CN113861301B - 一种非淀粉百合多糖nslp-1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，具体公开了一种非淀粉百合多糖NSLP‑1及其应用。本发明从百合中分离提取得到一种非淀粉百合多糖NSLP‑1，该非淀粉百合多糖NSLP‑1具有抗炎、调控肠道菌群紊乱、改善睡眠障碍的功效，为开发预防或治疗肠道菌群失调症，或由肠道菌群失调诱发的疾病提供一种天然、新型的药物来源。

Description

一种非淀粉百合多糖NSLP-1及其应用

技术领域

本发明属于医药技术领域。更具体地，涉及一种非淀粉百合多糖NSLP-1及其应用。

背景技术

百合是一味可“药食两用”的传统中草药，是中医药瑰宝。百合入药的最早记载见于《神农本草经》。2020年《中华人民共和国药典》规定其为百合科植物卷丹Liliumlancifolium、百合L.brownii或细叶百合L.pumilum的干燥肉质鳞茎。我国百合有药百合、川百合、百合、毛百合、细叶百合等，临床上药用的为药典收载的3个品种，即卷丹、百合、细叶百合，百合食用价值高，性味甘寒，具有清心安神和养阴润肺的功效，具有药食同源的双重价值。近年来研究也表明百合具有免疫调节、抗抑郁、降血糖、抗肿瘤、抑菌、抗疲劳等功效。百合中含有较多的多糖、皂苷、酚酸、生物碱、蛋白质、皂苷、氨基酸、维生素和微量元素等成分，其中，多糖的含量高达6％，百合多糖又包括淀粉多糖及非淀粉多糖两种类型，淀粉作为存储多糖，具有活性的多糖一般指的是非淀粉多糖。

非淀粉多糖具备生物大分子的特性，其结构复杂，多糖的结构受到单糖组成、糖环结构(五元环或六元环)、端基碳苷键构型(α或β)、糖苷键的连接位点、多糖分子链长度及其分支程度的影响，进一步地，多糖在溶液中的行为、空间构象等高级结构的不同也导致其不同的药理活性，而多糖结构的差异又会受到样本来源、分离纯化方法的影响，因而不同来源和提取方法与制备所得多糖的生理活性具有直接的关联。如【不同提取方法对兰州百合多糖结构及抗氧化活性的影响】。黔产淡黄百合多糖具有降低血糖活性作用【黔产百合多糖含量测定及降血糖活性研究】，而滕利荣等采用热水法及复合酶法提取百合多糖对O-2及-OH的抑制作用、对H2O2诱导的人血红细胞氧化溶血的抑制作用及人红细胞膜脂质过氧化的抑制作用均显著【酶法提取百合多糖及其体外抗氧化活性】。杨岚等发现龙牙百合多糖通过激活死亡受体凋亡途径和线粒体途径，诱导人肝癌HepG2细胞凋亡【龙牙百合多糖对人肝癌细胞HepG2凋亡的影响】。可见，百合多糖的来源及其提取方法，结构不同，其活性迥异。

失眠症是最常见的睡眠障碍，短期失眠发生率可达50％，慢性失眠患者至少占世界总人口的8％，有6％的人曾经或正在使用处方药治疗失眠。我国一般人群的流行病学调查表明，15％受慢性失眠困扰。失眠可增加抑郁症、焦虑症、糖尿病、冠心病、哮喘、肥胖症等的患病风险，严重影响患者的身心健康和生活质量，同时也给社会造成沉重负担。汪泳涛等采用长期超负荷游泳运动建立失眠及睡眠障碍动物模型(应激失眠模型，主要影响丘脑-垂体-肾上腺轴功能)用于药物的临床评价。现代生物学及免疫药理学研究表明，睡眠障碍与脑-肠轴和菌群有关，近年来，随着“脑-肠轴”理论的提出，相关实验也证实了睡眠障碍与胃肠道功能的相关性，肠道菌群是胃肠道的重要组成部分，也是脑-肠轴的核心通路。REYNOLDS A C等发现肠道菌群对大脑功能产生影响主要通过直接分泌小分子物质通过血脑屏障作用于大脑和间接参与神经、内分泌、免疫的调节从而对大脑功能产生影响等两种方式。孙波等研究表明，肠道菌群可产生多巴胺、五羟色胺、Glu、GABA等神经递质，通过血脑屏障、迷走神经对中枢神经系统的功能产生直接或间接影响；肠道菌群还可活化多种细胞因子，使血液中的细胞因子发生改变，进而影响中枢神经系统，导致失眠的产生。同时，长期失眠也会引起肠道菌群失调，破坏肠道菌群稳态，改变菌群的丰富程度，导致其他疾病的发生。可见，失眠与肠道菌群关系密切，相互影响。

