CN110787230B - 一种治疗糖尿病及糖尿病肾病的中药提取物组合物及质量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于中药领域,公开了一种治疗糖尿病及糖尿病肾病的中药提取物组合物、制备及质量检测方法,组合物包括黄连用乙醇提取后经酸沉纯化制得的黄连提取物,湖北麦冬经水煎煮除杂超滤所得的湖北麦冬多糖提取物,苦瓜经压榨所得榨汁液与乙醇冷浸液合并醇沉后制得的苦瓜提取物,决明子乙醇提取后经大孔树脂纯化所得的决明子提取物;提供了该组合物及原料药材提取物完整的质量检测方法,组合物检测方法包括性状检测、水分检测、浸出物检测、薄层色谱检测、特征图谱检测和含量限定检测,原料药材提取物检测方法包括黄连、湖北麦冬多糖、苦瓜和决明子提取物的质量检测方法。该组合物具有良好的降糖降脂功效,对糖尿病及糖尿病肾病具有治疗作用。
Description
本申请要求于2019年3月13日提交中国国家知识产权局专利局、申请号为201910187591.0、发明名称为“一种治疗糖尿病及糖尿病肾病的中药提取物组合物及制法”的中国专利申请的优先权,其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明属于中药领域,涉及治疗糖尿病的中药组合物,具体涉及一种用于治疗糖尿病及糖尿病肾病的中药提取物组合物及其制备方法和质量检测方法。
背景技术
糖尿病是由于人体胰岛素缺乏或无法有效利用而导致血液中的葡萄糖水平升高而发生的一种慢性疾病。二型糖尿病是临床上最常见的糖尿病类型,约占所有糖尿病病例的90%。在二型糖尿病中,高血糖主要是由于胰岛素抵抗所导致。长期高血糖水平会导致广泛的血管损伤,从而影响心脏、眼睛、肾脏和神经。糖尿病肾病是糖尿病微血管并发症之一,为糖尿病特有的肾脏并发症,也是糖尿病致死、致残的主要原因之一。
目前临床使用的抗糖尿病药物可在一定程度上延缓二型糖尿病及其并发症的发展,但使用中,常会出现低血糖、胃肠道反应、心血管系统疾病等副作用。而且大多数二型糖尿病患者,在血糖升高的同时,还伴随代谢异常。对于这样的代谢综合征,临床上已经开始较广泛地使用西药复方分别进行针对性治疗,而本发明旨在研究开发治疗糖尿病及并发症的中药复方药物和制剂。为保证该中药提取物组合物的药物组成与制备工艺的稳定性、产品质量的一致性与可控性,需要建立以主要药效成分为指标的、综合反映该中药提取物组合物及四种原料药材提取物的质量的检测方法。
发明内容
本发明的任务是提供一种治疗糖尿病或/和糖尿病肾病的中药提取物组合物。本发明的另一个任务是提供这种治疗糖尿病和/或糖尿病肾病的中药提取物组合物的制备方法。本发明的又一个任务是提供这种治疗糖尿病和/或糖尿病肾病的中药提取物组合物的质量检测方法。本发明的任务还包括提供对组成这种治疗糖尿病或/和糖尿病肾病的中药提取物组合物的四味原料药材的提取物进行质量检测的方法。
实现本发明的技术方案是:本发明提供的这种用于治疗糖尿病或/和糖尿病肾病的中药提取物组合物,包括黄连提取物、湖北麦冬多糖提取物、苦瓜提取物和决明子提取物。所述的黄连提取物是将黄连的干燥根茎采用乙醇水溶液提取后经酸沉纯化所制得的提取物;所述的湖北麦冬多糖提取物是将湖北麦冬的干燥块根经水煎煮、除杂、超滤所得的提取物;所述的苦瓜提取物是将压榨苦瓜果实所得的榨汁液与压榨残渣的乙醇冷浸液合并后醇沉后所制得的提取物;所述的决明子提取物是将决明子的干燥成熟种子经乙醇水溶液提取后经大孔树脂纯化所得的提取物。所述的黄连提取物、湖北麦冬多糖提取物、苦瓜提取物和决明子提取物各组分的重量百分比可以为:黄连提取物15-20%、湖北麦冬多糖提取物41-47%、苦瓜提取物 25-33%、决明子提取物8-12%。所述的黄连提取物、湖北麦冬多糖提取物、苦瓜提取物和决明子提取物各组分的重量份数范围可以为:黄连提取物80-100份、湖北麦冬多糖提取物 220-250份、苦瓜提取物130-180份、决明子提取物40-60份。
上述本发明提供的治疗糖尿病或/和糖尿病肾病的中药提取物组合物,其中:
所述的将黄连的干燥根茎采用乙醇水溶液提取后经酸沉纯化制得黄连提取物的具体方法是:取黄连(Coptis chinensis Franch.)的干燥根茎为原料药材,将黄连药材粉碎后,用8-15 倍原料药材重量的50-70%乙醇水溶液回流提取;提取液浓缩至浸膏状;用3-4倍浸膏重量的醋酸溶液加热溶解,过滤,取滤液用浓盐酸调pH值至1-1.5,每升溶液中加入100-180克氯化钠,混匀;4-8℃冷藏24-48小时,过滤,取沉淀经冰水洗涤,烘干,碾碎即得到黄连提取物。
所述的将湖北麦冬的干燥块根经水煎煮、除杂、超滤制得湖北麦冬多糖提取物的具体方法是:取湖北麦冬(Liriope spicata(Thunb.)Lour.var.prolifera Y.T.Ma)的干燥块根为原料药材,湖北麦冬药材粉碎后,水煎煮,取煎煮滤液,滤液用磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液调节pH 值至5-7;于40-55℃,优选45℃水浴上加入0.002-0.004倍湖北麦冬原料药材重量的比活力为12U/mg的木瓜蛋白酶,酶解1-2.5h除蛋白,煮沸5-8min,冷却、过滤得滤液即湖北麦冬提取液;滤液按超滤条件:截留分子量为1000Da,浓度7.5-13:1(指湖北麦冬提取液体积 ml与所用湖北麦冬原料药材质量g之比),压力0.8-1.2bar,切向流速1.0-1.5L/min进行超滤;超滤保留液过DEAE-52纤维素层析柱,收集水洗脱液,减压浓缩,减压干燥或冷冻干燥即得到湖北麦冬多糖提取物。
所述的将压榨苦瓜果实所得的榨汁液与压榨所得残渣的乙醇冷浸液合并后醇沉后制得苦瓜提取物的具体方法是:取新鲜苦瓜果实(Momordica charantia L.)为原料药材,压榨后取榨汁液;压榨所得残渣加入60-80%的乙醇水溶液冷浸,本发明的一个实施例中冷浸时间为冷浸过夜,再进行压榨,收集冷浸液;榨汁液与冷浸液合并,浓缩至无醇味,且40-50℃时测其相对密度为1.05-1.10,用80-90%乙醇水溶液沉淀12-36h,过滤,取滤液浓缩,冷冻干燥即得苦瓜提取物。
所述的将决明的干燥成熟种子经乙醇水溶液提取后经大孔树脂纯化制得决明子提取物的具体方法是:取决明(Cassia obtusifolia L.)或/和小决明(Cassia tora L.)的干燥成熟种子为原料药材,药材粉碎后,加原料药材重量的6-10倍量的65-85%乙醇水溶液,浸泡过夜;回流提取,抽滤,滤液回收至无醇味,并制成浓度为每毫升溶液含有0.5-0.7g原生药的浓缩液,过D101大孔树脂柱,用4倍柱体积水洗脱,弃去;再用6倍柱体积的80-95%乙醇水溶液洗脱,收集洗脱液,减压浓缩、真空干燥即制得决明子提取物。
本发明提供的治疗糖尿病或/和糖尿病肾病的中药提取物组合物的制备方法,包括以下步骤:
步骤一、以黄连、湖北麦冬、新鲜苦瓜和决明子为原料药材,分别制取黄连提取物、湖北麦冬多糖提取物、苦瓜提取物和决明子提取物;
步骤二、将步骤一制得的黄连提取物、湖北麦冬多糖提取物、苦瓜提取物和决明子提取物充分碾碎混匀即制得本发明中药提取物组合物。
上述步骤一中所述的原料药材黄连、湖北麦冬、新鲜苦瓜和决明子的用量比(重量份) 为:黄连40-45份、湖北麦冬55-65份、新鲜苦瓜550-650份、决明子95-105份。
上述制备方法步骤一中所述的以黄连、湖北麦冬、新鲜苦瓜和决明子为原料药材,分别制取黄连提取物、湖北麦冬多糖提取物、苦瓜提取物和决明子提取物的具体方法是:
取黄连(Coptis chinensis Franch.)的干燥根茎为原料药材,将黄连药材粉碎后,用8-15 倍原料药材重量的50-70%乙醇水溶液回流提取;提取液浓缩至浸膏状;用3-4倍浸膏重量的醋酸溶液加热溶解,过滤,取滤液用浓盐酸调pH值至1-1.5,每升溶液中加入100-180克氯化钠,混匀,4-8℃冷藏24-48小时,过滤,取沉淀经冰水洗涤,烘干,碾碎即得到黄连提取物;
取湖北麦冬(Liriope spicata(Thunb.)Lour.var.prolifera Y.T.Ma)的干燥块根为原料药材,湖北麦冬药材粉碎后,水煎煮,取煎煮滤液,滤液用磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液调节pH 值至5-7;于40-55℃,优选45℃水浴上加入0.002-0.004倍湖北麦冬原料药材重量的比活力为12U/mg的木瓜蛋白酶,酶解1-2.5h除蛋白,煮沸5-8min,冷却、过滤得滤液即湖北麦冬提取液;滤液按超滤条件:截留分子量为1000Da,浓度7.5-13:1(指湖北麦冬提取液体积 ml与所用湖北麦冬原料药材质量g之比),压力0.8-1.2bar,切向流速1.0-1.5L/min进行超滤;超滤保留液过DEAE-52纤维素层析柱,收集水洗脱液,减压浓缩,减压干燥或冷冻干燥即得到湖北麦冬多糖提取物;
取新鲜苦瓜(Momordica charantia L.)果实为原料药材,压榨后取榨汁液;压榨所得残渣加入60-80%的乙醇冷浸,本发明的一个实施例中冷浸时间为冷浸过夜,再行压榨,收集冷浸液;榨汁液与冷浸液合并,浓缩至无醇味,且40-50℃时测其相对密度为1.05-1.10,用80-90%乙醇沉淀12-36小时,过滤,取滤液浓缩,冷冻干燥即得苦瓜提取物;
取决明(Cassia obtusifolia L.)或/和小决明(Cassia tora L.)的干燥成熟种子为原料药材,药材粉碎后,加原料药材重量的6-10倍量的65-85%乙醇水溶液,浸泡过夜;回流提取,抽滤,滤液回收至无醇味,并制成浓度为每毫升溶液含有0.5-0.7g原生药的浓缩液,过D101 大孔树脂柱,用4倍柱体积水洗脱,弃去;再用6倍柱体积的80-95%乙醇水溶液洗脱,收集洗脱液,减压浓缩、真空干燥即制得决明子提取物。
在上述制备方法步骤二中,黄连提取物、湖北麦冬多糖提取物、苦瓜提取物和决明子提取物各组分的重量百分比可以为:黄连提取物15-20%、湖北麦冬多糖提取物41-47%、苦瓜提取物25-33%、决明子提取物8-12%。或各组分的重量份数范围可以为:黄连提取物80-100 份、湖北麦冬多糖提取物220-250份、苦瓜提取物130-180份、决明子提取物40-60份。按上述制备方法制得的本发明中药提取物组合物为棕黄色粉末,味极苦;每克本发明中药提取物组合物中相当于含黄连0.9-1.2g,湖北麦冬1.3-1.6g,鲜苦瓜12-16g,决明子2.3-2.6g。
本发明提供的中药提取物组合物具有良好的降糖降脂功效,可减轻机体胰岛素抵抗、炎症反应及氧化应激反应,对糖尿病具有治疗作用;且可通过减少肾脏RAGE及iNOS的表达,防治糖尿病肾病。
《本草纲目》“麦门冬”项下收载了附方“消渴饮水”,原方药物制备系将新鲜麦冬与苦瓜汁混合、捣烂,与黄连生药粉末混匀,制成丸剂。本专利申请发明人在药效学预实验中发现,该方所用黄连中的小檗碱可导致实验动物腹胀、便秘,不能进食而死亡。本发明在“消渴饮水”方的基础上加入决明子,形成了由黄连、麦门冬、苦瓜、决明子组成的新复方,动物实验验证,消除了腹胀、便秘的副作用,没有发现动物因此而死亡,从而保证了用药安全和疗效。“消渴饮水”古方以原生药粉末与苦瓜汁捣和后,成丸口服,工艺原始,服用量大,且剂量质量难以控制。本发明以黄连、苦瓜、湖北麦冬和决明子提取物为有效成分,增加了有效成分的含量,减少了服用剂量,能有效控制质量和剂量,且疗效显著。
以本发明提供的治疗糖尿病或/和糖尿病肾病的中药提取物组合物为有效成分,结合药剂学上可接受的载体、添加剂或/和赋形剂可以制备成治疗糖尿病或/和糖尿病肾病的药剂。具体的药剂可以是以本发明所提供的中药提取物组合物为有效成分按常规方法制备的颗粒剂、片剂、胶囊剂或丸剂。
