分进行计算，得到SHG的Conformation Plot的斜率为0.45，在40℃的NaNO₃溶液中的构象为无规则的线性聚合物。如图7。

4、单糖组成分析

糖腈乙酸酯衍生物的制备

SHG水解条件的选择：取SHG7份，每份5mg置于安瓿中，加2mol/L的三氟乙酸（TFA）溶液溶解，充N₂后封口。110℃加热水解1h、3h、5h、7h、10h、11h、12h，然后分别加甲醇数滴，减压蒸干，气相色谱法分析测定，以水解产物中葡萄糖的色谱峰面积和内标物峰面积的比值（A_Glc/A_inos）来考察不同水解时间对红芪多糖水解效果的影响。

乙酰化衍生物的制备：将上述干燥的多糖水解物，加10mg盐酸羟胺和7mg内标（肌醇六乙酸酯），再加0.5mL吡啶，摇匀，90℃反应30min，取出后冷却至室温，加入醋酸酐0.7mL，90℃继续反应30min，进行乙酰化。反应完毕后，加数滴甲醇，减压蒸发除去多余的乙酸酐，直至完全干燥。

将乙酰物加2mL氯仿和2mL蒸馏水，在梨形瓶中振摇萃取分离，用滴定管吸去上层，重复萃取3～5次，旋转蒸干后，放入干燥器干燥。最后加1mL氯仿溶解，过滤后气相色谱分析。

肌醇六乙酸酯（内标）的制备：

称取肌醇6g，加入盐酸羟胺9g、醋酸酐9mL和吡啶6mL，置90℃水浴中加热2h并不断搅拌。反应液冷却至室温，倒入冰水中，使肌醇六乙酸酯析出，过滤，将析出的肌醇六乙酸酯用水30mL分次洗涤，100℃烘干，进样气相色谱。

气相色谱操作条件：

气相色谱仪GC2410（岛津），FID检测器，配备OV-101石英毛细管柱（50m × 0.25mm i.d × 0.33μm 液膜厚度，兰州中科安泰分析仪器科技有限责任公司）；进样口温度：210℃；进样模式：分流；分流比：20.0；进样体积：2uL；载气：氮气；检测器温度：240℃。程序升温：110℃，保持5.0min，以5℃/min升至190℃，保持4.0min，然后以3℃/min升至最终温度 210℃，保持20.0min。

结果为：

为确认单糖组成和最佳水解时间，对多糖进行糖腈乙酸酯气相色谱进行分析。在不同水解时间样品的气相分析中均只出一个葡萄糖峰，只是A_Glc/A_inos比例不同，随着水解时间的增加，该比例也随之增大，当水解为10h时该比例达到最大值，而再增加水解时间则该比例又降低，可能原因为水解完全后再增加水解时间则使葡萄糖破坏，因此选择水解时间为10h。单糖组成气相色谱结果见图8。

三甲基硅醚衍生法

甲醇解和三甲基硅醚衍生化方法，参照相关文献进行。

甲醇解：取多糖样品、单糖标准品、葡萄糖醛酸标准品0.1mg置于13×100mm的试管中，分别加20ug正二十烷作为内标，再加1mol/L盐酸-甲醇2.4mL，80℃烘箱中反应20h，使多糖转化为甲基糖苷和糖醛酸的甲酯化甲基糖苷。甲醇和盐酸通过加入100mL叔丁醇用氮气流在40℃水浴中蒸发除去。

三甲基硅醚衍生物的制备：向吹干后的甲基糖苷和甲酯化甲基糖苷衍生物加入1mL吡啶，0.4mL六甲基二硅氮烷和0.2mL三甲基氯硅烷，80℃加热30min进行甲硅烷基化，硅烷化试剂在室温下缓慢蒸发除去，将衍生物溶于1mL正己烷中，不溶性盐形成沉淀，离心后上清液转移至另一干净的试管中小心蒸干后溶于100uL的正己烷中，取1uL溶液进行气相色谱分析。

