CN113185618B - 一种抗酒精性肝损伤的白术多糖及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗酒精性肝损伤的白术多糖及其制备方法，该白术多糖由摩尔比为6.8:3.0:1.0的葡萄糖、甘露糖和木糖组成；其分子量为5465Da；白术多糖的一级结构为：βXylp‑[(1→3)‑βXylp]6‑(1→6)‑αGlcp‑[(1→4)‑αGlcp]40‑[(1→2)‑αManp]12。实验结果表明：白术多糖对小鼠急性酒精性肝损伤具有明显的保护作用，能显著抑制乙醇急性肝损伤所引起的血清AST、ALT和TG活性的升高，有效地抑制酒精摄入所引起的肝脏指数的升高、肝脏中MDA含量的升高、SOD和GSH‑Px活性的降低，能有效缓解小鼠的酒精性肝损伤症状，这表明白术多糖对乙醇诱导的小鼠急性肝损伤有较好的保护作用。

Description

一种抗酒精性肝损伤的白术多糖及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种植物多糖，具体涉及一种抗酒精性肝损伤的白术多糖及其制备方法。
背景技术
酒精性肝病(Alcoholic Hepatitis)是由于长期大量饮酒导致的肝脏疾病。初期通常表现为脂肪肝，进而可发展成酒精性肝炎、肝纤维化和肝硬化，甚至会发展为肝癌。酒精性肝病发病率及病死率呈逐年上升趋势，已成为全球性的公共卫生问题。目前，在全球范围内每年因酒精中毒死亡人数约250万，占总死亡率的4％，超过了艾滋病成为第八大致死因素，酒精已成为仅次于肝炎病毒的第二大肝损害病因，给个人、家庭及社会带来沉重的经济负担。在中国尚未进行过酒精性肝病全国范围的调查，只有部分地区的酒精性肝病研究。研究显示，中国普通成年人中，常规饮酒者的比例从2000年的27.0％上升到2015年的66.2％，重度饮酒者的比例从1982年的0.21％上升到2000年的14.8％，酒精性肝病的患病率从2000年的2.27％增加到2015年的8.74％。在可预见的未来，中国慢性肝病患者中ALD发病率和致死率将继续增加，因此对于酒精性肝病的预防和治疗迫在眉睫。
酒精性肝损伤是酒精性肝病发生发展的始动环节和共同途径，因此，对抗酒精性肝损伤对于各种酒精性肝病的治疗非常关键。
中药中寻找保肝护肝药物是保护酒精性肝损伤的一个重要方向。白术(Atractylodes macrocephala Koidz.)别名桴蓟、于术、冬白术、淅术、杨桴、吴术、片术、苍术等，多年生菊科草本植物，根茎入药，主要分布于四川、云南、贵州等山区湿地。其中以浙江於潜产者质量最佳，被称为“於术”。味苦、甘，性温，归脾、胃经。具有健脾益气、燥湿利水、止汗、安胎的功效，主要用于脾虚食少、腹胀泄泻、痰饮眩悸、水肿、自汗及胎动不安。
古有记载，金元时期重要的医家王好古对白术功能主治这样子描述：“理中益脾，补肝风虚，主舌本强，食则呕，胃脘痛，身体重，心下急痛，心下水痞，冲脉为病，逆气里急，脐腹痛”。现代研究表明白术含有多种有效成分，具有多种药理作用，在临床中应用广泛。发现白术中的主要药效成分为挥发性成分、多糖类、内酯类、黄酮类、苷类等。针对白术化学成分的研究多集中在内酯类、挥发性成分及多糖类。文献研究发现，没有看到白术多糖对酒精性肝损伤保护作用研究。
因此，本发明旨在分离纯化得到具有抗酒精性肝损伤且结构明确的白术多糖。本发明对白术粗多糖进行分离纯化，为将来的产业化生产提供全面的技术参考和借鉴。本发明对白术多糖的多糖含量、分子量、单糖组成、结构特点进行研究得到其一级化学结构，为其进一步构效关系研究以及药理活性的深入研究奠定一定的基础。
发明内容
发明目的：本发明的目的是为通过系统分离纯化白术多糖，并经过分子量、单糖组成、结构特点确定其一级结构，并通过药理实验筛选出具有防治肝损伤的白术多糖。
技术方案：为了实现以上目的，本发明采用的技术方案为：
一种抗酒精性肝损伤的白术多糖，该白术多糖由摩尔比为6.8:3.0:1.0的葡萄糖、甘露糖和木糖组成；其分子量为5465Da；白术多糖的一级结构为：βXylp-[(1→3)-βXylp]6-(1→6)-αGlcp-[(1→4)-αGlcp]40-[(1→2)-αManp]12。