百合多糖品种繁多，现代医学表明，百合粗多糖具有多种药理活性，如降血糖、抗氧化、抗肿瘤、抗疲劳、增强机体免疫力、提高淋巴细胞转化率【百合多糖的药理作用及其作用机制研究进展】，但百合多糖对肠道菌群以及睡眠障碍的作用还未见相关研究报道。

发明内容

本发明针对现有技术存在的缺陷和不足，旨在提供一种非淀粉百合多糖(Non-starch lily polysaccharide，NSLP-1)及其应用，该非淀粉百合多糖NSLP-1具有抗炎、调控肠道菌群紊乱、改善睡眠障碍的活性，因此可用于开发新型的调节肠道菌群失调以及治疗睡眠障碍的药物。

本发明的另一目的在于提供一种非淀粉百合多糖NSLP-1。

本发明的另一目的在于提供百合在制备所述非淀粉百合多糖NSLP-1中的应用。

本发明的另一目的在于提供非淀粉百合多糖NSLP-1在制备预防和/或治疗肠道菌群失调的药物中的应用。

本发明的另一目的在于提供非淀粉百合多糖NSLP-1在制备抗炎药物中的应用。

本发明的另一目的在于提供非淀粉百合多糖NSLP-1在制备预防和/或治疗睡眠障碍的药物中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种肠道菌群调节剂。

本发明的另一目的在于提供一种预防和/或治疗睡眠障碍的药物。

本发明的再一目的是提供一种抗炎药物。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明从百合中提取得到一种具有调控肠道菌群紊乱、改善睡眠障碍的非淀粉百合多糖NSLP-1，其结构式如下所示：

本发明首次从百合中获得一种分子量在1000Da至3000Da区间的多糖NSLP-1，其糖含量为87％以上；高分辨质谱结果显示其分子量为2610.8399Da，元素组成为C₉₂H₁₆₂O₈₄，二级质谱碎片信息表明其单糖单元均为六碳醛糖；LC-MS分析其单糖组成为：甘露糖和葡萄糖，摩尔百分比为11.137：9.427；甲基化分析和NMR结果显示NSLP-1的糖苷键由四种类型的糖苷键组成，分别为：Glup-(1→、→2)-Glup-(1→、→3)-Manp-(1→、Manp-(1→，其摩尔百分比分别为1.21％、37.93％、59.93％和0.93％。

本发明通过构建睡眠障碍大鼠模型，给予百合活性多糖NSLP-1干预后，对模型大鼠肠道菌群的变化、炎症指标以及神经单胺递质的检测。结果显示该百合多糖NSLP-1可恢复肠道菌群失调大鼠的IL-6及TNF-α的含量，表明其在动物水平上具有抗炎效果。且与模型组相比，NSLP-1干预后，大鼠肠道中拟杆菌门和乳杆菌属的相对丰度升高，而疣微菌门与阿克曼菌属的相对丰度以及F/B数值降低，表明百合活性多糖NSLP-1可以通过调控肠道菌群的种类及丰度，有效调节肠道菌群结构以改善肠道健康。此外，各模型组大鼠下丘脑中两种单胺递质含量均下降，给予百合活性多糖NSLP-1干预后，下丘脑中5-HT含量提高，DA含量降低；模型组大鼠海马区游离的兴奋性氨基酸增多，抑制性氨基酸减少，兴/抑值增高，采用多糖处理后，兴/抑值降低；表明百合多糖NSLP-1对睡眠障碍大鼠具有镇静催眠作用，睡眠障碍均显示出了很好的调节作用。

因此，百合在制备上述非淀粉百合多糖NSLP-1中的应用；非淀粉百合多糖NSLP-1在制备预防和/或治疗肠道菌群失调的药物中的应用；非淀粉百合多糖NSLP-1在制备抗炎药物中的应用；非淀粉百合多糖NSLP-1在制备预防和/或治疗睡眠障碍的药物中的应用；以及非淀粉百合多糖NSLP-1在制备预防和/或抗抑郁药物中的应用都应在本发明的保护范围内。