气相色谱条件：

GC-2410气相色谱仪（日本SHIMADZU），FID检测器，熔融石英毛细管柱OV-101，程序升温条件如下：初始温度180 ℃，以2℃/min升温至250℃，保持10min。进样口温度：230℃；进样模式：分流；分流比：20.0；进样体积：2uL；载气：氮气；检测器温度：250℃。

定量方法：每种单糖能产生几种衍生物，把每种单糖的主要衍生物的峰面积加和起来用响应因子进行校正，再计算糖残基组成比例。

结果为：由图9可见，各标准品分离良好，不同数目的异构峰与文献报道一致。经与标准品的保留时间和异构峰数比较，表明SHG仅含有葡萄糖，并且不含任何糖醛酸。

5、红芪多糖SHG的结构研究

实验方法

（1）部分酸水解

将100mg SHG置圆底烧瓶中，加入0.1mol/L的TFA 50mL， 100℃水浴水解1h，减压蒸干，加入甲醇蒸干，重复3次，以彻底除去过量的TFA。水解产物溶于H₂O中流水透析2d（Mw=3500），蒸馏水透析1d。透析袋内的多糖浓缩，冷冻干燥，凝胶柱色谱（Sephadex G系列，2.6×50cm）纯化，流速为0.1-8mL/min，部分收集器每0.1-8mL收集一管，浓缩，冷冻干燥得次级多糖SHGp（72.2mg，收率为66.79%），用SEC-MALLS法，测得其分子量、分散度（Mw/Mn）分别为2000～1 × 10⁵ Da，1.89。

（2）甲基化分析

甲基亚磺酰甲基钠（SMSM）的制备：氢化钠4.5g置于100mL三颈烧瓶中，加25mL正己烷，磁力搅拌混悬液，静置氢化钠沉淀，小心除去含有矿物油的正己烷层，磁力搅拌并用氮气快速吹干，得到氢化钠干燥粉末。用分液漏斗向三颈烧瓶中缓慢加入50mL无水二甲亚砜，在50～60℃下超声至不再有气泡从反应物中逸出（约4小时），反应过程烧瓶中充满氮气，得二甲基亚磺酰阴离子（草绿色）置于棕色瓶中，吹氮气后密封，冰箱中冷冻保存。

多糖的甲基化：采用Hakomori法进行四次，将SHG和SHGp各4mg置于5mL带橡皮帽的烧瓶中，加DMSO，超声使其溶解，缓慢加1.5mLSMSM，10min之内加完。混合物置超声波中（20～25℃）超声30min，超声过程中通过注射针头通氮气。超声完成后反应瓶置于室温中避光过夜，在冰浴下缓慢滴加2mL碘甲烷，5min内加完，充氮气后密封，常温超声1h，溶液呈淡黄色澄清液。

甲基化多糖的分离：用氮气驱赶剩余的碘甲烷，加入蒸馏水后再转移至透析袋中在蒸馏水中透析完全，冷冻干燥即得甲基化多糖。以上甲基化过程重复多次直至甲基化完全。

多糖的甲基化完全与否采用红外光谱来确认，在3400cm^-1处的OH伸缩振动消失为甲基化反应完全。

部分甲基化糖醇乙酸酯的制备：分为水解、还原、乙酰化三步。甲基化多糖置密封特氟龙试管中加88%甲酸（2mL）100 ℃水解6h。旋转蒸发除去甲酸后，剩余物加2mol/L三氟醋酸3mL 100℃再水解6h，通过加入3mL甲醇减压共蒸重复数次至三氟醋酸除尽。最终的水解物溶于2mL蒸馏水中，加硼氢化钠25mg，摇匀，密封，室温下放置2小时，使其转化为相应的甲基化糖醇，减压蒸发至干，加3mL甲醇和1滴醋酸使多余的硼氢化钠转化为硼酸盐，减压蒸干溶剂。重复三次以上，最后加入5mL甲醇吹干，重复两次。