本发明所述的抗酒精性肝损伤的白术多糖的制备方法，包括以下步骤：(1)白术粗多糖提取；(2)大孔树脂脱色；(3)对脱色后的多糖进行DEAE阴离子交换层析；(4)对DEAE阴离子交换层析液进行透析得到。
作为优选方案，以上所述的抗酒精性肝损伤的白术多糖的制备方法，包括以下步骤：
(1)白术粗多糖提取：
取白术药材，粉碎，加入药材6～20倍量的水提取1～3次，每次1～2小时，合并提取液，浓缩，得浓缩液，加入乙醇使乙醇浓度为60～85％，放置沉淀，过滤或离心，干燥，得到白术粗多糖；
(2)大孔树脂脱色：
取步骤(1)白术粗多糖，加水溶解，得到浓度25mg/mL白术粗多糖溶液，调多糖溶液的pH值为6，加入HPD600大孔树脂柱，置于摇床中，125r/min、在温度75℃脱色、脱色时间6h，3000r/min离心3～5min，取上清液，浓缩；备用；
(3)对脱色后的多糖进行DEAE阴离子交换层析：
取步骤(2)大孔树脂脱色后的白术粗多糖浓缩液，进行离子交换层析，采用AKTAPurifier-100生物大分子纯化系统进行分离；采用上样泵自动进样，流速设置为1mL/min；依次用蒸馏水、0.01M NaCl、0.1M NaCl和1M NaCl进行阶段梯度洗脱，3mL/min，每个梯度洗3BV，每管收集2min，6mL，采用苯酚-硫酸法测定每管糖含量，绘制洗脱曲线；进样前用5BV的纯水进行柱平衡，流速设置为3mL/min；进样完毕后采用0.1M NaCl以较高流速3min/mL洗脱未吸附物，洗脱3BV后换用纯水继续洗脱吸附物，洗脱体积为3BV；合并洗脱液，将洗脱液浓缩；
(4)对DEAE阴离子交换层析液进行透析：取步骤(3)DEAE阴离子交换层析的洗脱液，稀释成200mg/mL装入透析袋进行透析24h，每隔4h换一次水，透析完成后冷冻干燥得白术多糖。
本发明所述的白术多糖在制备防治酒精性肝损伤药物或保健品中的应用。
发明可将白术多糖和药学上可接受的载体制成片剂、胶囊剂、颗粒剂或丸剂剂型的药物。
本发明在制成片剂时，在白术多糖中添加载体乳糖或玉米淀粉，需要时加入润滑剂硬脂酸镁，混合均匀，然后压片制成片剂。
在制成胶囊剂时，将白术多糖和载体乳糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，然后装胶囊制成胶囊剂。
本发明在制成颗粒剂时，把白术多糖和稀释剂乳糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，干燥，制成颗粒剂。
有益效果：本发明提供的白术多糖和现有技术相比具有以下优点：
1、本发明通过大量实验筛选，从白术中分离得到特定摩尔比的葡萄糖、甘露糖和木糖组成特定分子量的白术多糖(BZJP)。
2、药理实验结果表明：白术多糖对小鼠急性酒精性肝损伤具有明显的保护作用，能显著抑制乙醇急性肝损伤所引起的血清AST、ALT和TG活性的升高，有效地抑制肝损伤所引起的肝脏指数的升高、肝脏中MDA含量的升高、SOD和GSH-Px活性的降低，能缓解小鼠的肝损伤，这表明白术多糖对乙醇诱导的小鼠急性肝损伤有较好的保护作用。
3、本发明通过大量实验筛选具体的分离纯化步骤：主要进行了三步：大孔树脂脱色工艺的优化得到最佳脱色工艺(大孔树脂类型为HPD600、样品浓度25mg/mL、样品pH 6、脱色温度75℃、脱色时间6h)，在此条件下，脱色率和回收率可分别达79.75％和80.31％；对脱色后的多糖进行DEAE阴离子交换层析分析，发现BZTP主要由两个组分BZTP-1和BZTP-2组成，对丰量组分BZTP-1进行收集；最后对BZTP-1进行透析得到纯度为97.21％、几乎不含蛋白质、HPGPC谱图呈单一峰的均质多糖。
BZJP结构鉴定：通过高效凝胶渗透色谱法、氨基柱法、PMP柱前衍生化法、气相色谱法、红外光谱法、甲基化分析法、核磁共振波谱等对BZJP进行结构分析。高效凝胶渗透色谱法表明BZJP为单一组分，可得其相对分子量为5465Da；氨基柱法、PMP衍生化法及气相色谱法表明BZJP主要由葡萄糖(Glucose,Glc)、甘露糖(Mannose,Man)和木糖(Xylose,Xyl)组成，气相色谱法对其进行摩尔比测定，Glc:Man:Xyl＝6.8:3.0:1.0；红外色谱法确定BZJP是含有D-葡萄吡喃环及β-端基差向异构的多糖；甲基化分析和核磁结果也得出了BZJP的一级结构式。