基于本发明获得的非淀粉百合多糖NSLP-1具有优良的抗炎活性，以及调节肠道菌群紊乱和改善睡眠障碍的功效，因此，可将其制备成药物制剂，针对性地改变肠道菌群，调节肠道菌群结构，改善肠道健康，以及调节睡眠障碍和抗炎。

基于该非淀粉百合多糖NSLP-1可针对性地调节肠道菌群结构，改善肠道健康，因此，采用该非淀粉百合多糖NSLP-1还可以用于预防与肠道菌群紊乱相关的其他疾病，如：炎性肠病、结肠癌、糖尿病、冠心病、哮喘、肥胖症、抑郁症、焦虑症和创伤后应激障碍等由肠道菌群紊乱诱发的相关疾病。

因此，一种包含上述非淀粉百合多糖NSLP-1的肠道菌群调节剂，一种包含上述非淀粉百合多糖NSLP-1的用于预防和/或治疗睡眠障碍的药物，以及一种包含上述非淀粉百合多糖NSLP-1的抗炎药物也都应在本发明的保护范围内。

上述调节剂或药物还包含药学上可接受的载体，如缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂或润滑剂等，根据不同的应用场景，制成不同的剂型，如片剂、口服液、颗粒剂、胶囊剂、煎膏剂等针对性给药。

优选地，当应用对象为动物(例如大鼠)时，所述非淀粉百合多糖NSLP-1的有效剂量为25mg/Kg/天。当应用对象为人时，可按照药学领域的相关给药标准，相应折算成人体的给药量。

当所述剂型为口服液时，其制备方法为：将上述非淀粉百合多糖NSLP-1溶解到去离子水中，然后调节pH值至5.5±0.2，再加入食用防腐剂，离心除去杂质，即得到含有非淀粉百合多糖的口服液。

作为一种可选择的方案，从百合中提取非淀粉百合多糖NSLP-1的方法包括以下步骤：

S1.粗多糖的制备：百合鳞茎干燥、粉碎，加乙醇提取，烘干醇提后的百合鳞茎，再进行水提，水提液经浓缩后，进行醇沉，收集沉淀，即得百合粗多糖；

S2.除淀粉及蛋白：百合粗多糖加水溶解，加入α-淀粉酶和木瓜蛋白酶进行酶解，并采用Sevage法去除蛋白质，酶解后的样品流水透析、干燥即得到去除淀粉及蛋白的百合粗多糖；

S3.分离与纯化：将去除淀粉及蛋白的百合粗多糖溶于水，用DEAE-52阴离子交换柱进行分离、纯化，得到所述的非淀粉百合多糖NSLP-1。

具体的，上述方法为：

S1.粗多糖的制备：百合鳞茎干燥、粉碎，在百合粉末中加入10倍量70％乙醇进行超声(400W，40Hz)提取1h，烘干醇提后的百合鳞茎，再加入15倍量去离子水超声(400W，40Hz)提取3次，每次1h，水提液经浓缩后缓慢加入无水乙醇，边加边搅拌使乙醇终体积浓度为90％，搅拌均匀后放置于4℃冰箱中进行醇沉12h，醇沉后的溶液离心，收集下层沉淀，即得百合粗多糖；

S2.除淀粉及蛋白：在百合粗多糖中加入250倍量去离子水溶解，加入耐高温α-淀粉酶，使溶液中α-淀粉酶浓度达到1U/ml，90℃酶解2h；待溶液冷却至60℃以下，加木瓜蛋白酶使溶液酶活性为1600U/g，60℃酶解3h；最后按照酶解液与Sevage试剂的体积比为5：1加入Sevage试剂(正丁醇与氯仿体积比1：4)去除蛋白质，酶解和去除蛋白质后的样品经过去离子水透析48h、冻干即得到去除淀粉及蛋白的百合粗多糖；

S3.DEAE-Cellulose 52的活化与装填：填料加入乙醇水溶液充分溶胀24h，按照0.5M NaOH—去离子水—0.5M HCl—去离子水—0.5M NaOH—去离子水顺序依次浸洗填料后装填于中压层析柱中；

S4.分离与纯化：将去除淀粉及蛋白的百合粗多糖溶于5倍量的去离子水中，5000rpm离心10min取上清液上样于步骤S3处理的DEAE-52阴离子交换柱，以去离子水进行洗脱，收集洗脱液，苯酚-硫酸法显色后用紫外分光光度计在490nm处测定吸光度值，绘制洗脱曲线，收集样品，根据HPLC-GFC-ELSD测定纯度高的单一对称色谱峰进行合并，透析后冻干(-80℃，0.20M bar)，得到所述的非淀粉百合多糖NSLP-1。