本发明提供的对所述的治疗糖尿病和/或糖尿病肾病的中药提取物组合物进行质量检测的方法,包括薄层色谱检测、特征图谱检测和/或含量限定检测,所述各项检测的技术方案如下:
所述的薄层色谱检测方法是:以表小檗碱、巴马汀、黄连碱、盐酸小檗碱为对照品对中药提取物组合物中的黄连进行鉴别;以苦瓜皂苷L、 3-O-β-D-allopyranosyl,7,25-dihydroxy-cucurbita-5,23(E)-dien-19-al(中文名称为7,25-二羟基-葫芦烷-5,25(E)二烯-19-醛基-3-O-β-D-阿洛糖苷,下同)、苦瓜皂苷F2为对照品对所述的中药提取物组合物中的苦瓜进行鉴别;以橙黄决明素为对照品对该组合物中的决明子进行鉴别;
化合物3-O-β-D-allopyranosyl,7,25-dihydroxycucurbita-5,23(E)-dien-19-al首次报道见 Liva Harinantenaina,Michi Tanaka,Shigeru Takaoka等题为“Momordicacharantia Constituents and Antidiabetic Screening of the Isolated MajorCompounds”的论文中(Chemical and Phamaceutical Bulletin,2006,54(7):1017-1021)。本发明专利申请中第一次翻译成中文名称“7,25-二羟基-葫芦烷-5,25(E)二烯-19-醛基-3-O-β-D-阿洛糖苷”以便理解。但为了检索方便,下文仍使用原英文名称。
所述的特征图谱检测方法是:采用高效液相色谱-紫外检测法测定中药提取物组合物的特征图谱,以与对照品橙黄决明素、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、盐酸小檗碱、药根碱、非洲防己碱相一致的7个共有峰为特征峰,对所述的中药提取物组合物进行检测;采用高效液相色谱-蒸发光散射检测法测定中药提取物组合物的特征图谱,以与对照品红莲霉素-6-O-β-龙胆二糖苷、决明子苷C、苦瓜皂苷L、3-O-β-D-allopyranosyl,7,25-dihydroxycucurbita-5,23(E)-dien-19-al、苦瓜皂苷F2相一致的5个共有峰对所述的中药提取物组合物进行检测;
所述的含量限定检测方法是:采用高效液相色谱-紫外检测法测定中药提取物组合物中橙黄决明素、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、盐酸小檗碱的含量;采用紫外分光光度法测定中药提取物组合物中总多糖含量。
前述薄层色谱检测方法中所述的以表小檗碱、巴马汀、黄连碱、盐酸小檗碱为对照品对中药提取物组合物中的黄连进行鉴别具体方法包括以下步骤:
S1-混合对照品溶液的制备:分别精密称取表小檗碱、黄连碱、巴马汀、盐酸小檗碱对照品适量,加甲醇溶解制成每1ml含上述四种对照品各0.1-0.5mg的混合对照品溶液;
S2-供试品溶液的制备:取中药提取物组合物0.4-0.6g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入40-60ml甲醇,超声处理15-45min,滤过,取续滤液,得供试品溶液;
S3-薄层检测:吸取供试品溶液、对照品溶液各2μL,点于同一硅胶G薄层板上,以体积比为3:3.5:1:1.5:0.5:1的环己烷-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水-三乙胺混合溶液为展开剂,置于用浓氨试液预饱和20min的展开缸内展开,取出晾干,置365nm紫外光灯下检视;供试品溶液的薄层色谱检测中,在表小檗碱、黄连碱、巴马汀、盐酸小檗碱对照品相应的位置上,应显现相同颜色的斑点。
前述薄层色谱检测中所述的以苦瓜皂苷L、 3-O-β-D-allopyranosyl,7,25-dihydroxy-cucurbita-5,23(E)-dien-19-al、苦瓜皂苷F2为对照品对该组合物中的苦瓜进行鉴别具体方法包括以下步骤:
S1-混合对照品溶液的制备:精密称取苦瓜皂苷L、 3-O-β-D-allopyranosyl,7,25-dihydroxycucurbita-5,23(E)-dien-19-al、苦瓜皂苷F2对照品适量,加甲醇制成每1ml含上述三种对照品各0.2-1mg的混合对照品溶液。
S2-供试品溶液的制备:精密称取中药提取物组合物1.6-2.4g,加80%乙醇25-35ml,超声处理15-45min,滤过,滤液蒸干,残渣加水25-35ml使溶解,水液用石油醚(60-90℃) 振摇提取2-3次,弃去石油醚液。水液再用乙酸乙酯振摇提取2-3次,合并乙酸乙酯液,挥干溶剂,残渣加甲醇0.5-2ml使溶解,得供试品溶液。
S3-薄层检测:取供试品溶液及混合对照品溶液各3-7μL,以体积比为7:2.5:0.5的氯仿-甲醇-水的下层溶液为展开剂,点于同一硅胶G薄层板上展开,取出晾干,以10%硫酸乙醇溶液作为显色剂,在105℃加热至斑点颜色清晰,日光下检视;供试品溶液的薄层色谱检测中,在苦瓜皂苷L、3-O-β-D-allopyranosyl,7,25-dihydroxycucurbita-5,23(E)-dien-19-al、苦瓜皂苷F2对照品相应的位置上,应显现相同颜色的斑点。
前述薄层色谱检测中所述的以橙黄决明素为对照品对该组合物中的决明子进行鉴别具体方法包括以下步骤:
S1-对照品溶液的制备:精密称取橙黄决明素对照品适量,加甲醇制成每1ml含0.2-0.5mg 橙黄决明素的对照品溶液;
S2-供试品溶液的制备:取中药提取物组合物0.8-1.2g,加甲醇15-25ml,超声处理15-45 min,滤过,滤液蒸干,残渣加甲醇0.5-2ml使溶解,得供试品溶液;
S3-薄层检测:取供试品溶液及对照品溶液各2-6μL,点于同一硅胶G薄层板上,以体积比为12:5:0.5的环己烷-乙酸乙酯-甲酸的混合溶液为展开剂,展开,取出晾干,日光下检视;供试品溶液的薄层色谱检测中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点;置氨蒸气中熏后,斑点变为亮黄色。
前述特征图谱检测方法中所述的采用高效液相色谱-紫外检测法测定所述的中药提取物组合物的特征图谱,以与对照品橙黄决明素、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、盐酸小檗碱、药根碱、非洲防己碱相一致的7个共有峰为特征峰对所述的中药提取物组合物进行检测的具体方法包括以下步骤:
S1-混合对照品溶液的制备:精密称取橙黄决明素、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、盐酸小檗碱、药根碱、非洲防己碱对照品适量,加甲醇制成每l ml含上述七种对照品各1-10μg的混合对照品溶液;
S2-供试品溶液的制备:精密称取中药提取物组合物100-150mg,置具塞锥形瓶中,精密加入40-60ml甲醇,称定重量,超声提取15-45min。放冷后用甲醇补足减失的重量,摇匀滤过,取续滤液,得供试品溶液;
S3-色谱条件及检测:采用高效液相色谱-紫外检测法,以粒径为5μm,规格为250mm×4.6 mm的Agilent TC-C18(2)作为色谱柱,设置柱温为30℃,检测波长为310nm,进样量为10-30μl,流速为1.0ml/min,以乙腈为流动相A,乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液(40:60)为流动相B,梯度洗脱40min。梯度洗脱的条件为0~15min,流动相A为0%;15~30min,流动相A为0%~20%;30~40min,流动相A为20%;
供试品特征图谱中应呈现7个与对照品相一致的特征峰,并应分别与相应的对照品溶液的保留时间一致。
前述特征图谱检测方法中所述的采用高效液相色谱-蒸发光散射检测法测定所述的中药提取物组合物的特征图谱,以与对照品红莲霉素-6-O-β-龙胆二糖苷、决明子苷C、苦瓜皂苷 L、3-O-β-D-allopyranosyl,7,25-dihydroxycucurbita-5,23(E)-dien-19-al、苦瓜皂苷F2相一致的5 个共有峰对所述的中药提取物组合物进行检测的具体方法包括以下步骤:
S1-混合对照品溶液的制备:精密称取红莲霉素-6-O-β-龙胆二糖苷、决明子苷C、苦瓜皂苷L、3-O-β-D-allopyranosyl,7,25-dihydroxycucurbita-5,23(E)-dien-19-al、苦瓜皂苷F2对照品适量,加甲醇制成每1ml含有上述五种对照品各5-30μg的混合对照品溶液;
S2-供试品溶液的制备:取中药提取物组合物1.6-2.4g,加入40-60ml水,超声处理8-12 min。冷却至室温后,加入乙酸乙酯萃取2-3次,合并乙酸乙酯部位。加入正丁醇萃取2-3次,弃去正丁醇部位;合并水部位和乙酸乙酯部位,挥干溶剂,加10ml 70%甲醇溶解,过滤,取续滤液,得供试品溶液;
S3-色谱条件及检测:采用高效液相色谱-蒸发光散射检测法,以粒径为5μm,规格为250 mm×4.6mm的Agilent TC-C18(2)作为色谱柱,设置柱温为20℃,蒸发光散射检测仪参数为:氮气流量1.6L/min,汽化室温度60℃,雾化室温度40℃;进样量为20μl,流速为1.0ml/min,以水为流动相A,乙腈为流动相B,梯度洗脱100min;梯度洗脱的条件为0~5min,流动相A为85%~81%;5~30min,流动相A为80.1%~80%;30~38min,流动相A为80%~79%;38~48min,流动相A为79%~70%;48~60min,流动相A为70%~60%;60~63min,流动相A为60%~57.5%;63~73min,流动相A为57.5%;73~83min,流动相A为57.5%~30%;83.01~100min,流动相A为10%;
供试品特征图谱中应呈现5个与对照品相一致的特征峰,并应分别与相应的对照品溶液的保留时间一致。
前述含量限定检测方法中所述的采用高效液相色谱-紫外检测法测定所述的中药提取物组合物中橙黄决明素、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、盐酸小檗碱的含量的具体方法包括以下步骤:
S1-混合对照品溶液的制备:精密称取橙黄决明素、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、盐酸小檗碱对照品适量,加甲醇制成每l ml含橙黄决明素5-10μg、表小檗碱90-130μg、黄连碱70-110 μg、巴马汀80-120μg、盐酸小檗碱180-220μg的混合对照品溶液;
S2-供试品溶液的制备:精密称取中药提取物组合物100-150mg,置具塞锥形瓶中,精密加入40-60ml甲醇,称定重量,超声提取15-45min。放冷后用甲醇补足减失的重量,摇匀滤过,取续滤液,得供试品溶液;
S3-色谱条件及检测:采用高效液相色谱-紫外检测法,以粒径为5μm,规格为250mm×4.6mm的Agilent TC-C18(2)作为色谱柱,设置柱温为30℃,检测波长为310nm,进样量为10-30μl,流速为1.0ml/min,以乙腈为流动相A,乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液(40: 60)为流动相B,梯度洗脱40min。梯度洗脱的条件为0~15min,流动相A为0%;15~30 min,流动相A为0%~20%;30~40min,流动相A为20%;