附图说明
图1为白术多糖(BZTP)经DEAE-纤维素色谱柱的梯度洗脱曲线。
图2为白术多糖(BZTP)葡聚糖凝胶色谱图。
图3为BZJP的1H-NMR图。
图4为BZJP的13C-NMR图。
图5为BZJP的HMBC图。
图6为白术多糖对急性酒精性肝损伤小鼠模型肝组织的影响(HE，×100)。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1白术多糖的制备方法
一、白术粗多糖提取：
取白术药材，粉碎，加入药材15倍量的水提取3次，每次1小时，合并提取液，浓缩，得浓缩液，加入乙醇使体系乙醇终浓度为80％，放置沉淀，过滤或离心，干燥，得到白术粗多糖；
二、大孔树脂脱色：
取步骤(1)白术粗多糖，加水溶解，得到浓度25mg/mL白术粗多糖溶液，调多糖溶液的pH值为6，加入HPD600大孔树脂柱，置于摇床中，125r/min、在温度75℃脱色、脱色时间6h，3000r/min离心3min，取上清液，浓缩，备用；
三、DEAE-52 Cellulose层析柱层析和透析
1.材料与方法
1.1材料与仪器
Cellulose DE-52(北京索莱宝科技有限公司)；氯化钠，氢氧化钠，盐酸，硫酸，苯酚，乙醇，碳酸氢钠，乙二胺四乙酸(EDTA)等均为国产分析纯。
AKTA Purifier100生物大分子纯化系统(GE公司)；透析袋(北京索莱宝科技有限公司)；RE-52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；Milli-Q Synthesis 108超纯水仪(美国Millopore公司)；Sartorius CPA225D电子天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司)；Telstar LyoQuest实验室冻干机(新飞达仪器)。
1.2实验方法
1.2.1 DEAE-52 Cellulose的预处理及再生
DEAE-52 Cellulose预处理：按照北京索莱宝科技有限公司提供的使用说明书，在装柱前5h左右，称取理论所需量的DEAE-52 Cellulose填料在室温条件放置3h使其温度恢复到室温，避免装柱子的时候因为温度变化而使柱子里面出现气泡而导致装柱失败，最后，用20％乙醇在室温下溶胀1h，即可。
1.2.2 AKTA Purifier-100生物大分子纯化系统分析白术多糖(BZTP)组成
配制20mg/mL步骤(2)脱色后的白术粗多糖溶液，14000rpm离心10min，取上清液10mL进行离子交换层析，采用AKTA Purifier-100生物大分子纯化系统进行分离。采用上样泵自动进样，流速设置为1mL/min；依次用不同浓度NaCl(蒸馏水、0.01、0.1和1M NaCl)进行阶段梯度洗脱，3mL/min，每个梯度洗3BV，每管收集2min，6mL，采用苯酚-硫酸法测定每管糖含量，绘制洗脱曲线；进样前用5BV的纯水进行柱平衡，流速设置为3mL/min；进样完毕后采用大浓度(0.1M NaCl)以较高流速(3min/mL)洗脱未吸附物，洗脱3BV后换用纯水继续洗脱吸附物，洗脱体积为3BV，得到两个多糖组分(图1，分别命名为BZTP-1和BZTP-2，由于BZTP-2含量较低，故接下来只对BZTP中丰量组分BZTP-1浓缩，冷冻干燥，备用。
四、透析处理
透析袋使用前处理：按照北京索莱宝科技有限公司提供的使用说明书，首先配制适合体积2％(W/V)的碳酸氢钠和pH为8.0的1mmol/L的EDTA标为溶液1，再单独配制pH为8.0的1mmol/L的EDTA标为溶液2，将两个溶液溶解混匀并煮沸；将透析袋剪下12cm左右，按照需要确定剪下的长度以及个数；首先将剪好的透析袋浸入溶液1中，煮沸10min后拿出，用蒸馏水反复冲洗，直至表面充满蒸馏水，再浸入溶液2中，煮沸10min后拿出，用蒸馏水反复冲洗，直至表面充满蒸馏水，最后用超纯水将其洗干净，放入超纯水中备用。