此外，本发明的非淀粉百合多糖NSLP-1可通过化学手段合成。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1.本发明提供的非淀粉百合多糖NSLP-1具有抗炎，改善睡眠障碍，以及有效调节肠道菌群结构，改善肠道健康的功效，为治疗肠道菌群失调提供了一种新的药物选择，也可用于对肠道菌群失调诱导的相关疾病的预防。

2.本发明提供的非淀粉百合多糖NSLP-1提供了百合在开发防治睡眠障碍、肠道调节药物方面的新用途。

附图说明

图1为本发明非淀粉百合多糖NSLP-1提取流程图；

图2为实施例1中非淀粉百合多糖NSLP-1的紫外光谱图；

图3为实施例1中非淀粉百合多糖NSLP-1的单糖组成分析液相色谱质谱联用总离子流图(1:甘露糖、2：鼠李糖、3：葡萄糖醛酸、4：半乳糖醛酸、5：葡萄糖、6：半乳糖、7：阿拉伯糖、8：岩藻糖)；

图4为实施例1中非淀粉百合多糖NSLP-1的高分辨质谱图；

图5为实施例1中非淀粉百合多糖NSLP-1的红外光谱图；

图6为实施例1中非淀粉百合多糖NSLP-1的核磁共振波谱图(a为¹HNMR谱，b为¹³CNMR谱，c为HMBC图谱，d为HSQC图谱)；

图7为非淀粉百合多糖NSLP-1对免疫炎症因子IL-6表达的影响图；

图8为非淀粉百合多糖NSLP-1对炎症因子TNF-α表达的影响图；

图9为非淀粉百合多糖NSLP-1对长期超负荷游泳运动大鼠5-HT的影响图；

图10为非淀粉百合多糖NSLP-1对长期超负荷游泳运动大鼠DA的影响图；

图11为非淀粉百合多糖NSLP-1对长期超负荷游泳运动大鼠海马氨基酸的影响图；

图12为非淀粉百合多糖NSLP-1对长期超负荷游泳运动大鼠门水平的多样性和组成分析图；

图13为非淀粉百合多糖NSLP-1对长期超负荷游泳运动大鼠属水平的多样性和组成分析图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

本发明实施例所用的百合为龙牙百合。

图1为本发明非淀粉百合多糖NSLP-1提取流程图。

实施例1非淀粉百合多糖NSLP-1的提取和鉴定

一、提取方法

S1.粗多糖的制备：百合鳞茎干燥、粉碎，称取1g粉末加70％乙醇10mL超声(400W，40Hz)提取1h，烘干醇提后的百合鳞茎，加入15倍量去离子水超声(400W，40Hz)提取3次，每次1h，水提液经浓缩后缓慢加入无水乙醇，边加边搅拌使乙醇终体积浓度为90％，搅拌均匀后放置于4℃冰箱中进行醇沉12h，醇沉后的溶液离心，收集下层沉淀，即得百合粗多糖；

S2.除淀粉及蛋白：1g百合粗多糖加入250mL去离子水溶解，加入耐高温α-淀粉酶，使溶液酶浓度达到1U/ml，90℃酶解2h；待溶液冷却至60℃以下，加木瓜蛋白酶使溶液酶活性为1600U/g，60℃酶解3h；最后按照酶解液与Sevage试剂的体积比为5：1加入Sevage试剂(正丁醇与氯仿体积比1：4)去除蛋白质，酶解和去除蛋白质后的样品经过去离子水透析48h、冻干即得到去除淀粉及蛋白的百合粗多糖；

S3.DEAE-Cellulose 52的活化与装填：填料加入乙醇水溶液充分溶胀24h，按照0.5M NaOH—去离子水—0.5M HCl—去离子水—0.5M NaOH—去离子水顺序依次浸洗填料后装填于中压层析柱中；

S4.分离与纯化：称取300mg去除淀粉及蛋白的百合粗多糖溶于15mL去离子水中，5000rpm离心10min取上清液上样于步骤S3处理的DEAE-52阴离子交换柱，以去离子水进行洗脱，收集洗脱液，苯酚-硫酸法显色后用紫外分光光度计在490nm处测定吸光度值，绘制洗脱曲线，收集样品，根据HPLC-GFC-ELSD测定纯度高的单一对称色谱峰进行合并，透析后冻干(-80℃，0.20M bar)，得到所述的非淀粉百合多糖NSLP-1。