甲基化糖醇置于试管中，加2mL醋酸酐，密封，100℃加热1小时，取出，冷却至室温，减压蒸干，加入甲苯40℃共蒸至干，再加入3mL氯仿溶解，用蒸馏水3mL洗涤3次，氯仿层用无水硫酸钠干燥，浓缩至300mL即得部分甲酯化糖醇乙酸酯，气质联用分析。

部分甲基化糖醇乙酸酯的鉴别和定量：部分甲基化糖醇乙酸酯中乙酰化和甲基化位置应用GC-MS来确定。对应的每个部分甲基化糖醇乙酸酯的峰面积除以相应的响应因子，产生的系数以百分数表示。响应因子采用有效碳原子响应方法计算。

气相-质谱联用条件：

气相条件：色谱柱为Rxi-5 ms熔融石英毛细管柱（30m×0.25μm×0.25mm），最高使用温度330℃；柱温：170℃；载气：氦气；进样口温度：250℃；载气流速：1.00mL/min；进样模式：分流；分流比：50.0；进样体积：1uL。程序升温：起始温度为170℃，保持5min，以2℃/min升温至190℃，最后以10℃/min升至250℃保持5min。

质谱条件：离子源温度：200℃；接口温度：250℃；溶剂延迟：4min；阈值：1000；起始时间（min）：4.50；结束时间（min）：29.00； 采集方式：Scan；质谱检测范围（m/z）：45.00～630.00。

结果为：

SHG和SHGp用改良的Hakomori法甲基化反应四次，羟基在3600～3200cm^-1的红外吸收峰消失说明甲基化反应完全。甲基化多糖水解和乙酰化后生成的部分甲基化糖醇乙酸酯衍生物经GC-MS分析，其甲基化单糖衍生物的总离子流图见图10。图11显示SHG和SHGp均存在三种目标成分。

甲基化的糖醇乙酸酯衍生物根据其质谱图（图11）与谱库中标准物的质谱图对比而鉴定。它们的相对摩尔比则根据它们的峰面积比例计算。结合标准图谱对这3个峰依次进行归属，甲基化结果见表1，表明存在2,3,6-tri-O-methyl-D-glucitol (m/z 45, 99, 117, 129, 162, 173, 203, 233, 277)，2,3-di-O-methyl-D-glucitol (m/z 85, 101, 117, 127, 142, 159, 161, 201, 261)，2,3,4,6-tetra-O-methyl-D-glucitol (m/z 45, 101, 117, 129, 145, 161, 205, 249)，它们的比例为7:1:1。SHG和SHGp具有相类似的甲基化结果，说明水解前后的连接方式和基本结构没有变化，主要有三种连接方式→4)-Glcp-(1→，Glcp-(1→，→4,6)-Glcp-(1→组成的葡聚糖。

（3）红外光谱分析

多糖样品SHG和水解后样品SHGp 2 mg，用KBr压片后在4000～400 cm^-1以1 cm^-1分辨率扫描。结果见图12，在3422.76cm^-1处出现一个宽峰，是糖类的O-H伸缩振动，强而宽。使用压片技术得到的红外光谱图在3448cm^-1和1639cm^-1附近常常出现由于含水引起的谱带，SHG和SHGp在1638.97cm^-1处是含水引起吸收峰，非水化物则无此吸收。SHG和SHGp在2926.42cm^-1处吸收峰为C-H伸缩振动，弱到中等强，在1740 cm^-1附近没有吸收峰说明不存在糖醛酸，与前述结果一致。

根据红外光谱图是否具有800-860cm^-1处糖环C-O-S伸缩振动的特征吸收峰以及1240cm^-1附近-O-SO₃的S=O伸缩振动吸收峰，即可定性判断糖残基是否有硫酸基团及硫酸基团的取代位置 (800-950cm^-1)。