对白术粗多糖BZTP-1组份进行透析：配制10mL 200mg/mL白术粗多糖BZTP-1溶液透析24h，每隔4h换一次水，透析完成后冷冻干燥得白术精制多糖(BZJP)。
实施例2白术多糖的结构鉴定
一、纯度鉴定及相对分子质量测定
1.材料与方法
1.1材料与仪器
实施例1制备得到的白术多糖(BZJP)，右旋糖酐分子量标准套(10种)，包括右旋糖酐DO Mp180，右旋糖酐D1 Mp2700，右旋糖酐D2 Mp5250，右旋糖酐D3 Mp9750，右旋糖酐D4Mp13050，右旋糖酐D5 Mp36800，右旋糖酐D6 Mp64650，右旋糖酐D7 Mp135350，右旋糖酐D8Mp300600，右旋糖酐D2000 Mp2000000(中国食品药品检定研究院)；考马斯亮蓝G-250，牛血清白蛋白，苯酚，硫酸，磷酸等均为国产分析纯。
101-00B型电热恒温干燥箱(绍兴市上虞区泸越仪器设备厂)；Agilent 1260型高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)。
1.2实验方法
1.2.1总糖含量测定
采用苯酚硫酸法对BZJP的总糖含量进行测定。
(1)溶液的制备
5％苯酚溶液：精密称取苯酚50mg，置1mL棕色容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，即得。
葡萄糖系列标准溶液：分别精密吸取标准溶液(1mg/mL)0、40、80、120、160、200μL至2mL容量瓶中，加水稀释至刻度，即得葡萄糖系列标准溶液0、20、40、60、80、100μg/mL。
BZJP待测溶液：配制10mg/mL待测溶液10mL，取0.01mL配好的待测溶液稀释至2mL，即得反应溶液50μg/mL。
(2)苯酚硫酸法测多糖含量
取配制好的BZJP待测溶液和葡萄糖系列标准溶液200μL于具塞试管中，冰水浴中加入苯酚100μL，摇匀，加硫酸500μL，摇匀，沸水浴加热15min，取出，冰水浴10min。用酶标仪在490nm处测定吸光度。
1.2.2蛋白含量测定
采用考马斯亮蓝法对BZJP中所含蛋白质的量进行测定。
(1)溶液的制备
考马斯亮蓝G-250溶液：精密称取考马斯亮蓝G-250 10.00mg，将称好的考马斯亮蓝加入100mL容量瓶中，再加入95％乙醇5mL，再一次加入85％磷酸10mL，最后用蒸馏水定容，摇匀，最终试剂含0.01％考马斯亮蓝G-250，4.7％乙醇，8.5％磷酸，置于棕色瓶中备用。
蛋白质系列标准溶液：精确称取牛血清白蛋白10.00mg，将称量好的牛血清白蛋白加入10mL的容量瓶中，先加少量蒸馏水溶解混匀，再加入蒸馏水定容，即得1mg/mL蛋白质标准母液。分别精密吸取母液0、40、80、120、160、200、240μL于2mL容量瓶中，定容，混匀，即得牛血清白蛋白系列标准溶液0、20、40、60、80、100μg/mL。
BZJP待测溶液：精密称取取10mg待测样品于1mL容量瓶中，稀释至刻度线，即得10mg/mL待测溶液，备用。
(2)考马斯亮蓝法测多糖中蛋白质含量
取牛血清白蛋白系列标准溶液及BZJP待测溶液分别100μL于具塞试管中，加入考马斯亮蓝G-250溶液500μL，混匀，放置10min，用酶标仪在595nm处测定吸光度。
1.2.3高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)
采用凝胶色谱柱和高效液相色谱仪(HPLC)对多糖进行分子量分布测定以及纯度鉴定。
(1)标准曲线绘制：用分子量为9750、13050、36800、64650、135350、300600、20000000的右旋糖酐制作分子量标准曲线。
(2)样品测定：取适量干燥多糖样品，溶解于超纯水中，配置成浓度为2mg/mL的糖液，用水系微孔滤膜过滤后上机测定。
(3)HPLC条件：进样体积为20μL，流动相为20mM乙酸铵，流速为0.5mL/min，色谱柱为凝胶色谱柱(GPC)，柱温为40℃，检测器为蒸发光散射检测器(ELSD)。