所述的中药提取物组合物中,橙黄决明素含量不少于0.08%,表小檗碱不少于0.4%,黄连碱不少于1.5%,巴马汀不少于0.6%,小檗碱不少于4.5%;四种生物碱总含量不少于7.5%。
前述含量限定检测方法中所述的采用紫外分光光度法测定所述的中药提取物组合物中总多糖含量的具体方法包括以下步骤:
S1-对照品溶液的制备:精密称取烘干至恒重的葡萄糖对照品,加水制成每1ml含80-120 μg葡萄糖的对照品溶液;
S2-标准曲线的建立:精密量取对照品溶液0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml,分别置于10ml具塞试管中,各加水补至1.0ml,精密加入临用配制的5%苯酚溶液1.0ml,摇匀,再精密加入硫酸5.0ml,摇匀,置沸水浴中加热10-30min,取出,置冰水浴中5min,以相应试剂为空白,测定490nm波长处吸光度,以吸光度为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线;
S3-供试品溶液的制备:精密称取中药提取物组合物0.8-1.2g,精密加水40-60ml,称定重量。热水浴加热15-45min,放冷,补足重量,精密量取续滤液1.0ml,置离心管中,精密加入无水乙醇19.0ml,摇匀,冷藏6-18小时,取出,以每分钟4000转的转速离心15-25min,弃去上清液,沉淀以95%乙醇洗涤两次,每次加入10ml 95%乙醇,离心,弃去上清液;沉淀加水100ml溶解,即得供试品溶液;
S4-测定:精密量取供试品溶液1.0ml,按照S2下的方法,自“精密加入5%苯酚溶液1.0 ml”起,依法测定490nm波长处吸光度,从标准曲线上读出供试品溶液中葡萄糖的浓度,计算,即得;
该中药提取物组合物中,总多糖含量以葡萄糖(C6H12O6)计,不少于25.0%。
本发明提供的所述中药提取物组合物的质量检测方法,还可以包括对所述中药提取物组合物的性状检测,水分检测或/和浸出物检测,所述各项检测具体如下:①性状检测,其特征在于:该组合物为棕黄色粉末,味极苦;②水分检测,其特征在于:按照2015年版《中国药典》四部干燥失重测定法(通则0831)测定,该组合物水分不得超过7.0%;③浸出物检测,其特征在于:包括水溶性浸出物含量检测和/或醇溶性浸出物含量检测;水溶性浸出物含量按照2015年版《中国药典》四部浸出物测定法(通则2201)项下的热浸法测定,不得少于80.0%;醇溶性浸出物含量,用95%乙醇作溶剂,不得少于30.0%。
本发明还提了对用于制备本发明中药提取物组合物的四种原料药材黄连、湖北麦冬、苦瓜和决明子的提取物,即黄连提取物、湖北麦冬多糖提取物、苦瓜提取物和决明子提取物的质量进行检测的方法:所述的黄连提取物的质量检测方法包括以下步骤:以高效液相色谱- 紫外检测法测定黄连提取物中生物碱的含量,含表小檗碱不少于3%,黄连碱不少于10%,巴马汀不少于8%,小檗碱不少于28%;表小檗碱、黄连碱、巴马汀和小檗碱的总含量不少于50%;所述的湖北麦冬多糖提取物的质量检测方法包括以下步骤:以分子排阻色谱法测定湖北麦冬多糖提取物的重均分子量,范围为3000-5000Da;以紫外-可见分光光度法测定湖北麦冬多糖提取物的总糖含量,以果糖(C6H12O6)计不少于90.0%;以1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生化结合高效液相色谱-紫外检测法测定单糖组成,果糖与葡萄糖含量比值范围为 17~22:1;所述的苦瓜提取物的质量检测方法包括以下步骤:以高效液相色谱-蒸发光散射法测定苦瓜提取物中三萜皂苷含量,苦瓜皂苷L不少于0.1%, 3-O-β-D-allopyranosyl,7,25-dihydroxycucurbita-5,23(E)-dien-19-al不少于0.05%,苦瓜皂苷F2不少于0.1%,以上三种皂苷总含量不少于0.3%;所述的决明子提取物的质量检测方法包括以下步骤:以高效液相色谱-紫外检测法测定决明子提取物中蒽醌、萘并吡喃酮类成分含量,决明子苷不少于3%,红莲霉素-6-O-β-龙胆二糖苷不少于2%,橙黄决明素-6-O-葡萄糖苷不少于3%,决明子苷C不少于2%,橙黄决明素不少于1%。以上五种化合物总含量不少于12%。
本发明提供对组成所述的治疗糖尿病或/和糖尿病肾病的中药提取物组合物的四味中药材的提取物进行质量检测的方法,包括黄连提取物中生物碱的含量检测、湖北麦冬多糖提取物的重均分子量测定、湖北麦冬多糖提取物总糖含量测定、湖北麦冬多糖提取物单糖组成测定、苦瓜提取物中三萜皂苷含量测定、决明子提取物中蒽醌和萘并吡喃酮类成分含量测定,具体如下:
黄连提取物中生物碱的含量检测,包括以下步骤:
S1-混合对照品溶液的制备:精密称取对照品适量,加甲醇制成每l ml含表小檗碱40-80 μg、黄连碱40-80μg、巴马汀30-70μg、盐酸小檗碱150-200μg的混合对照品溶液;
S2-供试品溶液的制备:精密称取黄连提取物适量,加甲醇制成每1ml含黄连提取物 200-400μg的溶液,取续滤液,得供试品溶液;
S3-色谱条件及测定:采用高效液相色谱-紫外检测法以粒径为5μm,规格为250mm×4.6 mm的Agilent TC-C18(2)作为色谱柱,以乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液(50:50)(每 100ml中加十二烷基硫酸钠0.4g,再以磷酸调节pH值为4.0)为流动相;检测波长为345nm。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,根据峰面积,计算表小檗碱、黄连碱、巴马汀和小檗碱的含量;黄连提取物中,表小檗碱不少于3%,黄连碱不少于 10%,巴马汀不少于8%,小檗碱不少于28%。表小檗碱、黄连碱、巴马汀和小檗碱的总含量不少于50%。
湖北麦冬多糖提取物的重均分子量测定,包括如下步骤:
S1-混合对照品溶液的制备:精密称取相对分子质量分别为3000,5000,10000,40000 及70000的Dextran系列标准葡聚糖对照品D-3,T-5,T-10,T-40,T-70适量,加水制成每1 ml含有上述对照品各5-15mg的混合对照品溶液;
S2-标准曲线的建立:分别精密吸取对照品溶液20μ1,注入液相色谱仪,测定。以标准葡聚糖重均分子量的对数(log Mw)为横坐标,保留时间(tR)为纵坐标,建立标准曲线;
S3-供试品溶液的配制:精密称取湖北麦冬多糖提取物适量,加水制成每1ml含提取物 10mg的供试品溶液;
S4-色谱条件及检测:采用分子排阻色谱法,Hitachi L-2130高效液相色谱仪,蒸发光散射检测器;以粒径为10μm,规格为7.8mm×300mm的TOSOH G4000PWXL凝胶色谱柱;流动相为水,流速为0.6ml/min,柱温25℃,氮气流速为3.0L/min,漂移管温度为110℃。精密吸取对照品溶液、供试品溶液20μl,注入液相色谱仪,测定。从标准曲线上读出供试品溶液中湖北麦冬多糖提取物的重均分子量;湖北麦冬多糖提取物重均分子量范围为3000-5000 Da。
湖北麦冬多糖提取物总糖含量测定,包括如下步骤:
S1-对照品溶液的制备:精密称取干燥至恒重的果糖对照品适量,加水制成每1ml含果糖80-120μg的对照品溶液;
S2-供试品溶液的制备:精密称取干燥至恒重的湖北麦冬多糖提取物适量,加水制成每1 ml含湖北麦冬多糖提取物80-120μg的溶液,取续滤液,即得供试品溶液;
S3-标准曲线的建立:精密量取对照品溶液0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml分别置于5个10ml具塞试管中,各加水至1.0ml,摇匀,在冰水浴中滴加5.0ml蒽酮-硫酸溶液 (精密称取蒽酮固体0.1g于10ml棕色容量瓶中,用80%硫酸水溶液定容),混匀,封口膜封口,沸水浴中加热15min,取出,冷却至室温;另取蒸馏水1ml,加入蒽酮-硫酸溶液5.0ml,同法操作,为空白。按分光光度法在625nm波长处测定吸光度,以吸光度为纵坐标,浓度为横坐标,建立标准曲线;
S4-测定与计算:采用紫外-可见分光光度法测定,精密量取供试品溶液0.6ml置于10ml 具塞试管中,加水补足至1.0ml,在冰水浴中滴加5.0ml蒽酮-硫酸溶液,混匀,封口膜封口,沸水浴中加热15min,取出,冷却至室温;取上述反应液于两小时内,在625nm波长处测定吸光度,从标准曲线上读出供试品溶液中含果糖的重量,再按下式计算样品中总糖含量(含量%);总糖含量%=(0.904×C×D)/W×100%。(C,待测液中果糖浓度;D,待测液稀释倍数;W,待测样品质量);湖北麦冬多糖提取物中,总糖含量以果糖(C6H12O6)计不少于90.0%。
注:0.904为换算系数。分子排阻色谱法实验测得湖北麦冬多糖提取物重均分子量为 3000-5000Da,则该多糖可能由18-31分子糖(C6H12O6),脱去17-30分子H2O组成。为消除加入的水分子对实验结果的影响,需在等式中加入换算系数一项。当该多糖由18个糖单元组成时,换算系数F=(180×18-18×17)/180/18≈0.9056;当该多糖由31个糖单元组成时,换算系数F=(180×31-18×30)/180/31≈0.9032。为方便计算,将换算系数定为平均值0.904。
湖北麦冬多糖提取物单糖组成测定,包括以下步骤:
S1-混合对照品溶液的制备:精密称取果糖、葡萄糖对照品适量,加水制成每1ml含果糖、葡萄糖各1-3mg的混合溶液;取100μl放入具塞试管中,加入0.3mol/L的氢氧化钠水溶液500μl,再加入0.5mol/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)甲醇溶液500μl,混合均匀,在80℃水浴中反应4小时,反应结束后取出试管冷却至室温,再加入0.15mol/L的盐酸水溶液1000μl中和反应液中的碱;用2ml氯仿萃取反应液三次,取水层溶液过0.22μm微孔滤膜,即为混合对照品溶液;
S2-供试品的制备:精密称取湖北麦冬多糖提取物适量,加水制成每1ml含提取物3-7mg 的溶液;取2.0ml上述溶液,加入0.2mol/L的三氟乙酸溶液2.0ml,摇匀、封管;置于80℃水浴中反应1.5h;反应结束后放于冰水中冷却,减压浓缩至干,转移至5ml容量瓶中定容,取100μl放入具塞试管中,按S1所述方法,自“加入0.3mol/L的氢氧化钠水溶液500μl”起,同法操作,制得供试品溶液;
S3-色谱条件及测定:采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生化结合高效液相色谱- 紫外检测法,以粒径为5μm,规格为250mm×4.6mm的Agilent TC-C18(2)作为色谱柱;以乙腈-pH为7.0的磷酸缓冲液(20:80)为流动相;流速1.0ml/min,柱温25℃,检测波长250nm;分别精密吸取混合对照品溶液10μl,供试品溶液10μl,注入液相色谱仪,测定;分别计算果糖、葡萄糖含量;湖北麦冬多糖提取物中,果糖与葡萄糖含量比值范围为17~22:1。
苦瓜提取物中三萜皂苷含量测定,包括以下步骤:
S1-混合对照品溶液的制备:精密称取苦瓜皂苷L、3-O-β-D-allopyranosyl,7,25-dihydroxycucurbita-5,23(E)-dien-19-al、苦瓜皂苷F2对照品适量,加70%甲醇水溶液制成每1ml 含上述三种对照品分别为0.2-1.5mg、0.2-1mg、0.5-2mg的混合对照品溶液;
S2-供试品溶液的制备:精密称取苦瓜提取物适量,精密加入70%甲醇水溶液制成每1ml 含苦瓜提取物50-150mg的溶液,称定重量,超声提取15-45min。放冷后70%甲醇补足重量,摇匀滤过,取续滤液,即得供试品溶液;