SHG和SHGp在1241.80cm^-1, 1369.98cm^-1,580.36cm^-1的吸收峰为O-S-O对称吸收与非对称吸收是硫酸酯基的特征；在1241cm^-1处弱的吸收峰，为硫酸酯基的S=O伸缩振动，该峰吸收较弱，说明所含硫酸酯的量不多。

SHG和SHGp在852.65cm^-1处的吸收峰，为端基α型连接的C-H变角振动，在931.16和762.82cm^-1处的吸收峰为吡喃的D-Glc基本信号，红外光谱数据结合较高的旋光度值，表明SHG为α-D-连接方式；1025.23，1082.57和1154.86cm^-1的吸收峰表明糖残基为吡喃型。1417.65和1369.98cm^-1处两个峰，为-CH₃不对称变形振动和对称变形振动。综合分析，SHG为以α-D-(1→4)-葡萄糖为主链在6位具有末端分支的多糖。

（4）核磁共振波谱分析

¹H和¹³C NMR谱于25℃下在Bruker DRX-600核磁共振光谱仪上记录，观测频率分别为600 MHz和150 MHz。HOD峰作为氢谱内标，δ_HOD=4.62ppm。而碳谱的化学位移以TTS（四甲基硅烷）为外标表示。β-COSY谱，F1×F2 = 1280×1280，弛豫延迟为1.2s，数据采集时间为0.214s，SW为1199Hz；HSQC谱，F1×F2 = 2048×4096，弛豫延迟为1.0s，采样时间为0.202s，脉冲混合时间0.08s，SW为5073.2Hz和25641.0Hz；TOCSY谱，F1×F2 = 4096×4096，弛豫延迟为1.5 s，脉冲混合时间为0.08s，采样时间为0.214s，SW 为5073.2Hz；HMBC谱，F1×F2 = 2048×4096，弛豫延迟为1.0s，采样时间为0.202s，累加次数为64，SW 为5073.2Hz和36199.1Hz。

由于SHG的分子量较大，因此将其部分酸水解后（SHGp）进行NMR分析。精密称取干燥的SHGp37.4mg，溶于0.7mL重水中，冷冻干燥，如此重复重水交换三次，再溶于0.7mL重水后，离心（6000rmp，10min），取上清进行NMR分析。

结果如图13、14所示，各峰分离较好和尖峰说明样品纯度高。在¹³C谱低场区（160～180ppm），没有观察到羰基碳的特征信号，进一步证明了SHG不存在糖醛酸。

SHGp的600MHz ¹H NMR谱中，见图13，在端基区域（4.8～5.5ppm）的5.26，5.21（d）和4.83ppm处有三个异头质子信号，按照它们化学位移降低的顺序分别命名为A（→4)-α-D-Glcp-(1→），B（→4,6)-α-D-Glcp-(1→），C（α-D-Glcp-(1→）。由于异头质子化学位移均大于5ppm，所以SHG中糖残基的连接方式为α-型，与红外光谱中852.65cm^-1的结果一致；根据积分面积的比例，这三种连接方式（A:B:C）的比例约为7:1:1，这与甲基化结果吻合，也证明甲基化结果的准确性。150MHz ¹³C NMR谱（图14）：δ 102.14（A），δ 101.11（B），δ 98.29（C）ppm为三个异头碳的信号，峰高比约为7:1:1，化学位移均小于103ppm，进一步确认为α-型连接。

A在δ 5.26ppm处的异头质子信号指出它为α-连接方式。其C-4的化学位移相对于标准甲基糖苷的化学位移向低场位移说明是一个4位取代的糖残基。102.14ppm处的端基碳的信号和δ 79.27ppm处C-4取代信号证明A 是在SHG主链中占主要的α-D-(1→4)葡萄糖。