(4)ELSD条件：喷雾器温度为30℃，漂移管温度为115℃，氮气压力为1.6SLM。
2.结果与分析
2.1 BZJP总糖含量及蛋白质含量
采用苯酚硫酸法测得的葡萄糖标准曲线，分析可得y＝0.0022x+0.0437，R2＝0.9939，线性关系较好，将BZJP吸光度代入标准曲线中并经过计算可知BZJP总糖含量为97.12％。采用考马斯亮蓝法测得的蛋白标准曲线，y＝0.0029x+0.456，R2＝0.9959，表明数据线性相关性较好，将BZJP吸光度带入标准曲线并经过计算得出BZJP的蛋白含量分别为0.08％。
2.2高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)
如表1所示，不同分子量标准品的保留时间与其分子量的对数值表葡聚糖标准品的保留时间tR为横坐标，分子量的对数值Lg Mw为纵坐标，得葡聚糖标准品回归方程y＝-0.2523x+8.8699，R2＝0.994。如图2所示，BZJP为单一峰，为单一组分，保留时间代入标准曲线算得其相对分子量为5465Da。
表1葡聚糖标准品高效液相色谱分析结果
分子量Mw Lg Mw 保留时间
9750 3.989 18.946
13050 4.116 18.837
36800 4.566 17.287
64650 4.811 16.19
135350 5.131 15.158
300600 5.478 13.356
2000000 6.301 10.024
。
二、核磁共振结构鉴定
1.材料与方法
1.1材料与仪器
D2O为NMR专用重水，纯度99.9％(美国Millopore公司)；BRUKER 500M核磁仪(瑞士布鲁克公司)。
1.2实验方法
将50mg白术多糖样品BZJP溶解于1mL的D2O中，冷冻干燥交换3次，最后将样品溶于0.7mLD2O后，离心，置于5mm核磁管中，在室温下记录一维NMR(1H-NMR、13C-NMR)和二维NMR(1H-1HCOSY、HSQC、HMBC)图谱。
2.结果与分析
自从核磁共振(NMR)技术引入到多糖结构解析中，多糖结构的可解性就增大了可能性。核磁共振氢谱(H谱)结合核磁共振碳谱(C谱)确定残基种类数，再结合氢氢相关谱(H-H COSY)和HSQC谱确定不同残基的碳氢原子的化学位移，根据化学位移推测残基种类。异核多量子相关谱(HMQC)谱判断残基之间的连接，结合甲基化结果即可对多糖的一级结构进行完全解析。只是由于多糖是生物大分子，结构较为复杂，谱图较为复杂，解析难度较大，因此，不是所有多糖做了核磁共振波谱都能够得到相应的一级结构。本发明通过H谱、C谱、1H-1HCOSY及HSQC谱，对BZJP糖残基的碳原子和氢原子的化学位移进行归属，然后用HMBC确认其连接顺序。图3至图5为BZJP的1H NMR、13C NMR、和HMBC图谱，表2是利用1H-1H COSY和HSQC解析BZJP中结构单元的核磁信号归属。
2.1 1H-NMR分析
多糖一级结构中糖苷键的构型主要从1H-NMR中进行确定。多糖的1H-NMR谱图中C2～C6质子共振峰基本在3.0～4.8ppm的范围内，这部分信号相互重叠，难以分辩，所以主要在该图4.0～5.5ppm中看C1上的质子，即异头氢。通常β-型吡喃糖C上质子化学位移值小于4.8ppm，而α-型则大于4.8ppm。呋喃糖C1上质子化学位移约为5.4ppm，据此可判断构型。
BZJP的1H-NMR图谱如图3所示。由图3可以看出，5.4ppm处无信号出现，即5.4ppm处无质子，即，没有呋喃型糖。在H谱中有5个异头氢的共振峰,其化学位移5.30ppm、5.14ppm、4.87ppm、4.55ppm和4.39ppm，表明BZJP共有5种糖残基(糖残基数与甲基化结果相一致)。将5种糖残基分别命名为A、B、C、D、E，A和B残基异头氢化学位移均大于4.8ppm，表明A、B和C糖残基均为α-型吡喃糖，D和E两种残基异头氢化学位移均小于4.8ppm，表明D和E均为β-型吡喃糖。其余的在3.0～4.0ppm之间的信号属于糖骨架的质子峰，为C2～C6上质子峰。