S3-色谱条件及测定:采用高效液相色谱-蒸发光散射检测法,以粒径为5μm,规格为250 mm×4.6mm的Agilent TC-C18(2)作为色谱柱;流动相乙腈(A)-水(B)梯度洗脱(0~10min,20%~30%A;10~30min,30%~50%A;30~50min,50%~70%A)。流速1.0ml/min,柱温25℃。蒸发光散射检测器条件:汽化室温度60℃,雾化室温度40℃;氮气流速1.6L/min。分别精密吸取对照品溶液10μ1、20μ1,供试品溶液20μ1,注入液相色谱仪,测定。用外标两点法对数方程分别计算三种苦瓜皂苷含量;苦瓜提取物中,苦瓜皂苷L不少于0.1%, 3-O-β-D-allopyranosyl,7,25-dihydroxycucurbita-5,23(E)-dien-19-al不少于0.05%,苦瓜皂苷F2不少于0.1%,以上三种皂苷总含量不少于0.3%。
决明子提取物中蒽醌和萘并吡喃酮类成分含量测定,包括以下步骤:
S1-混合对照品溶液的制备:精密称取决明子对照品决明子苷、红莲霉素-6-O-β-龙胆二糖苷、橙黄决明素-6-O-葡萄糖苷、决明子苷C、橙黄决明素适量,精密称定,加甲醇制成每1ml 含有决明子苷30-40μg、红莲霉素-6-O-β-龙胆二糖苷30-40μg、橙黄决明素-6-O-葡萄糖苷 35-45μg、决明子苷C 25-35μg、橙黄决明素15-25μg的混合对照品溶液;
S2-供试品溶液的制备:精密称取决明子提取物适量,加甲醇制成每1ml含决明子提取物0.6-1.2mg的溶液,摇匀过滤,取续滤液,即得供试品溶液;
S3-色谱条件及检测:采用高效液相色谱-紫外检测法,以粒径为5μm,规格为250mm×4.6 mm的Agilent TC-C18作为色谱柱;流动相乙腈(A)-0.1%甲酸溶液(B)梯度洗脱(0~10min, 15%A;10~60min,15%~20%A;60~70min,20%~25%A;70~100min,25%~70%A),流速1.0ml/min,柱温25℃,检测波长280nm。分别精密吸取对照品溶液10μ1,供试品溶液10μ1,注入液相色谱仪,测定。决明子提取物中,决明子苷不少于3%,红莲霉素-6-O-β-龙胆二糖苷不少于2%,橙黄决明素-6-O-葡萄糖苷不少于3%,决明子苷C不少于2%,橙黄决明素不少于1%。以上五种化合物总含量不少于12%。
本发明中,采用目测、和口尝对中药提取物组合物的性状进行检测,保证了组合物的感官性状;采用薄层色谱法对黄连、苦瓜及决明子进行鉴别,可分别鉴定3种药材。采用高效液相色谱-紫外检测法测定中药提取物组合物的特征图谱,通过对照品确认了7个特征峰,可鉴别中药提取物组合物中的黄连和决明子;采用高效液相色谱-蒸发光散射法测定中药提取物组合物的特征图谱,通过对照品确定了5个特征峰,可鉴别中药提取物组合物中的苦瓜和决明子,采用两种不同检测器,建立了中药提取物组合物的高效液相色谱特征图谱,从而以不同结构类型化合物的特征图谱检测组合物的质量。采用高效液相色谱-紫外检测法测定中药提取物组合物中主要有效成分的含量,通过方法学考察确定其中橙黄决明素、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱共5种成分的线性范围、精密度、稳定性、重复性均良好,可精密测定组合物的主要有效成分含量,建立了中药提取物组合物成分含量的检测方法。采用紫外分光光度法测定组合物总多糖含量,同时辅助作为湖北麦冬的鉴别手段。
此外,本发明还制定了组成中药提取物组合物的四种单味原料药材提取物的质量检测方法,对黄连提取物中异喹啉类生物碱含量,湖北麦冬多糖提取物的重均分子量、总糖含量及单糖组成,决明子提取物中蒽醌、萘并吡喃酮类成分含量均作出了相应规定。
本发明还以三种葫芦烷型三萜皂苷为对照品,建立了苦瓜提取物及含有苦瓜提取物的中药提取物组合物的质量检测方法。目前,对苦瓜中皂苷含量测定的方法主要有紫外-分光光度计法及紫外-高效液相色谱法两种。前者为非专属性检测方法,干扰较大,容易出现假阳性结果;后者方法专属性强,但三萜成分发色团较少,以紫外检测器检测三萜皂苷,检测波长在 200-210nm左右,属末端吸收,对检测干扰较大。本发明以高效液相色谱-蒸发光散射法作为检测手段,方法具有专属性且无末端吸收的干扰,更加适用于葫芦烷型三萜皂苷的检测。另外,本发明首次采用3-O-β-D-allopyranosyl,7,25-dihydroxy-cucurbita-5,23(E)-dien-19-al作为对照品对苦瓜提取物进行检测。该化合物结构与苦瓜皂苷L相似,具有相近的色谱行为。本发明的检测手段首次实现了这两种对照品的分离。
附图说明
图1:中药提取物组合物、提取物及中药
A1.黄连,A2.黄连提取物,B1.湖北麦冬,B2.湖北麦冬多糖提取物,C1.苦瓜,C2.苦瓜提取物,D1.决明子,D2.决明子提取物,E.中药提取物组合物。
图2:配方筛选实验中不同配方对糖尿病小鼠空腹血糖的影响(n=8)
图3:配方筛选实验中不同配方对糖尿病小鼠口服糖耐量(OGTT)的影响(n=6)
图4:提取物组合物对糖尿病大鼠体重的影响(n=7)
图5:提取物组合物对糖尿病大鼠空腹血糖的影响(n=7)
图6:提取物组合物对糖尿病大鼠口服糖耐量(OGTT)的影响(n=6)
图7:提取物组合物对糖尿病大鼠胰脏病理改变的影响
NC.正常组,DM.模型组,DM+MET.二甲双胍组,DM+D.水煎煮组,DM+XL.低剂量组,DM+XM.中剂量组,DM+XH.高剂量组。
图8:提取物组合物对糖尿病大鼠肾脏病理改变的影响
A.HE染色;NC.正常组,DM.模型组,DM+MET.二甲双胍组,DM+D.水煎煮组, DM+XL.低剂量组,DM+XM.中剂量组,DM+XH.高剂量组。B.Masson染色,分组同上。 C.PAS染色,分组同上。
图9:提取物组合物对糖尿病大鼠肾脏晚期糖基化终产物受体(RAGE)表达量的影响
NC.正常组,DM.模型组,DM+MET.二甲双胍组,DM+D.水煎煮组,DM+XL.低剂量组,DM+XM.中剂量组,DM+XH.高剂量组。
图10:提取物组合物对糖尿病大鼠肾脏NO含量的影响
图11:提取物组合物对糖尿病大鼠肾脏诱导性一氧化氮合成酶(iNOS)表达量的影响
A.iNOS与内参(β-actin)代表性蛋白条带;B.iNOS相对光密度值(即各条带光密度值与内参β-actin的比值)。1.正常组,2.模型组,3.阳性药组,4.水煎煮组,5.组合物低剂量组,6.组合物中剂量组,7.组合物高剂量组。
图12:苦瓜提取物及对照品含量测定高效液相色谱图
A.苦瓜皂苷L,B.3-O-β-D-allopyranosyl,7,25-dihydroxycucurbita-5,23(E)-dien-19-al,C. 苦瓜皂苷F2,D.苦瓜提取物。
图13:苦瓜皂苷L核磁共振谱图
A.400MHz核磁共振氢谱,溶剂为氘代甲醇。B.100MHz核磁共振碳谱,溶剂为氘代甲醇。
图14:3-O-β-D-allopyranosyl,7,25-dihydroxycucurbita-5,23(E)-dien-19-al核磁共振谱图
A.400MHz核磁共振氢谱,溶剂为氘代甲醇。B.100MHz核磁共振碳谱,溶剂为氘代甲醇。
图15:苦瓜皂苷F2核磁共振谱图
A.400MHz核磁共振氢谱,溶剂为氘代氯仿。B.100MHz核磁共振碳谱,溶剂为氘代氯仿。
图16:提取物组合物中黄连的薄层色谱检查
A.365nm紫外光灯下检视的薄层色谱图,B.日光下检视的薄层色谱图。1-3.提取物组合物,批号分别为XKYS2018042301,XKYS2018042302,XKYS2018042303,4.缺黄连提取物阴性对照溶液,5.黄连提取物溶液,6.混合对照品溶液,7.黄连对照药材溶液。
图17:中药提取物组合物中苦瓜的薄层色谱检查
1-3.提取物组合物,批号分别为XKYS2018042301,XKYS2018042302,XKYS2018042303,4.缺苦瓜提取物的阴性对照溶液,5.苦瓜提取物溶液,6.混合对照品溶液,7.苦瓜对照药材溶液。
图18:中药提取物组合物中决明子的薄层色谱检查
1-3.提取物组合物,批号分别为XKYS2018042301,XKYS2018042302,XKYS2018042303,4.缺决明子提取物的阴性对照溶液,5.决明子提取物溶液,6.橙黄决明素,7.决明子对照药材溶液。
图19:提取物组合物高效液相色谱-紫外检测法检测的特征图谱
4号峰为橙黄决明素,5号峰为非洲防己碱,6号峰为药根碱,7号峰为表小檗碱,9号峰为黄连碱,10号峰为巴马汀,11号峰为小檗碱。
图20:提取物组合物高效液相色谱-紫外特征图谱
4号峰为橙黄决明素,5号峰为非洲防己碱,6号峰为药根碱,7号峰为表小檗碱,9号峰为黄连碱,10号峰为巴马汀,11号峰为小檗碱。S1-S10分别为XKYS2018042301,XKYS2018042302,XKYS2018042303,XKYS2018122104,XKYS2018122105, XKYS2018122106,XKYS2018122107,XKYS2019062008,XKYS2019062009, XKYS2019062010十批样品。
图21:提取物组合物高效液相色谱-紫外特征图谱特征峰的归属
A.中药提取物组合物色谱图;B.混合对照品色谱图,4号峰为橙黄决明素,5号峰为非洲防己碱,6号峰为药根碱,7号峰为表小檗碱,9号峰为黄连碱,10号峰为巴马汀,11号峰为小檗碱;C.黄连提取物色谱图;D.决明子提取物色谱图;E.苦瓜提取物色谱图;F.湖北麦冬多糖提取物色谱图。
图22:提取物组合物高效液相色谱-蒸发光散射法检测的特征图谱
11号峰为决明子苷C,12号峰为红莲霉素-6-O-β-龙胆二糖苷,18号峰为苦瓜皂苷L,19 号峰为苦瓜皂苷F2,20号峰为3-O-β-D-allopyranosyl,7,25-dihydroxycucurbita-5,23(E)-dien -19-al。
图23:提取物组合物高效液相色谱-蒸发光散射特征图谱
11号峰为决明子苷C,12号峰为红莲霉素-6-O-β-龙胆二糖苷,18号峰为苦瓜皂苷L,19 号峰为苦瓜皂苷F2,20号峰为3-O-β-D-allopyranosyl,7,25-dihydroxycucurbita-5,23(E)-dien -19-al。S1-S10分别为XKYS2018042301,XKYS2018042302,XKYS2018042303,XKYS2018122104,XKYS2018122105,XKYS2018122106,XKYS2018122107, XKYS2019062008,XKYS2019062009,XKYS2019062010十批样品。
图24:提取物组合物高效液相色谱-蒸发光散射法检测的特征图谱特征峰归属
A.中药提取物组合物色谱图;B.混合对照品色谱图,11号峰为决明子苷C,12号峰为红莲霉素-6-O-β-龙胆二糖苷,18号峰为苦瓜皂苷L,19号峰为苦瓜皂苷F2,20号峰为 3-O-β-D-allopyranosyl,7,25-dihydroxycucurbita-5,23(E)-dien-19-al;C.决明子提取物色谱图; D.苦瓜提取物色谱图;E.黄连提取物色谱图;F.湖北麦冬多糖提取物色谱图。11号峰为决明子苷C、12号峰为红莲霉素-6-O-β-龙胆二糖苷、18号峰为苦瓜皂苷L、19号峰为苦瓜皂苷 F2、20号峰为3-O-β-D-allopyranosyl,7,25-dihydroxycucurbita-5,23(E)-dien-19-al。
图25:中药提取物组合物的高效液相色谱-紫外检测法含量测定色谱图