B在δ 5.21ppm处异头质子峰同样说明它为α-连接方式。峰的裂分可能表明该连接方式存在两种情况，在O-6分支处可能为非还原末端和（或）硫酸酯基；B的异头碳信号在101.11ppm处，C-4（78.70ppm）和C-6（71.84ppm）信号相对于标准甲基糖苷的化学位移向低场位移是由于糖基化取代的影响^[60]。因此，B为α-D-(1→4,6)葡萄糖。

C在δ 4.83ppm处的异头质子信号也说明其端基构型为α-型，端基碳信号根据文献数据可确定为98.29ppm，再结合甲基化结果可推断C为非还原末端α-D-葡萄糖。

¹H和¹³C的信号可采用DQF-COSY，TOCSY，NOESY和HSQC进行归属。而在SHGp中，虽然甲基化分析存在残基B和C，但是在2D NMR谱中没有出现明显的偶合信号，其原因可能为残基B和C的含量相对于A太少，并且其它质子(H2–H5)之间的峰叠加严重。

通过β-COSY，TOCSY归属出A的所有质子（图15、16）。图15所示，可找出AH1/H2，H2/H3，H3/H4交叉峰，而其余的部分由于谱峰重叠很难辨认，故我们通过COSY可归属出AH2、H3、H4。在图16中，可以观察到AH1/H2，H1/H3，H1/H4，而H1/H5，H1/H6可能因为信号较弱未能出现相关峰。对于整个自旋体系体系而言，混合时间越长，磁化矢量传递越远，但长混合时间的缺点是导致分辨率降低和信号丢失，本实验未出现某些信号原因可能采用80ms混合时间较短，未能传递到H5，H6。但我们可以通过H2/H6，H2/H5归属出AH5、H6。至此，A的所有氢核得到归属。

HSQC谱提供碳氢一键的相关信号（图17）。根据A的质子从HSQC归属出A碳原子的化学位移。δ 102.14/5.26为(1→4)-α-D-葡萄糖的端基碳和质子（C-1/H-1）的交叉峰，A的C-6与两个质子有交叉峰，即δ 62.94/3.68，62.94/3.68，残基A其余碳原子与相应的质子有交叉峰。根据HSQC观测到的交叉峰，A的C-2，C-3，C-4，C-5对应于的化学位移为δ 74.04，75.86，79.27，73.68，62.94 ppm，所以残基A的碳氢得到全归属，而B和C的碳原子通过与文献数据比较，也得到归属。见表2。

 

HMBC把¹H核与长程耦合的¹³C核关联起来，可进行孤立质子自旋体系间的相关性研究，也就是通过诸如O，S，N和季碳这样的“绝缘”原子进行桥接，它能提供分子骨架的结构信息，可检测到糖残基异头质子和端基碳的交叉峰，包括糖残基之间和糖残基内部的相关。对于多糖，HMBC 可作为一种序列分析的工具给出糖单元间的连接次序。SHG中糖残基的连接顺序通过HMBC谱糖残基之间的相关确定（图18）。检测到交叉峰（AH-1, AC-4）和（AC1, H-4）说明A的连接方式为（1→4）。然而由于含量低的缘故（BH-6, AC-1）交叉峰未检测到，但（1→4, 6）连接方式可以通过¹³C谱中B的C-6化学位移向低场移动而得到确认。其余的一些相关H1-C4，H1-C3，H1-C5交叉峰、H3-C4，H3-C5交叉峰、H4-C6，H4-C5，H4-C2交叉峰见图18标示。根据文献Wang, Zhang (2009)，羟基的反应活性为C-6>C-4>C-2，再结合B异头质子的分裂现象，推断硫酸酯化的位置为O-6。