糖残基异头氢信号峰面积大小，反映的是该残基在多糖中含量的多少。对残基异头氢峰面积进行积分，得到A:B:C:D:E＝40:1:12:1:6。
2.2 13C-NMR分析
13C-NMR异头碳共振吸收峰位置大概在90～105ppm，C2-C6共振吸收峰的位置大概在60～90ppm，C6共振吸收峰一般在60ppm。由于异头碳的种类与糖残基种类数目相对应，故90～105ppm间峰的个数即为糖残基种类数。
图4所示，BZJP的13C-NMR图可以看出化学位移90～105ppm间有5个吸收峰，因此BZJP有5种糖残基，该结果与氢谱相吻合。5种糖残基异头碳的化学位移分别为102.63ppm，99.70ppm，97.77ppm，95.75ppm和91.87ppm。
2.3 H-H COSY和HSQC分析
H-H COSY描述的主要是相邻两碳原子上的氢原子之间的耦合，而HSQC可直接获得H和与其相连的C之间的C/H偶合。因此，可以首先根据H-H COSY谱以及氢谱分析推测出5种残基对应的除异头氢外的其他氢的化学位移，再通过HSQC找出糖残基上每个氢所连接的碳信号，最后即可对5种糖残基的所有C/H的化学位移进行归属(表2)。
表2种糖残基的所有C/H的化学位移归属进而对5种残基进行推断，其结果再一次对甲基化结果进行了验证。
表2白术精制多糖BZJP中各糖苷键的1H和13C化学位移归属
Figure GDA0003506439220000101
Figure GDA0003506439220000111
。
2.4 HMBC分析
如图5为BZJP的HMBC谱图，HMBC主要描述的是相邻两糖残基间的C/H偶合，即异头氢(碳)与另一糖残基相连位碳(氢)的偶合，从而推断单糖残基间的连接方式。因此，HMBC可以判断BZJP所含5种残基单元之间的主要连接方式，再结合H-H COSY可对BZJP的准确一级结构式进行推测。综上所述，白术精制多糖BZJP的预测结构为βXylp-[(1→3)-βXylp]6-(1→6)-αGlcp-[(1→4)-αGlcp]40-[(1→2)-αManp]12，其糖链结构信息如下：
Figure GDA0003506439220000112
。
实施例3白术多糖对小鼠急性酒精性肝损伤保护作用研究
1.材料与方法
1.1材料与仪器
1.1.1实验动物：
清洁级昆明种小鼠，雄性，体重(20±2)g，购自青龙山。饲养环境温度为(23±2)℃，湿度为40％～60％，明暗交替周期为12h。
1.1.2药物与试剂
白术多糖BZTP(实施例1制备得到)；无水乙醇(国药集团股份有限公司)；天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、甘油三酯(TG)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、总蛋白定量测定(BCA法)试剂盒(南京建成生物工程研究所)。
1.1.3仪器
Tissuelyser-48全自动样品快速研磨仪(上海净信科技)；多功能酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)；MB100-2A型微孔板恒温振荡器(杭州奥盛仪器有限公司)。
1.2实验方法
(1)分组、给药及造模：24只小鼠适应性喂养3d后对其进行随机分组，共分为4组，每组6只，4组分别为空白对照组(NC)、模型对照组(MC)、BZTP低剂量组(LG，100mg/(kg·d)，以体质量计)、BZTP高剂量组(HG，400mg/(kg·d)，以体质量计)。BZTP用蒸馏水配制，现配现用，每天于下午15:00灌胃1次，连续灌胃8d，NC组和MC组每天灌胃等体积的生理盐水，末次给药2h后，MC组、LG组和HG组均以12mL/kg(以体质量计)50％的乙醇溶液灌胃，建立小鼠急性酒精性肝损伤模型，NC组灌胃等体积的蒸馏水。灌胃后禁食不禁水12h后收集血清样本并处死收集肝脏样本。
(2)肝脏指数：取材前对小鼠进行称重，血清收集结束后处死小鼠，立即取出肝脏称重并拍照记录，计算肝脏指数，肝脏指数＝肝脏重/体重。
(3)组织病理学检查：取肝左叶相同部位，用10％中性甲醛固定，石蜡包埋，苏木精-伊红(HE)染色后于光学显微镜下观察肝组织病理学改变。