二、结构鉴定方法

1、纯度验证及分子量测定

(1)采用HPLC-GFC-ELSD法进行样品纯度的验证和分子量测定，液相色谱条件及检测器参数如表1所示。配制NSLP-1样品1mg/mL，过0.22μm滤膜后进样。另配制浓度为1mg/mL的一系列不同分子量的葡聚糖标准品溶液(分子量分别为1kDa、3kDa、27kDa、50kDa、150kDa)，经测定得到其保留时间为横坐标，并与其分子量的对数为纵坐标绘制葡聚糖排阻曲线，待测多糖溶液同法测定，根据排阻曲线计算多糖分子量。结果显示非淀粉百合多糖NSLP-1的色谱图无其他杂峰，为单一对称的色谱峰，根据色谱峰面积归一化法测定其纯度大于95％。计算得到本发明非淀粉百合多糖的分子量为2610.8Da。

表1液相色谱条件及检测器参数

(2)精密称取百合多糖NSLP-1 1mg，加去离子水溶解定容至10mL，即得浓度为0.1mg/mL的样品溶液，用紫外分光光度计全波长扫描验证是否含有核酸和蛋白质，波长范围为200-400nm。根据紫外光谱图2可以看出NSLP-1在波长260nm和280nm处均没有吸收峰，表明其不含有蛋白质和核酸。

2、单糖组成测定

(1)单糖标准品的衍生化

精密称取阿拉伯糖(Ara)、半乳糖醛酸(GalA)、葡萄糖醛酸(GluA)、甘露糖(Man)、葡萄糖(Glu)、半乳糖(Gal)、岩藻糖(Fuc)、鼠李糖(Rha)各1mg于具塞试管中，每管加0.5mL浓度为0.5M的1-苯基-3-甲基-5-吡啶啉酮(PMP)甲醇溶液，封口膜密封，70℃水浴衍生化反应30min后。反应产物经氮气吹干后加入500μL甲醇再吹干，如此反复3次，即得PMP衍生化单糖标准品。用1mL甲醇复溶，作为单糖衍生物母液。混合标准品为上述母液吸100μL，涡旋混匀。

(2)百合多糖的完全酸水解

取百合多糖NSLP-1样品1mg于具塞试管中，加入0.5mL 4M三氟乙酸(TFA)，N₂充满试管，盖上塞子并用封口膜密封，120℃油浴3h后，用氮气将溶剂吹干，加入500μL甲醇再吹干，如此反复操作3次除去残留的TFA。

(3)百合多糖的衍生化

将完全酸水解后的百合多糖样品用0.5mL氨水复溶，震摇使其完全溶解，加0.5mL浓度为0.5M的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)甲醇溶液，用封口膜密封，70℃水浴衍生化反应30min。反应产物经氮气吹干后加入500μL甲醇再吹干，如此反复3次。用1mL甲醇复溶，得百合多糖水解衍生物，待液质检测使用

(4)UPLC/Q-TOF MS分析条件

流动相：水相(A)：0.05％乙酸，20mM乙酸铵；有机相(B)：乙腈。

色谱柱：ACE C18-PFP柱(2.1×100mm，1.7μm)；流速为0.4mL/mL；柱温为25℃；样品室温度为常温；进样量为5μL；梯度洗脱程序见表2；

表2液相系统梯度洗脱程序

时间(min)	A相/％	B相/％	线性
				0	80	20
16	80	20	6
				20	50	50	6
25	5	95	6
				26	80	20	6
28	80	20	6

质谱使用ESI离子源，正离子模式下进行检测。质谱参数如下：质量采集范围为100～1500Da(正/负离子模式)，碰撞能(CE)为-10V，离子源温度为500℃，气帘气(CUR)流速为35L/h，雾化气(Gas1)流速为50L/h，离子喷雾电压为-4.5kV，去簇电压(DP)为-80V，干燥气(Gas2)流速为50L/h。二级质谱为IDA模式，去簇电压(CE)为35±15V；10个最强离子强度阈值大于200cps，误差小于50mDa，激活动态背景减法，排除时间(半峰宽)为6s。

