CN100572397C

CN100572397C - 一种增强免疫力的百合多糖的制备方法

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Publication number: CN100572397C
Application number: CNB2008100972436A
Authority: CN
Inventors: 张继; 高义霞; 郭红云; 侯天德; 王云普; 程昉; 梁树斌; 刘忠旺
Original assignee: Northwest Normal University
Current assignee: Lanzhou source of Bio Technology Development Co., Ltd.
Priority date: 2008-05-07
Filing date: 2008-05-07
Publication date: 2009-12-23
Anticipated expiration: 2028-05-07
Also published as: CN101270167A

Abstract

一种增强免疫力的百合多糖的制备方法，该方法是以百合鳞茎为原料，经过提取、纯化、分离、脱蛋白等步骤制备出一种增强免疫力的天然多糖；本发明具有如下的有益效果：本发明充分利用甘肃兰州境内大面积种植植物百合的鳞茎，制成纯天然多糖，与其它增强免疫产品相比，具有生产工艺简单，使用方便，无毒副作用，效果好等优点，且特色优势明显，资源储量充足，市场前景十分看好，经济效益广阔。

Description

一种增强免疫力的百合多糖的制备方法

技术领域

本发明涉及一种增强免疫力的百合多糖的制备方法。

背景技术

免疫力就是人体以免疫器官和免疫球蛋白为物质基础，抵抗疾病，维持机体生理平衡的能力。它能通过人体免疫系统来识别人体内正常与不正常的微生物，并通过免疫应答来排除内、外致病微生物和变性、衰老的细胞。免疫系统是机体健康的坚强保障，但是免疫系统又是很脆弱的。具体如：遗传与疾病因素，如镰状细胞贫血、糖尿病、爱滋病、病毒性感染、癌症等；医疗和药物因素，如癌症病人的手术放疗、化疗、烧伤和皮切除、外用皮质类激素等；亚健康状态：免疫力低下是亚健康人群表现的重要特征，这几年亚健康人群成逐年上升趋势，特别是知识分子、领导干部、白领阶层等人群，亚健康人群人数超60％；人的不良生活方式和正常衰老会导致免疫功能下降。所以免疫系统它需要不断的维护和加强，这是二十一世纪保健新概念，因此寻找具有良好免疫调节作用的药物已成为当代新药研制的发展方向之一。

专利CN10106972申请了有以下原料药制成的一种口服液：淫羊藿、黄芪、山药、杜仲、枸杞子、山楂、当归、茯苓、覆盆子和酸枣仁，具有抗疲劳和增强免疫力的功效；专利CN1813787申请了一种具有免疫增强作用的参芪多糖组合物及其制备方法；专利CN10100281申请了一种新型淫蜂复方中药成分免疫增强剂，属于增强畜禽免疫功能的新型免疫增强剂；专利CN 1739790申请了肽聚糖免疫增强剂及其生产方法；专利CN1200272申请了一种以工蜂胎为主要原料制成的能抑制肿瘤生长的免疫增强剂；专利CN 1220999申请了丝状蓝藻水溶性多糖及胞外多糖的提取分离方法，具有很强的补体激活活性和很高的粘度，可用作免疫增强剂和食品工业中的增稠剂；专利CN 1099993申请了由金凤血、雄蚕蛾、花粉多糖、香菇多糖、白花蛇舌草、金银花、板兰根、穿心莲、黄芪、三七参等组成的生物免疫增强剂抗癌平，含有人体多种生理生物活性物质，增强多种免疫功能，使原来免疫功能低下或免疫功能缺陷获得了重建，是抑制和治疗早中期肿瘤、癌症的理想药物；专利CN 1114207申请了一种以茶多酚复合体为主要原料，对体内过量自由基毒性反应引起疾病均具显著疗效的免疫增强剂；日本专利03819036公开了，二氢吡唑并吡啶化合物表现出选择性的和强烈的对糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)的抑制活性，并可用作药物，用于预防和/或治疗糖尿病、糖尿病并发症和神经退化病，或作为免疫增强剂。

兰州百合营养丰富，是全国四大百合品系(江苏宜兴、河南洛阳、湖南龙牙、甘肃兰州)中唯一可食用的品系，也是中国唯一的甜百合。在养阴清肺、清心安神、补中益气，治疗阴虚久咳、虚烦、失眠等方面有很高的药用价值。我国著名植物分类学家孔宪武认为：“兰州百合味极甜美，纤维很少，又毫无苦味，不但闻名全国，亦可称世界第一”。