(4)血清相关指标检测：摘眼球采血于1.5mL离心管中，取血后静置2h，4℃，3000r/min离心10min，将上清分装为3份，于-20℃保存。测定ALT、AST以及TG水平时分别拿出一份血清样品按照试剂盒的方法进行检测。
(5)肝脏匀浆相关指标检测：准确称取0.1g左右肝脏，用冰生理盐水洗去表面的血液后用滤纸将其擦干，将肝脏放于1.5mL离心管中，加入0.9mL左右预冷生理盐水使肝脏与生理盐水比例为1:9即可，使用匀浆机匀浆制备10％的肝脏匀浆，4℃、3000r/min离心10min后，分装3份，用于后续MDA、SOD及GSH-Px活性的检测。
2.结果与分析
2.1 BZTP对小鼠酒精性肝损伤肝脏组织病理变化的影响
如图6肝组织病理切片所示(A为空白对照组，B为模型对照组，C为白术多糖低剂量组，D为白术多糖高剂量组)，正常对照组肝组织结构完整，大小较均一，核圆而清晰，胞质丰富。肝小叶正常，可见整齐呈放射状排列的肝细胞索。而模型对照组与空白对照组相比，肝组织结构紊乱，肝细胞肿胀、空泡变性、浓缩，胞质内充满大量大小不等的圆形脂滴，脂肪变以汇管区最为明显，肝小叶边界不清，肝细胞坏死，细胞边界形态不清。肝索排列紊乱，肝索间出现红细胞。大量炎性细胞浸润。因此，造模成功。两个BZTP给药组与模型对照组相比，肝细胞肿胀、空泡变性好转，可见脂肪空泡。肝脏中央静脉扩张，肝索间偶见红细胞。炎性细胞浸润明显减轻。因此，从病理学切片可以看出BZTP对小鼠急性酒精性肝损伤具有一定的保护作用，高剂量效果稍优于低剂量组效果。
2.2 BZTP对小鼠急性酒精性肝损伤肝脏指数及肝功指标的影响
由表3可知，与正常对照组相比，模型对照组组肝脏指数、ALT、AST明显升高，提示肝细胞受到明显损伤；而LG和HG两组肝脏指数明显下降，ALT、AST也都明显下降，与模型对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，但两组之间差异无统计学意义。表明BZTP在肝脏指数及肝功能指标上对小鼠急性酒精性肝损伤均有保护作用，但没有剂量依赖性。
表3白术多糖对小鼠急性酒精肝损伤肝脏指数及肝功指标的影响(x±s,n＝6)
Figure GDA0003506439220000131
与正常对照组比较*P<0.05,**P<0.01；与模型对照组比较#P<0.05,##P<0.01。
2.3 BZTP对小鼠急性酒精性肝损伤血清TG的影响
由表4可知，与正常对照组相比，模型对照组小鼠血清中TG的含量明显升高，说明就该指标来讲，模型组造模成功。而LG、HG两个给药组小鼠TG含量明显降低，与模型组相比差异具有统计学意义(P<0.01)，但两者之间差异无统计学意义。表明BZTP在血清TG指标上对小鼠急性酒精性肝损伤有保护作用，但没有剂量依赖性。
表4白术多糖对小鼠急性酒精性肝损伤血清中TG的影响(x±s,n＝6)
组别 剂量(mg/mL) TG(mmol/L)
正常对照组 - 0.952±9.23
模型对照组 - 2.183±8.32<sup>**</sup>
白术多糖低剂量组 100 1.596±3.17<sup>##</sup>
白术多糖高剂量组 400 1.659±1.13<sup>##</sup>
与正常对照组比较*P<0.05,**P<0.01；与模型对照组比较#P<0.05,##P<0.01。
2.4 BZTP对小鼠急性酒精性肝损伤肝脏组织中氧化应激相关指标的影响
由表5可以看出，模型对照组小鼠SOD、GSH-Px活性明显降低，MDA含量显著升高，与正常对照组相比差异具有统计学意义(P<0.01)；LG、HG两个给药组SOD、GSH-Px活性明显增强，MDA含量显著下降，与模型对照组相比，差异具有统计学意义(P<0.05、P<0.01)，但两者差异无统计学意义。表明BZTP在氧化应激指标上对小鼠急性酒精性肝损伤有保护作用，但没有剂量依赖性。
表5白术多糖对酒精性肝损伤小鼠中MDA、SOD、GSH-Px的影响(x±s,n＝6)
组别 剂量(mg/mL) MDA(nmol/mg) SOD(U/mg) GSH-Px(U)