因此，综合上述化学和仪器分析波谱分析方法结果，证明SHG是以α-D-(1→4)葡萄糖为主链，每隔4-10个糖残基在O-6位有一个非还原末端的分枝的葡聚糖，并且，在主链的O-6位每隔33-43个糖残基有一个硫酸酯基，也即结构单元如下：

n=4-10

6、抗辐射实验

实验方法：

健康昆明种SPF雄性小鼠，20 ± 2g，鼠龄6～7周，由兰州大学GLP实验动物中心提供，共45只×2批，每组15只，随机分为3组，正常对照组（不照射不给药），实验对照组（照射模型组，只照射不给药），硫酸酯葡聚糖(SHG)组。

动物存活率测定：雄性健康小鼠45只，于实验室适应性喂养三天后，随机分为3组，每组15只。正常对照组和辐射对照组给予等量生理盐水，均于早晨空腹灌胃，每日1次，每次0.5mL，每两天称体重，根据体重调整给药量，期间动物自由摄食和饮水。各组连续灌胃10d后进行X-射线源照射，辐射后继续灌胃10d，观察照射后30d存活率及存活时间。

外周血细胞数、胸腺脾脏指数测定：健康雄性小鼠45只，于实验室适应性喂养三天后，随机分为3组，每组15只。正常对照组和辐射对照组给予等量蒸馏水，均于早晨空腹灌胃，每日1次，每次0.5mL，每天称体重，记录并根据体重调整给药量，期间动物自由摄食和饮水。各组连续灌胃10d后进行X-射线照射，于照射前、照射后第2、5、7、11、16d，分别剪尾尖采血，加稀释液后用自动血球分析仪（日本Sysmex，KX-21N）测外周血白细胞和淋巴细胞数、血红蛋白、血小板、网织红细胞。照射后第16d称量小鼠体重，颈椎脱臼处死后，摘取小鼠的胸腺和脾脏，用滤纸吸干残血后，称重，分别除以小鼠体重，再乘以10，得到胸腺指数和脾脏指数。

照射条件：以6MHz X-射线辐射源（由兰州市军区陆军总医院提供）对小鼠进行一次性全身照射，吸收剂量率为1.0Gy/min，吸收剂量为8Gy，源距为50cm，观察小鼠存活率；吸收剂量率为1.0Gy/min，吸收剂量为4Gy，源距为50cm，小鼠进行一次性全身照射观察对小鼠造血功能的影响。

统计学处理：

数据以均数±标准差（

±S）表示，组间差异显著性采用t检验，显著性（p<0.01，0.05）作为有效依据。

结果为：

（1） 对小鼠体重的影响：

结果见表3。

照射后第2～5天除正常组外各组体重均明显下降，随后又有不同幅度的上升。由表3可见，随着多糖口服时间的延长，体重也随之缓慢增加，较模型组硫酸酯葡聚糖(SHG)组体重增加较快，说明硫酸酯葡聚糖(SHG)能增加辐照后小鼠体重。

（2）对30天受照小鼠X-射线照射小鼠存活率影响：

 结果见表4。

在X-射线照射后当天，各组小鼠（除正常组）食欲下降活动减少，体重皆下降，陆续出现精神萎靡不振，耳廓及尾部苍白，部分小鼠耳廓出现血斑，模型组更为明显。但随着时间的推移小鼠渐渐恢复活力，硫酸酯葡聚糖(SHG)组恢复较快。照射后两周左右，模型组小鼠开始出现被毛蓬乱，稀疏无光泽，采食量下降，从第8天开始陆续死亡。硫酸酯葡聚糖(SHG)组小鼠毛色有光泽且较浓密，较少出现皮毛稀疏松散现象。模型组与给药组相比，死亡时间较早，死亡数较多。从表4中可以看出，硫酸酯葡聚糖(SHG)能提高辐照小鼠的存活率，存活率为33.33%、33.33%，模型组存活率为6.67%，并且与模型组比较，硫酸酯葡聚糖(SHG)能显著延长平均存活时间。

存活率和存活时间是反映抗辐射作用的最基本最客观的综合指标，因为抗辐射的最终目的就是为了提高存活率和延长存活时间。实验结果表明硫酸酯葡聚糖(SHG)对X-照射小鼠具有良好的抗辐射效果，可以增加小鼠的体重、平均存活时间和30d存活率。