但是，而以兰州百合为原料制备一种增强免疫力的百合多糖的方法还未见文献提及。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种增强免疫力的百合多糖的制备方法。本发明的方法是以百合鳞茎为原料，经过提取、纯化、分离、脱蛋白等步骤制备的一种增强免疫力的天然多糖，可明显提高免疫功能低下小鼠巨噬细胞的吞噬能力，促进其非特异性免疫功能，拮抗环磷酰胺及恢复T细胞介导的细胞免疫反应，提高T淋巴细胞的应答功能，即对非特异性免疫和特异性免疫(体液免疫和细胞免疫)均有显著的影响。与其它增强免疫产品相比，具有生产工艺简单，使用方便，无毒副作用，效果好等优点，且特色优势明显，资源储量充足，市场前景十分看好，经济效益广阔。

为解决上述技术问题，本发明一种增强免疫力的百合多糖的制备方法，包括如下步骤：

1)称取一定量的鲜百合，粉碎，加水，所述鲜百合与水的比例为1∶8～12；在功率55～65W，温度65～75℃的条件下，用超声波提取80～120分钟；在0.07～0.09MPa的压力下抽滤；滤渣在上述条件下再提取1次；合并2次滤液，滤液在60～70℃，0.07～0.09MPa的条件下减压浓缩至原体积的1/2.5～3.5，往浓缩液中加入乙醇，所述乙醇含量占加入乙醇后溶液总体积的75～80％，在室温下静置10～12小时，在3500～4500转/分钟的转速下离心4～6分钟，收集沉淀；然后在40～55℃，0.07～0.09MPa的条件下干燥22～26小时，得物质A；

2)在60～70℃水浴温度下，将物质A用80～120倍重量的水进行溶解，在3500～4500转/分钟的转速下离心4～6分钟，弃去不溶物；反复离心直至溶液中用碘-碘化钾法检测不出淀粉为止，离心后的溶液中加入乙醇，所述乙醇含量占加入乙醇后溶液总体积的75～80％，静置10～12小时，在3500～4500转/分钟的转速下离心4～6分钟，收集沉淀物；然后在40～55℃，0.07～0.09MPa的条件下干燥20～24小时，得物质B；

3)在60～70℃水浴温度下，将物质B用80～100倍重量的水进行溶解，加入3～6u/100ml木瓜蛋白酶酶解10～12小时，再用体积比为1∶3～5的氯仿和正丁醇混合液进行萃取3～5次，收集上层水溶液；在40～50℃，0.07～0.09MPa的条件下减压浓缩至原体积的1/2.5～3.5；将浓缩液放入截留分子量8000～14000Da透析袋中透析，流水冲洗透析20～28小时，然后蒸馏水冲洗透析20～24小时；然后往袋内透析液中加入乙醇，所述乙醇含量占加入乙醇后溶液总体积的75～80％，静置10～12小时；在3500～4500转/分钟的转速下离心4～6分钟，收集沉淀；沉淀物依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，然后在40～55℃，0.07～0.09MPa的条件下干燥18～20小时，得百合多糖。利用本发明的方法，100g鲜百合可制得2.8～3.3g百合多糖。

本发明的方法制备的百合多糖物化特性如下：

颜色：白色粉末状固体；

比浓粘度：为81.698cm³/g；

PH值：6.93。

百合多糖经过紫外扫描，在200nm处有强吸收峰，在260nm、280nm均无核酸和蛋白质的特征吸收峰，说明不含有核酸和蛋白质等杂质；茚三酮反应、碘-碘化钾反应和双缩脲反应均为阴性，说明无蛋白质和淀粉；红外光谱显示在3432cm^-1处有一特征峰为O-H的伸缩振动峰，在2925cm-1处有一特征峰是分子中C-H键的变角振动引起的，874.47cm-1则为β-D-吡喃葡萄糖吸收峰，这些吸收峰是糖的特征吸收峰；用苯酚硫酸法测定总糖含量为96.84％；采用乌氏粘度计测定其粘均分子量为20093.12；斐林试剂反应和硫酸-苯酚反应为阳性，说明多糖为还原性多糖；使用不同浓度乙醇沉淀的多糖，在20℃时具有不同的旋光度，表明该多糖非均一组分；热分析表明百合多糖熔点、玻璃化温度不明显，无晶型转变温度，为无定性粉末。