A.对照品图谱,1.橙黄决明素,2.表小檗碱,3.黄连碱,4.巴马汀,5.小檗碱;B.中药提取物组合物;C.阴性对照。
图26:黄连提取物高效液相色谱图
1.表小檗碱,2.黄连碱,3.巴马汀,4.小檗碱。
图27:湖北麦冬多糖提取物质量检测
A.重均分子量测定高效液相分子排阻色谱图,B.果糖、葡萄糖比值测定高效液相色谱图。
图28:苦瓜提取物高效液相色谱图
1.苦瓜皂苷L,2.3-O-β-D-allopyranosyl,7,25-dihydroxycucurbita-5,23(E)-dien-19-al,3.苦瓜皂苷F2。
图29:决明子提取物高效液相色谱图
1.决明子苷,2.红莲霉素-6-O-β-龙胆二糖苷,3.橙黄决明素-6-O-葡萄糖苷,4.决明子苷C,5.橙黄决明素。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
实施例1:仪器与试剂:超滤系统(截留分子量为1000Da),Millipore minipellicon。DZX-3 真空干燥箱,上海福玛。LYO-0.5冷冻干燥机,上海东富龙。其余设备均为实验室常用仪器。木瓜蛋白酶(12U/mg),广西杰沃利。其余试剂均购自国药集团,分析纯(AR)。
黄连为毛茛科植物黄连Coptis chinensis Franch(习称味连),购自湖北省利川市箭竹溪黄连生产合作社。湖北麦冬为百合科植物湖北麦冬Liriope spicata(Thunb.)Lour.var.prolifera Y. T.Ma的干燥块根,购自湖北省襄樊市欧庙镇湖北麦冬药材GAP种植基地。苦瓜为葫芦科植物苦瓜Momordica charantia L.的新鲜近成熟果实,购自湖北省武汉市江汉区电业菜市场。决明子为豆科植物决明Cassia obtusifolia L.的干燥成熟种子,购自武汉市解放大道天一中医医院同仁堂药店。以上药材均由华中科技大学同济医学院药学院陈家春教授鉴定,批号见表1-1。药材标本保存于华中科技大学同济医学院药学院生药学教研室。
取黄连(Coptis chinensis Franch.)的干燥根茎为制备黄连提取物的原料药材,将黄连原料药材粉碎,用10倍量的60%乙醇溶液回流提取三次,每次1h,提取液浓缩至浸膏状。用 4倍量1%醋酸溶液加热溶解,过滤,取滤液用浓盐酸调pH值至1,加入18%(w/v)氯化钠, 4℃冷藏24h,过滤,沉淀经冰水洗涤,烘干,碾碎即得黄连提取物。黄连提取物为棕黄色粉末,味极苦。三批黄连提取物的制备结果见表1-1。
取百合科植物湖北麦冬Liriope spicata(Thunb.)Lour.var.prolifera Y.T.Ma的干燥块根为制备湖北麦冬多糖提取物的原料药材,将湖北麦冬原料药材粉碎,水煎煮3次,液料比分别为4:1、4:1和2:1,每次30min。合并三次煎煮滤液;滤液用磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液调节pH值至6,45℃水浴上加入0.003倍药材重量的木瓜蛋白酶(12U/ml),酶解2h除蛋白,煮沸5min,冷却、过滤;滤液按超滤条件:截留分子量为1000Da,浓度7.5:1(指湖北麦冬提取液体积ml与药材质量g之比),压力1.2bar,切向流速1L/min进行超滤;超滤保留液过DEAE-52纤维素层析柱,收集水洗脱液,减压浓缩,冷冻干燥,即得湖北麦冬多糖提取物。湖北麦冬多糖提取物为白色粉末,无味。三批湖北麦冬多糖提取物的制备结果见表1-2。
取葫芦科植物苦瓜Momordica charantia L.的新鲜接近成熟的果实为制备苦瓜提取物的原料药材,将苦瓜原料药材压榨后取榨汁液;残渣加入70%的乙醇冷浸过夜,收集冷浸液,重复2次;榨汁液与冷浸液合并,浓缩至无醇味,40-50℃时测其相对密度为1.10,用80%乙醇沉淀24h,冷冻干燥即得苦瓜提取物。苦瓜提取物为深棕色,味微苦。三批苦瓜提取物的制备结果见表1-3。
取豆科植物决明Cassia obtusifolia L.的干燥成熟种子为制备决明子提取物的原料药材,将决明子原料药材粉碎后,加8倍量80%乙醇水溶液,浸泡过夜,回流提取2h,提取1次,抽滤,滤液挥干溶剂至无醇味;将提取液制成浓度为每毫升溶液含有0.6g原生药的浓缩液。D101大孔树脂柱干法装柱,柱高:柱直径=6:1,药材重量与柱体积(BV)比1:1,上样速率3BV/h,反复上样4BV,过夜吸附。次日水洗4BV,弃去洗脱液;90%乙醇溶液洗脱6BV,收集洗脱液,回收溶剂,水浴蒸干,真空干燥后,研细,即得决明子提取物。决明子提取物为棕黑色粉末,微有豆腥气,味微苦。三批决明子提取物的制备结果见表1-4。
表1-1三批黄连提取物的制备
表1-2三批湖北麦冬多糖提取物的制备
表1-3三批苦瓜提取物的制备
表1-4三批决明子提取物的制备
实施例2:
1)取黄连提取物96份,湖北麦冬多糖提取物244份,苦瓜提取物139份,决明子提取物49份,充分碾碎混匀,制备为组合物一。该组合物为棕黄色粉末,味极苦。其中,黄连提取物占该组合物的比例为18.2%,湖北麦冬多糖提取物为46.2%,苦瓜提取物为26.3%,决明子为9.3%。每克组合物一中,相当于含黄连1.04克,湖北麦冬1.48克,鲜苦瓜14.8克,决明子2.49克。
2)取黄连提取物98份,湖北麦冬多糖提取物233份,苦瓜提取物147份,决明子提取物56份,充分碾碎混匀,制备为组合物二。该组合物为棕黄色粉末,味极苦。其中,黄连提取物占该组合物的比例为18.3%,湖北麦冬多糖提取物为43.6%,苦瓜提取物为27.5%,决明子为10.5%。每克组合物二中,相当于含黄连1.02克,湖北麦冬1.46克,鲜苦瓜14.6克,决明子2.47克。
3)取黄连提取物87份,湖北麦冬多糖提取物235份,苦瓜提取物175份,决明子提取物56份,充分碾碎混匀,制备为组合物三。该组合物为棕黄色粉末,味极苦。其中,黄连提取物占该组合物的比例为16.3%,湖北麦冬多糖提取物为42.2%,苦瓜提取物为31.2%,决明子为10.3%。每克组合物三中,相当于含黄连0.98克,湖北麦冬1.41克,鲜苦瓜14.1克,决明子2.39克。
实施例3:本发明中药提取物组合物可有效治疗糖尿病,其组合物中各提取物的配伍比例的筛选与优化过程如下:
1.仪器与试药:中药提取物及其组合物的制备、仪器见实施例1、2。黄连提取物批号: HL2017032701,湖北麦冬多糖提取物批号:HBMD2016011801,苦瓜提取物批号:KG2017111201,决明子提取物批号:JMZ2017122010。链脲佐菌素(STZ)购自Sigma Aldrich(美国)。盐酸二甲双胍片,中美上海施贵宝。总胆固醇(TC)、总甘油三酯(TG)试剂盒,南京建成。
本实验所用的单味药材提取物经质量检测,均符合规定。具体检测方法及检测结果见相关实施例。
2.实验方法
2.1实验动物与糖尿病模型的建立:KM小鼠购入后适应性饲养1周,期间自由饮水、饮食,室温控制在(22±2)℃,湿度60%左右,光照12h和黑暗12h循环。
适应性喂养后,小鼠随机分为两组,一组8只,以普通饲料喂养;一组152只,以高脂高糖饲料(D12451,武汉鼠来宝公司)喂养。喂养两周后,高脂高糖饲料喂养的小鼠禁食12 h后腹腔注射120mg/kg STZ(柠檬酸钠缓冲溶液溶解,pH 4.5)。7天后,尾尖取血,用血糖仪(Bayer,德国)检测小鼠空腹血糖;血糖值小于等于11.0mmol/L的小鼠,补充腹腔注射40mg/kg STZ。7天后,血糖值大于11.1mmol/L视为糖尿病小鼠。
2.2单味中药日服剂量范围的选择:药理实验设计的一个关键环节,是确定药物的给药剂量。根据给药剂量的范围,我们才可以依据均匀设计的原则,进行实验安排。在此有必要对单味中药的日服剂量范围进行讨论,尤其是其日服最大剂量。在此,我们结合药典记载、现代中药学研究及临床用药习惯,设定单味中药日服最大剂量。现行版中国药典中,黄连最大日服剂量为5克;《中华本草》、《中药大辞典》中,黄连内服煎汤时,最大日服剂量为3克;研末,每次最大服用量为0.6克。但仝小林等提出(中医杂志,2011,52卷18期,1604-1605),黄连小剂量长期缓慢调理治疗糖尿病时,其平均每日用量为3-6克。为遵循临床用药习惯,同时观察较高剂量黄连提取物有无副作用,本实验将黄连日服最高剂量设定为6克。《中国药典》、《中华本草》、《中药大辞典》中,湖北麦冬、决明子最大日服剂量均为15克,故将该两味药材最大日服剂量设定为15克。苦瓜未被中国药典收载;按照《中华本草》、《中药大辞典》的记录,苦瓜鲜品日服剂量为30-60克,据此设定苦瓜(鲜)的最大日服剂量为60克。
综上所述,单味中药的最大日服剂量设定为:黄连6克,湖北麦冬15克,苦瓜(鲜)60克,决明子15克。为方便计算,各味中药的最小日服剂量均设定为最大剂量的十分之一。
2.3分组与给药:88只糖尿病小鼠随机分为11组,每组8只;正常组8只。正常组、模型组均给予0.1%CMC-Na溶液;阳性药组给予二甲双胍150mg/(kg·d)。配方筛选组,共九组,分别给予配方一到配方九。
实施例2中①中样品,四种提取物得率分别为:黄连提取物17.47%,湖北麦冬多糖提取物31.25%,苦瓜提取物1.78%,决明子提取物3.72%。
以上述所得四种中药提取物作为考察因子,按照均匀设计表U9(94)设计试验。按照2.2 讨论结果及四种提取物提取率,换算得小鼠各提取物服用范围分别为:黄连提取物16-136 mg/(kg·d),湖北麦冬多糖提取物60-620mg/(kg·d),苦瓜提取物11-139mg/(kg·d),决明子提取物8-72mg/(kg·d)。以最低剂量为水平1,最高剂量为水平9,各水平均匀分布,安排均匀设计实验U9(94)(如表3-1,3-2)。各配方依次记为配方一至配方九。
按表3-2加入相应质量的中药提取物,0.1%CMC-Na溶液混悬,4℃冰箱贮存备用。
表3-1均匀设计因素水平表U9(94)
表3-2各水平四种中药提取物的配伍比例(mg/(kg·d))
3提取物配伍比例的筛选实验结果
3.1不同配方对糖尿病小鼠生存状况的影响:造模前,所有小鼠精神良好,毛色有光泽,尿量无异常。造模后,正常组生存状况无明显改变;糖尿病组小鼠,精神萎靡,毛发无光泽,尿量明显增多。给药四周后,给药组小鼠生存状况有不同程度的改善。各组无小鼠死亡。
3.2不同配方对糖尿病小鼠空腹血糖值(FBG)的影响:在给药第0天,给药后第7天、14 天、21天、28天分别将各组小鼠禁食12h,尾尖取血用血糖仪测定FBG,将给药前后各组小鼠FBG与模型组进行配对t检验,有统计学差异(p<0.05)的给药组视为具有降糖活性。血糖改变幅度(%)=(FBG0天-FBG28天)/FBG0天。如表3-3所示,第28天与第0天的血糖相比,阳性药组、配方二、配方六、配方七血糖显著下降(p<0.05),血糖下降幅度分别达41.41%、15.33%、40.80%、16.06%。如图2所示,阳性药在给药后第一周内即体现降糖活性,与模型组相比有显著性差异(p<0.01),之后持续体现降糖效果;配方六在第一周内血糖有所上升;第二周起,与模型组相比血糖显著下降(p<0.05)。以上数据说明,配方二、配方六、配方七对糖尿病小鼠均具有不同程度的降糖作用,其中配方六效果最好。
表3-3不同配方对糖尿病小鼠空腹血糖的影响(n=8,mmol/L)
3.2不同配方对糖尿病小鼠口服葡萄糖耐量(OGTT)的影响:正常情况下,进食后血糖会暂时升高,但随着胰岛素的释放,2h后,血糖即可恢复正常。若葡萄糖耐量降低,则意味着机体糖代谢异常。通过观察药物对OGTT的影响,可评价药物是否具有改善糖代谢的作用。