根据对比单糖标品(甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、岩藻糖)的保留时间和分子量等信息(图3)可知该百合多糖NSLP-1的单糖组成。该多糖含有的单糖是甘露糖和葡萄糖，摩尔百分比为11.137：9.427。根据质谱图(图4)，可知其分子量为2610.8399Da，由质谱信息可知每次断裂的碎片均为162.05Da，碎片信息表明其单糖单元均为六碳醛糖，与单糖组成结果相一致。

3、红外光谱分析

精密称定100mg百合多糖NSLP-1样品和150mg干燥的溴化钾晶体，在钨灯照射下于研钵中研磨混合均匀。压片机压片后用傅立叶变换红外光谱仪在4000-400cm^-1的范围内进行红外光谱扫描

图5是该百合多糖的红外图谱，3406cm^-1处的强吸收峰是O-H的伸缩振动吸收峰，峰形宽且钝，是多糖上的O-H形成的分子间、内氢键，2916cm^-1是C-H的伸缩振动吸收峰，1419cm^-1是C-H的变角振动吸收峰，1256cm^-1处的吸收峰是-CH₂基团的C-H伸缩振动吸收峰。1064cm^-1和1029cm^-1是醇羟基的变角振动吸收特征峰，1000-1200cm^-1是糖环上醚键的不对称伸缩振动特征吸收峰，这些特征吸收峰均为糖聚物的特征吸收峰。此外，NSLP-1在870cm^-1和809cm^-1处有较强的吸收峰，二者是甘露糖的特征吸收峰，表明甘露糖含量较高，这与单糖组成结果一致。890cm^-1处的吸收峰表明存在β构型，603cm^-1(NSLP-1)处的吸收峰表明存在α构型。因此，根据上述结果可知，NSLP-1是含有α糖苷键和β糖苷键的中性多糖。

4、甲基化结果分析

(1)多糖样品的完全甲基化

精密称定百合多糖样品0.0050g于100mL圆底烧瓶中，加入无水甲醇5mL，减压浓缩至干，重复2-3次，以除尽样品中水分，充分干燥样品。于装有干燥样品的圆底烧瓶中加入无水DMSO 5mL，超声1h，使样品充分溶解；快速称量干燥的NaOH粉末600mg，置于10mL EP管中，加入无水DMSO 5mL，用玻璃棒将其彻底研碎；将配置好的NaOH-DMSO溶液加入到装有样品溶液的圆底烧瓶中，搅拌均匀，继续超声反应1h。避光条件下加入碘甲烷500uL，超声反应10min，再避光条件下加入碘甲烷500uL，超声反应10min，最后在避光条件下加入碘甲烷500uL，超声反应1h，结束反应。反应结束后，加入3mL去离子水直至溶液变澄清后加入7mL氯仿萃取，10000r/min离心10min，取氯仿层重复萃取3次，最终取氯仿层进行红外光谱分析，检测甲基化过程是否完全(3500cm^-1处羟基峰完全消失，2900cm^-1处出现甲基峰)。

(2)完全甲基化多糖样品的完全酸水解及乙酰化

取完全甲基化多糖样品转移至100mL圆底烧瓶中，用0.5mL 4M TFA溶液完全溶解，充满N₂后用封口膜密封，于120℃下油浴5h，氮吹至干加入1mL无水甲醇，氮吹至干，重复数次以除去残留的TFA(pH为中性)；加入0.0200gNaBH₄于40℃条件下水浴30min，加入100μL冰醋酸终止反应，加入1mL无水甲醇，氮吹至干，重复至pH为中性；待样品完全干燥后加入2mL吡啶与2mL乙酸酐于95℃条件下油浴反应2h，反应结束，氮吹至干；加入2mL氯仿溶解，再加入等体积的去离子水反复萃取3次，取氯仿层，室温条件下挥发至0.5mL后供GC-MS检测。GC-MS分析条件如表3所示。

表3 GC-MS分析条件

NSLP-1的甲基化分析结果件表4所示，结果表明，NSLP-1的糖苷键类型比较简单，其由四种类型的糖苷键组成，分别为：Glup-(1→、→2)-Glup-(1→、→3)-Manp-(1→、Manp-(1→，其摩尔比为1.21％、37.93％、59.93％和0.93％。