本发明的方法制备出的百合多糖增强免疫力实验：

昆明小鼠，体重18-22g，雄性，按体重平均为6组，每组10只，分组及灌胃剂量如表1。各组按20ml/kg灌胃，每日1次，连续7-14天，2天称一次体重。给药第2天，根据不同实验，腹腔或皮下注射环磷酰胺2-3天，累计120-160mg/kg建立免疫低下模型。测定其吞噬细胞的廓清指数、免疫器官重量、迟发型超敏反应引起的耳肿胀度、PHA刺激淋巴细胞转化率及血清溶血素。

表1分组及灌胃剂量

结果如附图4～7所示，百合多糖可明显提高免疫功能低下小鼠巨噬细胞的吞噬能力，促进其非特异性免疫功能；能显著恢复免疫功能低下小鼠的DTH反应以及拮抗Cy降低的DTH，使小鼠的耳肿胀度恢复，显著提高PHA刺激淋巴细胞转化，即提高T淋巴细胞的应答功能，增强机体特异性细胞免疫的功能；百合多糖可显著地恢复免疫低下动物血清溶血素OD值，提高特异性体液免疫功能。百合多糖对于免疫抑制小鼠，对其非特异性免疫和特异性免疫(体液免疫和细胞免疫)均有增强作用，可明显拮抗环磷酰胺引起的免疫抑制。

本发明有益效果如下：

本发明充分利用甘肃兰州境内大面积种植植物百合的鳞茎，制成纯天然多糖，与其它增强免疫产品相比，具有生产工艺简单，使用方便，无毒副作用，效果好等优点，且特色优势明显，资源储量充足，市场前景十分看好，经济效益广阔。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明

图1为本发明制备出的百合多糖的红外扫描图；

图2为本发明制备出的百合多糖的热分析图；

图3为本发明制备出的百合多糖紫外扫描图；

图4为本发明制备出的百合多糖对免疫低下小鼠廓清指数(K)的影响；

图5为本发明制备出的百合多糖对免疫低下小鼠耳肿胀度的影响；

图6为本发明制备出的百合多糖对免疫低下小鼠淋巴细胞转化率的影响；

图7为本发明制备出的百合多糖对免疫低下小鼠血清溶血素的影响。

注：在图4～7中，*表示P＜0.05(显著)；**表示P＜0.01(极显著)。

具体实施方式

实施例1

本发明一种增强免疫力的百合多糖的制备方法，包括如下步骤：

1)称取一定量的鲜百合，粉碎，加水，所述鲜百合与水的比例为1∶8；在功率55W，温度65℃的条件下，用超声波提取80分钟；在0.07MPa的压力下抽滤；滤渣在上述条件下再提取1次；合并2次滤液，滤液在60℃，0.07MPa的条件下减压浓缩至原体积的1/2.5，往浓缩液中加入乙醇，所述乙醇含量占加入乙醇后溶液总体积的75％，在室温下静置10小时，在3500转/分钟的转速下离心4分钟，收集沉淀；然后在40℃，0.07MPa的条件下干燥22小时，得物质A；

2)在60℃水浴温度下，将物质A用80倍重量的水进行溶解，在3500转/分钟的转速下离心4分钟，弃去不溶物；反复离心直至溶液中用碘-碘化钾法检测不出淀粉为止，离心后的溶液中加入乙醇，所述乙醇含量占加入乙醇后溶液总体积的75％，静置10小时，在3500转/分钟的转速下离心4分钟，收集沉淀物；然后在40℃，0.07MPa的条件下干燥20小时，得物质B；

3)在60℃水浴温度下，将物质B用80倍重量的水进行溶解，加入3u/100ml木瓜蛋白酶酶解10小时，再用体积比为1∶3的氯仿和正丁醇混合液进行萃取3次，收集上层水溶液；在40℃，0.07MPa的条件下减压浓缩至原体积的1/2.5；将浓缩液放入截留分子量8000～14000Da透析袋中透析，流水冲洗透析20小时，然后蒸馏水冲洗透析20小时；然后往袋内透析液中加入乙醇，所述乙醇含量占加入乙醇后溶液总体积的75％，静置10小时；在3500转/分钟的转速下离心4分钟，收集沉淀；沉淀物依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，然后在40℃，0.07MPa的条件下干燥18小时，得百合多糖。