给药24天后,禁食12h。各组小鼠分别灌胃给予葡萄糖2.5g/kg,分别于0h,0.5h、1h、 2h尾尖取血测定血糖值,绘制血糖变化图(图3),t检验比较各时间点的血糖值,计算2h阴影下面积(AUC)。2h AUC=1/4(0h血糖值)+1/2(0.5h血糖值)+3/4(1h血糖值)+1/2 (2h血糖值)(表3-4)。与模型组相比,阳性药组、配方一、二、三、五、六、七AUC显著下降(p<0.05),降幅分别为47.32、10.53%、25.63%、15.71%、10.65%、45.52%、19.72%。。以上数据说明,配方一、二、三、五、六、七均能恢复糖尿病小鼠葡萄糖耐量,降低餐后2h 血糖水平,其中以配方六效果最好。
表3-4不同配方对糖尿病小鼠OGTT的影响(n=6,mmol/L)
3.3不同配方对糖尿病小鼠糖化血红蛋白(HbA1c)的影响
糖化血红蛋白(HbA1c)是血液中携带氧的血红蛋白与血糖结合的产物,其浓度与血糖浓度成正比。糖化血红蛋白可反映体内一段时间整体的血糖水平。因此,近年来受到医学界的重视,被推荐为糖尿病诊断的重要指标。
给药28天后,小鼠眼眶取全血,测定糖化血红蛋白(HbAlc),结果如表3-5所示,与模型组相比,阳性药组、配方六糖化血红蛋白显著下降(p<0.01),趋于正常;配方二、配方七糖化血红蛋白显著下降(0.01≤p<0.05)。配方二、配方六与配方七均可显著降低糖尿病小鼠糖化血红蛋白,其中配方六效果较好。
3.4不同配方对糖尿病小鼠总胆固醇(TC),总甘油三酯(TG)的影响
给药28天后,小鼠眼眶取全血,静置,4500rpm离心10min,取血清,严格按照试剂盒说明书测定总胆固醇(TC),总甘油三酯(TG)。结果如表3-5所示,与模型组相比,阳性药组、配方一至配方三,配方六至八组糖尿病小鼠总胆固醇(TC)显著下降(p<0.01),其中配方六效果最好;与模型组相比,正常组、阳性药组、配方一至九总甘油三酯(TG)显著下降(p<0.05),其中以配方六效果最好。以上数据说明,组合物配伍中配方一到配方八均能改善糖尿病小鼠体内脂代谢状态,以配方六效果为佳。
4配方筛选实验数据拟合
以各中药提取物质量为变量,检测指标为因变量,建立提取物与指标的数据矩阵。因为各中药提取物取值范围相差较大,各生化指标与各中药提取物量纲不一致,所以拟合回归方程前需对各提取物日服剂量、各生化指标数据进行极差标准化处理,对原始数据进行线性变换。设Amin和Amax分别为属性A的最小值和最大值,将A的一个原始值x通过极差标准化映射成在区间[0,1]中的值x',其公式为:本实验以四味中药提取物为四因素,即黄连,湖北麦冬,苦瓜及决明子日服剂量的标准化数据分别为自变量X1,X2,X3,X4,因变量为各指标的标准化数据。将上述数据录入数据处理软件,以二次多项式逐步回归模型对数据进行分析,得到各指标的回归方程以及相应的拟合参数。通过相关系数、调整后相关系数及F值分析判定回归模型的有效性。所得拟合方程以网格法求最大值。
4.1血糖变化幅度数据拟合:因分组时血糖有一定差异,故不适宜直接以血糖值为衡量指标。实验结果表明,各干预组小鼠给药前后的血糖呈现相对一致的改变趋势,故本实验以各给药组血糖变化幅度为指标,拟合回归方程。血糖改变幅度Y:
对X1,X2,X3,X4,Y分别进行数据标准化,将标准化后的数据输入程序,得二次多项式拟合方程:
Y=0.489+0.823X1+1.255X2-0.999X1*X1-1.972X2*X2-0.126X3*X3+0.535X1*X3(式1)
将式1输入MATLAB 14.0,以网格法求方程极值及相应优水平(表7)。当黄连提取物为 0.6834(数据标准化,下同),湖北麦冬多糖提取物为0.3180,苦瓜提取物为1.000(即取值范围内最大)时,降糖效果最好。苦瓜提取物(X3)回归系数较小,提示与黄连、湖北麦冬提取物相比,苦瓜提取物降糖效果较小。从式1可知,苦瓜提取物总体呈现出一定的降糖活性且随剂量增大而增大;但随着剂量增大,其降糖活性上升的趋势逐渐放缓。将黄连、湖北麦冬提取物优水平代入式1计算,知当苦瓜提取物剂量为100、110、120、130、140mg/(kg·d)时,降糖幅度分别为39.0%,40.2%,41.3%,42.2%,43.0%。决明子提取物(X4)在回归方程中未出现,表明决明子提取物无显著的降糖作用。
拟合参数见表3-6,当Y取最大值时,对应的四味中药提取物的水平见表3-7。
4.2两小时口服糖耐量(2h OGTT)阴影下面积(AUC)数据拟合:数据标准化后AUC记为YAUC,将标准化后的数据输入程序,得二次多项式拟合方程:
YAUC=0.753-1.004X1-1.659X2+1.256X1*X1+2.478X2*X2-0.796X1*X3。(式2)
如式2所示,影响2h口服糖耐量的主要因素是黄连提取物、湖北麦冬多糖提取物。将式2输入MATLAB 14.0,以网格法求方程极值及相应优水平(表3-7)。当黄连提取物为0.7127,湖北麦冬多糖提取物为0.3350,苦瓜提取物为1.000(即取值范围内最大)时,改善口服糖耐量效果最好。式2中含有X1*X3项,提示黄连提取物与苦瓜提取物连用,显示出一定的改善口服糖耐量的趋势,但其回归常数较小,故苦瓜提取物改善口服糖耐量能力比黄连、湖北麦冬多糖提取物稍差。决明子提取物(X4)在回归方程中未出现,表明决明子提取物无显著的改善口服糖耐量的作用。这与血糖下降幅度的拟合结果一致。
拟合参数见表3-6,当YAUC取最大值时,对应的四味中药提取物的水平见表3-7。
4.3糖化血红蛋白(HbA1c)数据拟合:数据标准化后HbA1c记为YA1C,将标准化后的数据输入程序,得二次多项式拟合方程:
YA1C=0.694-0.982X1-1.565X2+1.222X1*X1+2.323X2*X2-0.678X1*X3(式3)。
如式3所示,影响糖化血红蛋白的主要因素是黄连提取物与湖北麦冬多糖提取物。将式 3输入MATLAB 14.0,以网格法求方程极值及相应优水平(表3-7)。当黄连提取物为0.6999,湖北麦冬多糖提取物为0.3479,苦瓜提取物为1.000(即取值范围内最大)时,降低HbA1c 效果最好。式2中含有X1*X3项,提示黄连提取物与苦瓜提取物连用,显示出一定的降低HbA1c 的趋势,但其回归常数较小,故苦瓜提取物降低HbA1c能力比黄连、湖北麦冬多糖提取物稍差。决明子提取物(X4)在回归方程中未出现,表明决明子提取物无显著的改善口服糖耐量的作用。这与4.1,4.2的结果一致。
拟合参数见表3-6,当YA1C取最大值时,对应的四味中药提取物的水平见表3-7。
4.4血清总胆固醇(TC),总甘油三酯(TG)数据拟合:数据标准化后TC记为YTC,将标准化后的数据输入程序,得二次多项式拟合方程:
YTC=0.990-3.098X2-0.142X4+3.435X2*X2+0.256X3*X3-0.755X1*X2-1.346X1*X3(式4)
将式4输入MATLAB 14.0,以网格法求方程极值及相应优水平(表3-7)。当湖北麦冬多糖提取物为0.3426,黄连、苦瓜及决明子提取物为1.000(即值范围内最大)时,降低TC效果最好。数据标准化后TG记为YTG,将标准化后的数据输入程序,得二次多项式拟合方程:
YTG=1.907-0.788X1-1.628X4+0.476X1*X1-1.259X4*X4(式5)
如式5所示,组合物降低总胆固醇的作用主要与黄连提取物、决明子提取物有关。将式 4输入MATLAB 14.0,以网格法求方程极值及相应优水平(表3-7)。当黄连提取物为0.8363,决明子提取物为0.6424时,降低TG效果最好。
拟合参数见表3-6,当YTC,YTG取最大值时,对应的四种中药提取物的水平见表3-7。
4.5组合物中各提取物的配伍比例的优化:各回归方程拟合参数如表3-6所示。应用网格法计算拟合方程,所得极值与该极值所对应的组方配比如表7所示。如表3-6所示,五个指标所拟合的二项式回归方程的相关系数及调整后相关系数均接近1,预报效果较好;各回归方程p 值均小于0.05,回归模型显著。以血糖改变幅度、TG及HbA1c为评价指标,黄连提取物最优水平均约为0.7(标准化),这与配方筛选的实验结果是吻合的,说明回归方程的建立具有合理性;2h OGTT AUC为指标,黄连提取物最优水平为0.8左右,该剂量下,黄连提取物降低胰岛素抵抗的功效最佳;而以TC为指标,最优水平为1,即给药剂量为剂量范围内最大。黄连性味苦寒,大剂量或长期应用有“苦寒败胃”之虞;发明人在药理学预实验中发现,黄连中小檗碱可导致实验动物出现腹胀、便秘等副反应,故将黄连提取物剂量按照血糖改变幅度、TG及HbA1c三项所得,设定为0.7,所对应的小鼠日服剂量为96mg/(kg·d),所对应的成人(按70kg算,下同)日服剂量为0.73g/d;所对应的成人日服生药量为4.2g。
由表3-7可知,组合物中,湖北麦冬多糖提取物水平(标准化)处于约0.31-0.35时,即当其日服剂量约为230-260mg时,其降糖降脂、改善胰岛素抵抗的效果较优。实验数据及拟合方程均说明,高剂量的湖北麦冬多糖提取物不利于血糖的下降。综上,将湖北麦冬多糖提取物优水平设定为0.33,所对应的小鼠日服剂量为244mg/(kg·d),所对应的成人日服剂量为 1.88g/d;所对应的成人日服生药量为6.0g。
从各拟合方程(式1~5)可知,苦瓜提取物的回归系数均较小,推测其降糖、改善机体胰岛素抵抗的能力较黄连提取物、湖北麦冬多糖提取物弱,其降脂能力较黄连提取物、决明子提取物弱。将苦瓜提取物优水平设定为取值范围内最大,即优水平为1,降糖降脂效果最好,所对应的小鼠日服剂量为139mg/(kg·d),所对应的成人日服剂量为1.07g/d;所对应的成人日服生药量为60.0g。
从式1~3可知,与降糖活性相关的回归方程中,决明子提取物项未出现或回归系数较小,说明决明子提取物降糖活性较弱。从式4、5可知,决明子提取物表现出较强的降脂活性。此外,加入决明子提取物后,各组未出现小鼠死亡,说明决明子提取物的加入可有效对抗小檗碱导致的腹胀、便秘的副作用。但因为决明子具有泻下作用,剂量不宜太大,故按式5(以 TG为指标)拟定其日服剂量,即49mg/(kg·d)所对应的小鼠日服剂量为,所对应的成人日服剂量为0.38g/d;所对应的成人日服生药量为10.1g。
综合降糖降脂活性及改善胰岛素抵抗的功效,同时参考各拟合方程的拟合效果,本发明将中药提取物组合物对应的人日服剂量(生药)定为:黄连4.2g,湖北麦冬6.0g,鲜苦瓜 60.0g,决明子10.1g。
表3-6各回归方程回归参数表
表3-7拟合方程极值及四种提取物相应的最优水平
注:“-”表示回归方程无该项。
实施例4:为进一步说明本发明组合物对糖尿病及糖尿病肾病大鼠的治疗作用,发明人以STZ 诱导的糖尿病大鼠模型进行实验,实验资料如下:
1仪器与试药:仪器、试药、中药提取物及本发明组合物样品的制备同实施例1。
Synergy HT多功能酶标仪(Biotek,美国)。
水煎煮组处方:黄连4.4g,湖北麦冬6.0g,苦瓜(饮片)3.8g(相当于鲜品60g),决明子6.7g。水煎煮方法:所有中药冷浸30min,水面超过药液2-5cm,煎煮一次。煎煮液过滤,浓缩至0.6g/ml(生药量),4℃贮存备用。
链脲佐菌素(STZ)购自Sigma Aldrich(美国)。盐酸二甲双胍片,中美上海施贵宝。大鼠胰岛素试剂盒,武汉贝茵莱生物科技有限公司;大鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β (IL-1β)、白介素-6(IL-6)试剂盒,武汉基因美生物科技有限公司。总超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)试剂盒,南京建成生物工程研究所。RAGE(ab3611)、iNOS(ab3523)抗体,Abcam公司;β-actin,天津三箭。其余试剂均购自国药集团,分析纯(AR)。