表4 NSLP-1的甲基化分析结果

/>

5、核磁共振波谱分析

精密称定百合多糖NSLP-1样品50mg，加99.9％的重水600uL，使样品尽可能溶解完全后，离心后取上清，用500MHz核磁共振仪检测。

NSLP-1的¹H NMR谱、¹³C NMR谱、HBMC谱和HSQC谱如图6所示。¹H NMR谱大多集中在3至5ppm的狭窄区域，这是多糖的典型特征，通过¹H NMR和¹³C NMR图谱中多糖分子的异头氢和异头碳，可以判断其糖苷键的具体构型。一般而言，α构型多糖分子异头氢的化学位移δ>5.0，β构型多糖分子异头氢化学位移δ<5.0。从¹H NMR谱可以看出，NSLP-1中存在α和β构型糖苷键，这与红外光谱分析的结果一致。

根据NSLP-1的¹³C NMR谱和HSQC谱，可以确定上述异头氢所对应的异头碳的位置，从图中可以得出的异头碳(C1)/异头氢(H1)的化学位移为：102.0/4.50，93.3/5.16，99.4/4.74，93.3/4.89ppm。结合HSQC和HMBC谱，可以对上述各个糖残基的信号进行归属。以糖残基A为例，其C1/H1为102.0/4.50ppm，在HMBC谱中找到与C信号相关的H2的化学位移为3.74ppm，然后根据HSQC谱可以对应出与H2相关的C2的化学位移为70.1ppm，按此法进行对照，即可找出其他位置的化学位移为C3/H3(73.40/3.62ppm)，C4/H4(68.88/3.47ppm)，C5/H5(76.29/3.79ppm)，C6/H6(59.77/3.86ppm)。其余糖苷键信号按照上述方法进行归属，NSLP-1的信号归属结果见表5。

表5 NSLP-1核磁化学位移比对分析

通过分析HMBC谱进一步确认NSLP-1中糖残基的连接位点，在δ4.74/93.3ppm，δ4.89/70.1 ppm，δ4.50/75.8 ppm，δ5.17/70.1 ppm处有四个强交叉峰，证明存在四个不同的连接位置，根据单糖组成分析、分子量测定结果、甲基化分析结果和NMR光谱分析的结果，推出残基A的C-2与残基C的O-1相连，残基A的C-2与残基B的O-1连接，残基C的C-3与残基A的O-1连接，残基D的C-1与残基C的O-1连接，因此，化合物非淀粉百合多糖NSLP-1的结构式如下式所示：

实施例2非淀粉百合多糖NSLP-1对长期超负荷游泳运动建立的失眠及睡眠障碍大鼠模型的影响

1、实验分组及处理

(1)从广东省医学实验动物中心购买SPF级，5-6周龄，体重为120～150g的SD雄性大鼠28只(合格证明：NO.44007200069456；许可证号：SCXK(粤)2018-0002)在SPF环境中适应性喂养一周后随机分为4组：空白组、模型组、阳性对照组、NSLP-1组。

(2)实验组别处理

空白组：不游泳不服药，普通饲养；

模型组：游泳造模，普通饲养；

阳性对照组：游泳同模型组，服药地西泮2mg/kg喂养+普通饲养；

NSLP-1组：游泳同模型组，服药非淀粉百合多糖NSLP-1(实施例1制得)25mg/Kg/天+普通饲养。

采用长期超负荷游泳运动建立失眠及睡眠障碍动物模型，游泳造模的方法为：大鼠游泳6周，每周5天，每天1次，日游泳时间由10分钟逐日增加至第5周末120min，再持续1周至造模结束。游泳水深60cm，水温30±2℃。

2、实验方法

(1)实验过程中，每日观察大鼠体重、肛温及一般状态，记录大鼠体重及肛温。实验第7周后，收集各实验组大鼠粪便，每组粪便混匀后经液氮处理存放于-80℃冰箱中；提取实验组大鼠粪便DNA，通过16sRNA测序后，结合生物信息学的分析比较相关肠道菌群结构特征