正常对照组 - 81.663±28.11 177.586±13.84 492.332±21.61
模型对照组 - 131.946±27.38<sup>**</sup> 146.032±14.35<sup>**</sup> 385.285±47.32<sup>**</sup>
白术多糖低剂量组 100 107.952±7.16<sup>#</sup> 168.921±16.79<sup>#</sup> 437.969±24.26<sup>#</sup>
白术多糖高剂量组 400 107.323±12.22<sup>#</sup> 174.694±12.34<sup>##</sup> 438.511±21.28<sup>#</sup>
与正常对照组比较*P<0.05,**P<0.01；与模型对照组比较#P<0.05,##P<0.01。
以上实施方式只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人了解本发明内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所做的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.一种抗酒精性肝损伤的白术多糖，其特征在于，该白术多糖由摩尔比为6.8:3.0:1.0的葡萄糖、甘露糖和木糖组成；其分子量为5465Da；白术多糖的一级结构为：βXylp-[(1→3)-βXylp]6-(1→6)-αGlcp-[(1→4)-αGlcp]40-[(1→2)-αManp]12。
2.权利要求1所述的抗酒精性肝损伤的白术多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)白术粗多糖提取；(2)大孔树脂脱色；(3)对脱色后的多糖进行DEAE阴离子交换层析；(4)对DEAE阴离子交换层析液进行透析得到。
3.根据权利要求2所述的抗酒精性肝损伤的白术多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)白术粗多糖提取：
取白术药材，粉碎，加入药材6～20倍量的水提取1～3次，每次1～2小时，合并提取液，浓缩，得浓缩液，加入乙醇使乙醇浓度为60～85％，放置沉淀，过滤或离心，干燥，得到白术粗多糖；
(2)大孔树脂脱色：
取步骤(1)白术粗多糖，加水溶解，得到浓度25mg/mL白术粗多糖溶液，调多糖溶液的pH值为6，加入HPD600大孔树脂柱，置于摇床中，125r/min、在温度75℃脱色、脱色时间6h，3000r/min离心3～5min，取上清液，浓缩；备用；
(3)对脱色后的多糖进行DEAE阴离子交换层析：
取步骤(2)大孔树脂脱色后的白术粗多糖浓缩液，进行离子交换层析，采用AKTAPurifier-100生物大分子纯化系统进行分离；采用上样泵自动进样，流速设置为1mL/min；依次用蒸馏水、0.01M NaCl、0.1M NaCl和1M NaCl进行阶段梯度洗脱，3mL/min，每个梯度洗3BV，每管收集2min，6mL，采用苯酚-硫酸法测定每管糖含量，绘制洗脱曲线；进样前用5BV的纯水进行柱平衡，流速设置为3mL/min；进样完毕后采用0.1M NaCl以较高流速3min/mL洗脱未吸附物，洗脱3BV后换用纯水继续洗脱吸附物，洗脱体积为3BV；合并洗脱液，将洗脱液浓缩；
(4)对DEAE阴离子交换层析液进行透析：取步骤(3)DEAE阴离子交换层析的洗脱液，稀释成200mg/mL装入透析袋进行透析24h，每隔4h换一次水，透析完成后冷冻干燥得白术多糖。
4.权利要求1所述的白术多糖在制备防治酒精性肝损伤药物或保健品中的应用。
5.权利要求1所述的白术多糖在制备防治酒精性脂肪肝的药物或保健品中的应用。
6.根据权利要求4或5的应用，将白术多糖和药学上可接受的载体制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂剂型的药物。
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