本实验所用的单味药材提取物及中药提取物组合物,经质量检测,均符合规定。具体检测方法及检测结果见相关实施例。
2实验方法
2.1实验动物与糖尿病模型的建立:Wistar大鼠,雄性,180-220g/只,由湖北省疾病预防控制中心提供,合格证号:42000600030482。本实验遵循《湖北省实验动物管理条例》的指导方针。动物实验方案经华中科技大学同济医学院实验动物伦理委员会批准。大鼠购入后适应性饲养1周,期间自由饮水、饮食,室温控制在(22±2)℃,湿度60%左右,光照12h和黑暗12h循环。适应性喂养后,大鼠分为两大组:一组(7只)继续以普通饲料喂养,一组(94只)以高脂高糖饲料(D12451,武汉鼠来宝生物科技有限公司)喂养,建立STZ诱导的糖尿病大鼠模型。喂养2周。高脂高糖饲料组大鼠在禁食不禁水12h后,腹腔注射STZ 40mg/kg(柠檬酸钠缓冲溶液溶解,pH 4.5);正常组大鼠腹腔注射柠檬酸钠缓冲溶液。7天后禁食不禁水10h,尾尖取血测血糖,血糖值(FBG)小于11.1mmol/L的大鼠禁食12h后补充腹腔注射STZ20mg/kg。7天后测量大鼠禁食10h血糖值,FBG大于11.1mmol/L的大鼠选取为糖尿病大鼠。
2.2分组及给药:42只糖尿病大鼠随机分为6组,每组7只;正常组7只。灌胃体积5ml/kg。实验过程中,正常组大鼠以普通饲料喂养,糖尿病大鼠以高脂高糖饲料喂养。1)正常组:给予0.1%CMC-Na溶液;2)模型组:给予0.1%CMC-Na溶液;3)阳性药组:给予二甲双胍150mg/(kg·d);4)水煎煮组:按照3.0g/(kg·d)(生药量)给药。5-7)本发明组合物低、中、高剂量。如实施例2中2)项下,制备组合物二,给药剂量分别为260mg/(kg·d)、380mg/(kg·d)、 500mg/(kg·d)。
给药前0天,给药后7、14、21、28、35、42、49、56天,禁食10h,称重,测空腹血糖(FBG)。给药52天后,禁食12h,进行口服葡萄糖耐量(OGTT)实验;给药56天时,将大鼠置于代谢笼中收集24h尿液冷冻备用。给药60天后,禁食10h,称重,用戊巴比妥钠45mg/kg麻醉,心脏取血。一部分血液4℃静置2h后,4500转每分钟离心10min取血清,一部分置于含EDTA的采血管中,用于生化指标的测定。
3本发明组合物对STZ所致大鼠糖尿病及糖尿病肾病的功效:本发明组合物对于由于 STZ所致大鼠糖尿病具有良好的疗效,并具有治疗糖尿病肾病的功效。结果如下:
3.1组合物对糖尿病大鼠体重的影响:造模前,所有大鼠精神良好,毛色有光泽,尿量无异常。造模后,正常组生存状况无明显改变;糖尿病组大鼠,精神萎靡,毛发无光泽,尿量明显增多。给药八周后,给药组大鼠生存状况有不同程度的改善。各组无大鼠死亡。给药第 0、7、14、21、28、35、42、49、56天,将大鼠禁食10h,测定各组大鼠体重。数据进行统计学处理,观察各组动物体重变化。结果见图4。结果表明,与第0天体重相比,除模型组外各干预组体重均有所上升(p<0.01)。模型组自第四周后,体重呈现下降趋势。结果表明,给药8周后,糖尿病大鼠体重减轻的症状得到改善。
3.2组合物对糖尿病大鼠长期血糖的影响:如表4-1、图5所示,与正常组大鼠相比,模型组空腹血糖水平一直维持在较高水平(≥11.1mmol/L),表明糖尿病大鼠造模成功。组合物或阳性药二甲双胍干预后,血糖出现不同程度的下降。其中,阳性药组、组合物高剂量组降糖效果较为显著,自第二周开始,血糖即开始显著下降(p<0.05)。随着给药时间的推移,水煎煮组、中低剂量组亦显示出降糖效果,至8周后,各干预组血糖均显著下降(p<0.01)。其中,组合物高剂量组降糖效果与阳性药无显著性差异(p>0.05)。
表4-1组合物对糖尿病大鼠长期血糖的影响(n=7,mmol/L)
3.3组合物对糖尿病大鼠口服糖耐量(OGTT)的影响:计算2h阴影下面积(AUC):2hAUC=1/4(0h血糖值)+1/2(0.5h血糖值)+3/4(1h血糖值)+1/2(2h血糖值)。如表4-2、图6所示,模型组糖尿病大鼠葡萄糖耐受能力严重受损,给予葡萄糖1h后,血糖一直升高,机体无法有效降低血糖。给予葡萄糖2h后,血糖有所下降,但依然处于极高水平。给药8 周后,各干预组糖代谢状况均有不同程度的改善。
表4-2消渴饮水方对糖尿病大鼠口服糖耐量(OGTT)的影响(n=6,mmol/L)
3.4组合物对糖尿病大鼠空腹胰岛素(FINS),胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)糖化血红蛋白 (HbA1c)的影响:取适量血清,ELISA法测定大鼠FINS;取适量全血,Primus Ultra2糖化仪检测糖化血红蛋白。如表4-3所示,模型组空腹胰岛素水平下降,这可能是由于长期的高血糖引起的胰岛β细胞破坏所造成的。组合物低、中、高剂量以及水煎煮组胰岛素水平有上升的趋势,这可能是由于组合物具有促胰岛素释放的作用。胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)是评判胰岛素抵抗的重要指标,其计算公式为:HOMA-IR=FINS(μIU/ml)×FBG(mmol/L)/22.5。给药8周后,各干预组胰岛素抵抗指数有显著下降(p<0.01)。说明组合物可有效改善糖尿病大鼠胰岛素抵抗的状态。如表4-3所示,与正常组相比,模型组大鼠糖化血红蛋白较高,存在严重的胰岛素抵抗(p<0.01)。给药8周后,各干预组糖化血红蛋白水平明显降低,胰岛素抵抗减轻(p<0.01)。其中组合物高剂量组改善胰岛素抵抗、降低糖化血红蛋白的功效与阳性药无显著性差异(p>0.05)。
表4-3组合物对糖尿病大鼠FINS,HOMA-IR及HbA1c的影响(n=7)
3.5组合物对糖尿病大鼠胰岛β细胞病理改变的影响:取胰脏组织,石蜡包埋,切片,苏木精 -伊红(HE,Hematoxylin-Eosin)染色法染色固定。显微镜记录成像系统观察病理改变。胰岛病理组织切片见图7。正常组(NC)大鼠胰岛形态正常,胰岛细胞较多,边界清晰。模型组 (DM)大鼠胰岛数目明显减少,边界不清,胰岛细胞变性。给药八周后,与模型组相比,阳性药组(DM+MET)胰岛形态基本正常,边界清晰;水煎煮组(DM+D)、组合物低剂量组(DM+XL)部分胰岛细胞变性,边界不太清晰;组合物中剂量组(DM+XM)、组合物高剂量组(DM+XH)胰岛细胞略有变性,边界较为清晰。
3.6组合物对糖尿病大鼠血脂的影响:二型糖尿病常伴有脂质代谢紊乱。脂肪组织通过释放非酯化脂肪酸(non-esterified fatty acids,NEFAs)。如果脂质代谢紊乱,过量的NEFAs则会导致导致胰岛素抵抗和胰岛素β细胞功能受损。取部分血清,全自动生化仪检测总胆固醇(TC)、总甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。如表4-4所示,模型组糖尿病大鼠TC、TG及LDL-C较正常组显著升高,而HDL-C水平显著降低(p<0.01),说明高脂高糖饲养4周后,糖尿病大鼠体内脂代谢严重紊乱。给药8周后,与糖尿病大鼠比较,各干预组HDL-C水平升高而TC、TG及LDL-C水平降低,说明组合物对糖尿病大鼠脂代谢有调节作用。
表4-4组合物对糖尿病大鼠血脂的影响(n=7)
3.7组合物对糖尿病大鼠体内炎症因子的影响
二型糖尿病患者常伴有肥胖。肥胖造成大量脂肪组织的堆积,而这些脂肪组织是活跃的分泌器官。脂肪细胞所分泌的白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α) 等,均不同程度地参与到胰岛素抵抗的发生。
取部分血清,ELISA法测定大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α,结果如表4-5所示。相比正常组,模型组血清炎症因子含量显著升高(p<0.01)。给药八周后,各干预组均可显著降低糖尿病大鼠血清中炎症因子的水平(p<0.01)。其中,组合物高剂量在降低血清中TNF-α、IL-1β的作用,显著优于二甲双胍(p<0.01);降低血清中IL-6的作用优于二甲双胍(0.01≤p<0.05)。组合物高剂量在降低血清TNF-α的作用显著优于阳性药(p<0.01)。
表4-5组合物对糖尿病大鼠体内炎症因子的影响(n=7)
3.8组合物对糖尿病大鼠体内氧化应激环境的影响:炎症反应与氧化应激互为因果,两者共同作用,加剧胰岛β细胞及其他组织细胞的损伤,加速糖尿病及其并发症的发生发展。
取部分血清,严格按照试剂盒说明书测定大鼠血清总超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)的活性及的丙二醛(MDA)含量,结果如表 4-6所示。
相比正常组,模型组血清T-SOD、GSH-Px及CAT活性显著降低(p<0.01),MDA含量显著升高(p<0.01)。给药八周后,与模型组相比,阳性药、水煎煮组、组合物各剂量组均可显著提升糖尿病大鼠血清中T-SOD、GSH-Px及CAT的活性(p<0.01),降低MDA含量 (p<0.01)。其中,组合物高剂量提升糖尿病大鼠血清中T-SOD、GSH-Px活性的功效,显著优于二甲双胍(p<0.01);提升糖尿病大鼠血清中CAT活性、降低血清中MDA含量的作用优于二甲双胍(0.01≤p<0.05)。
表4-6组合物对糖尿病大鼠体内氧化应激环境的影响(n=6)
3.9组合物对糖尿病大鼠肾功能的影响:大鼠处死后,取下双肾,迅速以生理盐水洗净双肾表面,滤纸吸干水分,称重。如表4-7所示,模型组大鼠双肾占体重比显著上升。给药8周后,各干预组双肾体重比显著下降(p<0.01)。给药后56天,将大鼠至于代谢笼收集尿液。大鼠处死后,心脏取血,取部分血清,全自动生化分析仪测定血肌酐(Scr)、血尿素(BUN)浓度。如表4-7所示,糖尿病大鼠24h尿量、尿蛋白、血肌酐及血氮素均显著高于正常大鼠 (p<0.01)。给药8周后,各干预组24h尿量、尿蛋白均明显降低(p<0.01)。糖尿病大鼠BUN、 Scr均显著提高,给药8周后,组合物可显著降低糖尿病大鼠BUN、Scr含量(p<0.01)。组合物高剂量可有效对抗高血糖对糖尿病大鼠肾功能的损伤,在减少尿量、尿蛋白及血肌酐方面的作用,优于阳性药(p<0.01);减轻双肾重量、降低血氮素的作用与阳性药无统计学差异(p≥0.05)。组合物高剂量组疗效略优于阳性药。
表4-7组合物对糖尿病大鼠肾功能的影响(n=7)
3.10组合物对糖尿病大鼠肾脏病理改变的影响
取小块肾脏组织,石蜡包埋,切片,分别用苏木精—伊红(HE,Hematoxylin-Eosin)染色法,Masson染色法,过碘酸-雪夫(PAS,Periodic Acid-Schiff)染色法染色固定。Olympus CX31显微镜记录成像系统观察病理改变。
HE染色结果(图8A)显示,正常组(NC)肾小球结构正常,系膜细胞和系膜基质无明显增生,肾小管结构正常,无糖原沉积。模型组(DM)肾小球系膜细胞、系膜基质与基底膜明显增生,囊腔狭窄,肾小管上皮细胞透明变性,有糖原沉积。给药八周后,与模型组相比,阳性药组(DM+MET)肾小球形态基本正常,肾小管上皮细胞基本正常,有少量糖原沉积;水煎煮组(DM+D)、组合物高剂量组(DM+XL)、组合物高剂量组(DM+XM)肾小球系膜部分增生,肾小管上皮细胞部分空泡,仍有糖原沉积;组合物高剂量组(DM+XH)肾小球、肾小管基本正常,基本无糖原沉积。Masson染色结果(图8B)正常组(NC)肾小球肾小管形态完好,未见纤维化;模型组(DM)肾小球分叶明显,肾小管上皮透明变性,肾间质出现部分纤维化;给药八周后,与模型组相比,阳性药组(DM+MET)、组合物各剂量组(DM+XH, DM+XM,DM+XL)肾间质无明显纤维化。PAS染色结果(图8C),正常组(NC)肾小球系膜基质未见增厚。模型组(DM)肾小球分叶,系膜细胞和基质增厚明显,PAS阳性物质增多。给药八周后,水煎煮组(DM+D)、组合物高剂量组(DM+XL)、组合物高剂量组(DM+XM) 肾小球系膜细胞部分增厚,阳性药组(DM+MET)、组合物高剂量组(DM+XH)肾小球系膜未见增厚。肾脏病理结果显示,组合物对糖尿病肾病有一定的治疗作用。