(2)实验结束后，眼球取血，将上述各组大鼠的静脉血放置15min，使用高速冷冻离心机在4℃下进行冷冻离心(5000r/min，15min)收集血清。用酶联免疫吸附试验试剂盒(上海酶联生物)检测血清IL-6、TNF-α的含量。20％乌来糖麻醉，给药剂量800-1000mg/kg大鼠麻醉时间为3小时后处死。迅速取出大脑，冰生理盐水洗净血液，冰盘迅速分离下丘脑，取一部分下丘脑组织，用预冷的PBS冲洗组织，去除组织残留血液，称重而后将组织用剪刀剪碎，将剪碎的组织与对应体积的PBS加入玻璃匀浆器中(按1：9的重量体积比，即1g的下丘脑组织样品对应9mL的PBS)然后冰上充分研磨，最后将匀浆液置于低温离心机进行离心，设置参数为5000g的离心力，离心10min，离心后取上清液置于-80℃保存备用。采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测5-HT和DA含量，根据试剂盒说明书步骤操作。氨基酸自动分析仪检测海马游离氨基酸。

3、实验结果

(1)经过6周超负荷游泳运动的实验组大鼠，体重下降，肛温增高，体形瘦小，皮毛干枯无光泽。游泳训练结束后，惊恐不安，在笼内跳，表现为高度的惊恐兴奋，表明失眠及睡眠障碍大鼠模型造模成功。

(2)图7和图8分别为非淀粉百合多糖NSLP-1对免疫炎症因子IL-6，NF-α表达的影响图，从图中可以看出，百合多糖NSLP-1可以下调模型组大鼠的炎症因子IL-6及TNF-α的含量，表明本发明非淀粉百合多糖NSLP-1通过调节炎症信号通路以修复睡眠障碍。

(3)图9和图10分别为非淀粉百合多糖NSLP-1对长期超负荷游泳运动大鼠5-HT，DA水平的影响图，从图中可以看出，与空白组相比，模型组大鼠下丘脑中5-HT、DA含量两种单胺递质含量均下降，经百合多糖NSLP-1处理后，5-HT含量提高，DA含量降低，表明非淀粉百合多糖NSLP-1能帮助恢复参与睡眠障碍的神经递质水平，对睡眠障碍大鼠具有镇静催眠作用。

(4)图11为非淀粉百合多糖NSLP-1对长期超负荷游泳运动大鼠海马氨基酸的影响图，从图中可以看出，模型组大鼠海马区游离的兴奋性氨基酸增多，抑制性氨基酸减少，兴/抑值增高，表明睡眠障碍大鼠模型造模成功。而采用多糖NSLP-1处理后组两者均增高，兴/抑值降低，表明非淀粉百合多糖NSLP-1具有镇静催眠作用。

(5)图12和图13分别为非淀粉百合多糖NSLP-1对长期超负荷游泳运动大鼠肠道菌群门、属水平的多样性和组成分析图，从图中可以看出，与模型组相比，NSLP-1干预后，大鼠肠道中拟杆菌门和乳杆菌属的相对丰度升高，而疣微菌门与阿克曼菌属的相对丰度以及F/B数值降低，表明非淀粉百合多糖NSLP-1可有效调节睡眠障碍大鼠菌群紊乱。

综上实验结果表明，本发明分离、纯化得到的活性非淀粉百合多糖NSLP-1具有镇静催眠、修复睡眠障碍的作用，其机制可能是通过抗炎免疫及肠道菌群调节脑肠轴而实现。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种非淀粉百合多糖NSLP-1，其特征在于，其结构式如下所示：

其中，Residue A为→2)-β-D-Glup-(1→，Residue B为α-D-Glup-(1→，Residue C为→3)-β-D-Manp-(1→，Residue D为β-D-Manp-(1→。

2.百合在制备权利要求1所述非淀粉百合多糖NSLP-1中的应用。

3.权利要求1所述非淀粉百合多糖NSLP-1在制备预防和/或治疗肠道菌群失调的药物中的应用。

4.权利要求1所述非淀粉百合多糖NSLP-1在制备抗炎药物中的应用。

5.权利要求1所述非淀粉百合多糖NSLP-1在制备预防和/或治疗睡眠障碍的药物中的应用。

6.一种肠道菌群调节剂，其特征在于，包含权利要求1所述非淀粉百合多糖NSLP-1。

7.一种预防和/或治疗睡眠障碍的药物，其特征在于，包含权利要求1所述非淀粉百合多糖NSLP-1。

8.一种抗炎药物，其特征在于，包含权利要求1所述非淀粉百合多糖NSLP-1。

9.根据权利要求6所述调节剂或权利要求7-8任一所述药物，其特征在于，还包含药学上可接受的载体，制成不同的剂型。

10.根据权利要求9所述调节剂或药物，其特征在于，所述剂型包括片剂、口服液、颗粒剂、胶囊剂、煎膏剂。

Images