实施例2

1)称取一定量的鲜百合，粉碎，加水，所述鲜百合与水的比例为1∶12；在功率65W，温度75℃的条件下，用超声波提取120分钟；在0.09MPa的压力下抽滤；滤渣在上述条件下再提取1次；合并2次滤液，滤液在70℃，0.09MPa的条件下减压浓缩至原体积的1/3.5，往浓缩液中加入乙醇，所述乙醇含量占加入乙醇后溶液总体积的80％，在室温下静置12小时，在4500转/分钟的转速下离心6分钟，收集沉淀；然后在55℃，0.09MPa的条件下干燥26小时，得物质A；

2)在70℃水浴温度下，将物质A用120倍重量的水进行溶解，在4500转/分钟的转速下离心6分钟，弃去不溶物；反复离心直至溶液中用碘-碘化钾法检测不出淀粉为止，离心后的溶液中加入乙醇，所述乙醇含量占加入乙醇后溶液总体积的80％，静置12小时，在4500转/分钟的转速下离心6分钟，收集沉淀物；然后在55℃，0.09MPa的条件下干燥24小时，得物质B；

3)在70℃水浴温度下，将物质B用100倍重量的水进行溶解，然后加入6u/100ml木瓜蛋白酶酶解12小时，再用体积比为1∶5的氯仿和正丁醇混合液进行萃取5次，收集上层水溶液；在50℃，0.09MPa的条件下减压浓缩至原体积的1/3.5；将浓缩液放入截留分子量8000～14000Da透析袋中透析，流水冲洗透析28小时，然后蒸馏水冲洗透析24小时；然后往袋内透析液中加入乙醇，所述乙醇含量占加入乙醇后溶液总体积的80％，静置12小时；在4500转/分钟的转速下离心6分钟，收集沉淀；沉淀物依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，然后在55℃，0.09MPa的条件下干燥20小时，得百合多糖。

实施例3

1)称取一定量的鲜百合，粉碎，加水，所述鲜百合与水的比例为1∶10；在功率60W，温度70℃的条件下，用超声波提取100分钟；在0.08MPa的压力下抽滤；滤渣在上述条件下再提取1次；合并2次滤液，滤液在65℃，0.08MPa的条件下减压浓缩至原体积的1/3，往浓缩液中加入乙醇，所述乙醇含量占加入乙醇后溶液总体积的78％，在室温下静置11小时，在4000转/分钟的转速下离心5分钟，收集沉淀；然后在45℃，0.08MPa的条件下干燥24小时，得物质A；

2)在65℃水浴温度下，将物质A用100倍重量的水进行溶解，然后在4000转/分钟的转速下离心5分钟，弃去不溶物；反复离心直至溶液中用碘-碘化钾法检测不出淀粉为止，离心后的溶液中加入乙醇，所述乙醇含量占加入乙醇后溶液总体积的78％，静置11小时，然后在4000转/分钟的转速下离心5分钟，收集沉淀物；然后在45℃，0.08MPa的条件下干燥22小时，得物质B；

3)在65℃水浴温度下，将物质B用90倍重量的水进行溶解，加入5u/100ml木瓜蛋白酶酶解11小时，再用体积比为1∶4的氯仿和正丁醇混合液进行萃取4次，收集上层水溶液；在45℃，0.08MPa的条件下减压浓缩至原体积的1/3；将浓缩液放入截留分子量8000～14000Da透析袋中透析，流水冲洗透析24小时，蒸馏水冲洗透析22小时；往袋内透析液中加入乙醇，所述乙醇含量占加入乙醇后溶液总体积的78％，静置11小时；在4000转/分钟的转速下离心5分钟，收集沉淀；沉淀物依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤两次，然后在45℃，0.08MPa的条件下干燥19小时，得百合多糖。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims

1、一种增强免疫力的百合多糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

3)在60～70℃水浴温度下，将物质B用80～100倍重量的水进行溶解，加入3～6u/100ml木瓜蛋白酶酶解10～12小时，再用体积比为1∶3～5的氯仿和正丁醇混合液进行萃取3～5次，收集上层水溶液；在40～50℃，0.07～0.09MPa的条件下减压浓缩至原体积的1/2.5～3.5；将浓缩液放入截留分子量8000～14000Da透析袋中透析，流水冲洗透析20～28小时，然后蒸馏水冲洗透析20～24小时；然后往袋内透析液中加入乙醇，所述乙醇含量占加入乙醇后溶液总体积的75～80％，静置10～12小时；在3500～4500转/分钟的转速下离心4～6分钟，收集沉淀；沉淀物依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，然后在40～55℃，0.07～0.09MPa的条件下干燥18～20小时，得百合多糖。