（3）硫酸酯葡聚糖(SHG)对辐射损伤小鼠外周血白细胞和淋巴细胞数量的影响：

如图19显示，辐照后小鼠外周血白细胞数的变化曲线，正常组小鼠在实验期间其白细胞数目有所波动，但变化微小，基本保持在同一水平线上，其它各组，经过4.0Gy X-射线照射后，白细胞数均急剧下降，在2～3天时降至最低水平，第4天后白细胞数量开始逐渐回升，模型组的白细胞数低于硫酸酯葡聚糖(SHG)组，而且回升速度均低于硫酸酯葡聚糖(SHG)组，硫酸酯葡聚糖(SHG)组的白细胞数回升速度最快，且逐渐趋于平稳。由表5可知，硫酸酯葡聚糖(SHG)低剂量组与模型组比较能显著性提高辐照小鼠白细胞数量。说明硫酸酯葡聚糖(SHG)能促进辐照后小鼠外周血中白细胞数目的恢复，从而起到加速辐射小鼠体质恢复的功能。

由图20可见，小鼠在正常情况下，淋巴细胞数有所波动，但变化较小，基本维持在同一水平线上，经过4.0Gy X-射线照射后，淋巴细胞数急剧下降，在照后2～3天间达到最低值，然后逐渐回升，模型组不仅淋巴细胞数低，而且回升速度均低于给药组，而给药组淋巴细胞数明显高于模型组，并且恢复较快。由表6可见，硫酸酯葡聚糖(SHG)能显著提高外周血淋巴细胞数量。

综上，硫酸酯葡聚糖(SHG)对外周血白细胞和淋巴细胞数有不同程度的提高。

（4）硫酸酯葡聚糖(SHG)对小鼠脾指数和胸腺指数的影响：

胸腺指数方面，与模型组比较，硫酸酯葡聚糖(SHG)组的胸腺指数有显著性差异；脾脏既是免疫器官又是小鼠的造血组织，硫酸酯葡聚糖(SHG)组的脾脏指数与模型组有显著性差异。以上结果说明硫酸酯葡聚糖(SHG)能提高免疫器官胸腺、脾脏的脏器指数，对小鼠免疫损伤的恢复有促进作用。

本实验结果表明，硫酸酯葡聚糖(SHG)对X-射线诱发的辐射损伤有较好的保护作用。

7、抗凝血实验

实验方法：

药物：硫酸酯葡聚糖(SHG)； 法华令片剂

动物：昆明种小鼠，体重为20±2 g，由兰州大学动物中心提供。

饲养条件：室温25～28℃　相对湿度 55%～75%  照度> 200LU X，12 h明暗交替。

实验仪器及试剂：Coulter2TT血常规测定仪，Labor Fibrin-timer C50D血凝测定仪，PT液、TT液、KPTT液由Pacific Homeostasis公司提供。大鼠PT，TT，KPTT，RPT等各项指标由兰州三爱堂医院检验部协作测定。

（1）小鼠凝血时间(CT ) 的测定：小鼠30只，随机分成3 组，按25mL/kg 容量灌胃，分别给予生理盐水(N. S)，法华令7mg/kg，HPS-2 1000mg/kg。1 h 后用直径为10mm的玻璃毛细管插入小鼠内眦球后静脉丛取血至血柱高达5cm，每隔30s折断毛细管一段，检查有无血凝丝。计算从取血至出现血凝丝的时间，即为凝血时间。

（2）大鼠PT、TT、KPTT、RPT的测定：取大鼠24 只，随机分成3组，分别等容量灌胃给予N. S, 法华令3. 5mg/k g，HPS-2 500mg/kg。连续给药5d，末次给药后1h，大鼠ip戊巴比妥钠30 mg/kg麻醉，腹主动脉采血3mL，放入盛有枸橼酸钠液0.4mL的离心管内轻轻摇匀，吸出600μL全血用血常规测定仪测定血小板数(PLT) ,余下全血以1500r/min 速度离心10min，取上层血浆测定血浆凝血酶原时间PT、血浆凝血酶时间TT、白陶土部分凝血活酶时间KPTT及血浆复钙时间RPT。

PT、TT、KPTT的测定：各取血浆100μL分别加入PT液100μL、TT液100μL，KPTT液100μL由血凝测定仪测定。

RPT的测定：取血浆200μL置试管内，37℃水浴温育60min后加入0.025 mol/L的CaCl₂液100μL，即刻启动秒表记录管内出现白色纤维蛋白膜所需的时间，重复2次，取平均值。

统计方法：SPSS软件处理计数资料，组间t检验。

结果为

（1）小鼠凝血时间(CT ) 的测定：

结果见表8。

HPS2（1000 mg/kg）可显著延长小鼠凝血时间，与N. S组相比有显著差异。

（2）大鼠PT、TT、KPTT、RPT的测定：

结果见表9。.

硫酸酯葡聚糖(SHG)能显著延长PT (P < 0. 01)和KPTT ( P <0. 01)，有延长RPT的趋势，硫酸酯葡聚糖(SHG)的PLT值与生理盐水组相比无显著差异。

   通过本实验的抗凝血研究，发现硫酸酯葡聚糖(SHG)能延长小鼠凝血时间(CT )、大鼠血浆凝血酶原时间(PT )、白陶土部分凝血活酶时间(KPTT ) ，提示硫酸酯葡聚糖(SHG)有抗凝血作用。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.红芪多糖中的硫酸酯葡聚糖，其特征在于：结构单元如下，分子量范围为3×10³～1×10⁶ Da

，

n=4-10

其以α-D-(1→4)葡萄糖为主链，每隔4-10个糖残基在O-6位有一个非还原末端的分枝，并且，在主链的O-6位每隔33～43个糖残基有一个硫酸酯基。

2.权利要求1所述的红芪多糖中的硫酸酯葡聚糖的制备方法，其特征在于：步骤如下，

（1）红芪多糖2的提取

红芪药材粉碎后，进行脱脂处理，在40～70℃的水中提取，浓缩提取液；将浓缩液首先用终浓度为10～30%乙醇沉淀，过滤，沉淀为红芪多糖1；上清液用终浓度为35%～65%乙醇沉淀，过滤，沉淀为红芪多糖2；

（2）红芪多糖2的分离纯化

红芪多糖2依次进行除蛋白、脱色素、透析处理，再将处理后的红芪多糖2溶于蒸馏水并离心去除不溶物杂质，滤液进行纤维素阴离子交换剂DEAE系列柱色谱纯化，分别用蒸馏水、NaCl洗脱，流速为0.1～8mL/min，自动部分收集器按每管0.1～8mL收集；以苯酚-硫酸法测吸光度值A490nm示踪，作洗脱曲线，合并主峰部分，透析，冷冻干燥；

将上述主峰部分所得多糖用凝胶Sephadex G系列柱色谱进一步纯化，用蒸馏水洗脱，流速为0.1～8mL/min，每管收集0.1～8mL，以苯酚-硫酸法测A490nm示踪，作洗脱曲线，合并主峰，冷冻干燥，得到硫酸酯葡聚糖。

3.根据权利要求2所述的红芪多糖中的硫酸酯葡聚糖的制备方法，其特征在于：所述纤维素阴离子交换剂DEAE系列柱处理为Clˉ型。

4.根据权利要求2所述的红芪多糖中的硫酸酯葡聚糖的制备方法，其特征在于：过凝胶Sephadex G系列柱色谱时，洗脱溶液的pH值保持在5～8。

5.权利要求1所述的红芪多糖中的硫酸酯葡聚糖在抗辐射、抗凝血药物、保健

品制备中的应用。

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