4组合物对糖尿病肾病大鼠保护作用机制
4.1组合物对糖尿病大鼠肾脏糖基末端产物受体(RAGE)表达的影响:长期高血糖可导致肾脏组织中RAGE表达上调,进一步导致肾小球肥大、间质增生。如图9所示,正常组(NC) 肾小球和肾小管部位见微量深棕色染色,RAGE表达很少。模型组(DM)肾小管部位可见大量深棕色染色,染色范围和染色深度明显增强,有明显的RAGE表达,为强阳性。给药八周后,与模型组对比,阳性药组(DM+MET)肾小管RAGE表达量很少,水煎煮组(DM+D)、组合物高剂量组(DM+XL)、组合物高剂量组(DM+XM)、组合物高剂量组(DM+XH)肾小管部位染色减少,RAGE表达减少。结果显示,组合物可能是通过降低RAGE的表达,从而治疗糖尿病肾病。
4.2组合物对糖尿病大鼠肾脏NO含量、iNOS表达量的影响:NO增多是造成糖尿病早期肾小球高滤过状态的因素之一,而糖尿病早期肾小球高滤过状态是DN发生的始动因素。糖尿病早期NO的增多是由于NOS表达增加引起的,包括诱导性一氧化氮合成酶(iNOS,inducible nitric oxide synthase)和结构性一氧化氮合成酶(cNOS,constructivenitric oxide synthase)表达的增加。取10%大鼠肾脏组织匀浆,严格按照试剂盒说明书测定肾脏组织蛋白含量、NO含量,计算肾脏组织NO含量。如图10所示,与正常组相比,模型组肾脏组织NO 含量增加(p<0.01)。给药八周后,各干预组可显著降低糖尿病大鼠肾脏组织的NO含量 (p<0.05)。Western Blot结果显示(图11),与正常组相比,模型组肾脏iNOS表达量上调。给药八周后,各干预组iNOS表达量下降。结果显示,组合物可能是通过降低iNOS的表达,减少NO的生成,从而减轻肾小球高滤过状态,延缓糖尿病肾病的发展进程。
实施例5:本发明组合物胶囊的制备:在1032g本发明组合物三中加入18g微晶纤维素,混匀,过筛,干燥后,制得药物胶囊的药用原料。药用原料填充入3000个胶囊中,制得每个含 0.35g本发明组合物的药物胶囊,相当于每个胶囊含黄连生药材0.392g、麦冬生药材0.527g、鲜苦瓜4.043g、决明子0.753g。建议成人每天服用本发明组合物胶囊早中晚饭前各一次,每次4粒胶囊,连续服用4周以上。
实施例6:本发明组合物片剂的制备:在1032g本发明组合物三中加入18g微晶纤维素,混匀,过筛,干燥后,制得药物片剂的药用原料。药用原料干法制颗粒压片,制得3000片本发明果聚糖的药物片剂,每片含0.35g本发明组合物,相当于每个药片含黄连生药材0.392g、麦冬生药材0.527g、鲜苦瓜4.043g、决明子0.753g。建议成人每天服用本发明果聚糖片剂早中晚饭前各一次,每次4片,连续服用4周以上。
实施例7:本发明组合物丸剂的制备:将1260g本发明组合物三,粉碎过筛,加水泛丸,干燥,即得18000颗药丸,每个药丸含0.07g本发明组合物,相当于每个药丸含黄连生药材 0.0784g、麦冬生药材0.105g、鲜苦瓜0.809g、决明子0.151g。建议成人每天服用本发明组合物胶囊早中晚饭前各一次,每次20丸,连续服用4周以上。
实施例8:本发明组合物颗粒剂的制备:将1240g本发明组合物三,粉碎,过筛,混合,加入20g微晶纤维素制软材,干燥后,过筛整粒,制得药物颗粒剂的药用原料。药用原料填充入600袋颗粒剂中,制得每个含2.1g本发明组合物的药物胶囊,相当于每袋颗粒剂含黄连生药材2.352g、麦冬生药材3.162g、鲜苦瓜24.258g、决明子4.518g。建议成人每天服用本发明组合物胶囊早晚饭前各一次,每次一袋,连续服用4周以上。
实施例9
如实施例1所述,同法制备黄连提取物、湖北麦冬多糖提取物、苦瓜提取物及决明子提取物,相应批号、生药重量、提取物重量、得率等信息见下表9-1至9-4。
表9-1七批黄连提取物的制备
表9-2七批湖北麦冬多糖提取物的制备
表9-3七批苦瓜提取物的制备
表9-4七批决明子提取物的制备
实施例10:1)取批号为HL2018011004的黄连提取物96份,批号为HBMD2017050605的湖北麦冬多糖提取物244份,批号为KG2017122404的苦瓜提取物139份,批号为JMZ2018011613的决明子提取物49份,充分碾碎混匀,制备得批号为XKYS2018122104的中药提取物组合物。该组合物为棕黄色粉末,味极苦。其中,黄连提取物占该组合物的比例为18.2%,湖北麦冬多糖提取物为46.2%,苦瓜提取物为26.3%,决明子为9.3%。每克批号为XKYS2018122104的组合物中,相当于含黄连1.07克,湖北麦冬1.37克,鲜苦瓜14.0克,决明子2.35克。
2)取批号为HL2018052105的黄连提取物96份,批号为HBMD2017080106的湖北麦冬多糖提取物244份,批号为KG2018010305的苦瓜提取物139份,批号为JMZ2018011614的决明子提取物49份,充分碾碎混匀,制备得批号为XKYS2018122105的中药提取物组合物。该组合物为棕黄色粉末,味极苦。其中,黄连提取物占该组合物的比例为18.2%,湖北麦冬多糖提取物为46.2%,苦瓜提取物为26.3%,决明子为9.3%。每克批号为XKYS2018122105 的组合物中,相当于含黄连1.16克,湖北麦冬1.37克,鲜苦瓜12.5克,决明子2.39克。
3)取批号为HL2018052106的黄连提取物96份,批号为HBMD2017111307的湖北麦冬多糖提取物244份,批号为KG2018010306的苦瓜提取物139份,批号为JMZ2018011615的决明子提取物49份,充分碾碎混匀,制备得批号为XKYS2018122106的中药提取物组合物。该组合物为棕黄色粉末,味极苦。其中,黄连提取物占该组合物的比例为18.2%,湖北麦冬多糖提取物为46.2%,苦瓜提取物为26.3%,决明子为9.3%。每克批号为XKYS2018122106 的组合物中,相当于含黄连1.12克,湖北麦冬1.46克,鲜苦瓜14.8克,决明子2.49克。
4)取批号为HL2018101407的黄连提取物96份,批号为HBMD2018012408的湖北麦冬多糖提取物244份,批号为KG2018011407的苦瓜提取物139份,批号为JMZ2018030716的决明子提取物49份,充分碾碎混匀,制备得批号为XKYS2018122107的中药提取物组合物。该组合物为棕黄色粉末,味极苦。其中,黄连提取物占该组合物的比例为18.2%,湖北麦冬多糖提取物为46.2%,苦瓜提取物为26.3%,决明子为9.3%。每克批号为XKYS2018122107 的组合物中,相当于含黄连1.06克,湖北麦冬1.55克,鲜苦瓜13.5克,决明子2.34克。
5)取批号为HL2018101408的黄连提取物96份,批号为HBMD2018040309的湖北麦冬多糖提取物244份,批号为KG2018051608的苦瓜提取物139份,批号为JMZ2019040817的决明子提取物49份,充分碾碎混匀,制备得批号为XKYS2019062008的中药提取物组合物。该组合物为棕黄色粉末,味极苦。其中,黄连提取物占该组合物的比例为18.2%,湖北麦冬多糖提取物为46.2%,苦瓜提取物为26.3%,决明子为9.3%。每克批号为XKYS2019062008 的组合物中,相当于含黄连1.03克,湖北麦冬1.49克,鲜苦瓜14.6克,决明子2.53克。
6)取批号为HL2019051109的黄连提取物96份,批号为HBMD2018040310的湖北麦冬多糖提取物244份,批号为KG2018051609的苦瓜提取物139份,批号为JMZ2019041318的决明子提取物49份,充分碾碎混匀,制备得批号为XKYS2019062009的中药提取物组合物。该组合物为棕黄色粉末,味极苦。其中,黄连提取物占该组合物的比例为18.2%,湖北麦冬多糖提取物为46.2%,苦瓜提取物为26.3%,决明子为9.3%。每克批号为XKYS2019062009 的组合物中,相当于含黄连0.94克,湖北麦冬1.60克,鲜苦瓜12.7克,决明子2.49克。
7)取批号为HL2019051110的黄连提取物96份,批号为HBMD2018040311的湖北麦冬多糖提取物244份,批号为KG2018061410的苦瓜提取物139份,批号为JMZ2019041819的决明子提取物49份,充分碾碎混匀,制备得批号为XKYS2019062010的中药提取物组合物。该组合物为棕黄色粉末,味极苦。其中,黄连提取物占该组合物的比例为18.2%,湖北麦冬多糖提取物为46.2%,苦瓜提取物为26.3%,决明子为9.3%。每克批号为XKYS2019062010 的组合物中,相当于含黄连1.00克,湖北麦冬1.58克,鲜苦瓜14.0克,决明子2.35克。
实施例11:下述实验中所用的苦瓜葫芦烷型三萜对照品均为自制。新鲜苦瓜(20kg)压榨后取榨汁液;残渣加入70%的乙醇冷浸过夜,收集冷浸液,重复2次;回收溶剂,加水混悬。苦瓜水混悬液以氯仿萃取,收集氯仿层,回收溶剂,得氯仿部位132.5g。氯仿部位经反复柱层析纯化,得苦瓜皂苷L(152mg)、 3-O-β-D-allopyranosyl,7,25-dihydroxycucurbita-5,23(E)-dien-19-al(81mg)、苦瓜皂苷F2(120 mg)。以面积归一法对三种葫芦烷型三萜皂苷进行纯度检验,其纯度均大于98%。三种三萜皂苷的结构式及纯度检验液相图谱见图12。三种三萜皂苷核磁共振(NMR)谱图数据如下。
苦瓜皂苷L为白色粉末。1H-NMR(400MHz,氘代甲醇),化学位移δ:9.85,(1H,s, H-19),5.96(1H,br d,J=5.6Hz,H-7),5.58(2H,m,重叠,H-23,24),4.24(1H,d, J=7.8,H-1’),1.25(9H,s,重叠,H-26,27,28),0.94(3H,d,J=5.6Hz,H-21),1.08, 0.94,0.83(均为3H,s,H-29,18,30),0.95(3H,d,J=5.9,H-21)。13C-NMR(100MHz,氘代甲醇),化学位移δ:210.3(C-19),147.9(C-5),140.9(C-24),125.8(C-6),123.4 (C-23),102.1(C-1’),78.1(C-5’),78.0(C-3’),77.0(C-3),75.0(C-2’),73.5(C-7), 71.7(C-4’),71.2(C-25),62.8(C-6’),51.3(C-9),51.2(C-17),48.8(C-14),46.9(C-8), 46.6(C-13),42.4(C-4),40.2(C-22),37.6(C-20),37.4(C-10),35.8(C-15),30.1(C-26), 30.1(C-27),30.0(C-12),29.8(C-2),28.4(C-16),27.8(C-29),26.0(C-28),23.2(C-11), 22.3(C-1),19.2(C-21),18.8(C-30),15.4(C-18)。NMR图谱见图13。上述波谱数据与 Okabe等在1982年发表在四面体通讯(Tetrahedron Letters,第23卷,第1期,77-80页)上的文献数据比对,确定为苦瓜皂苷L。
3-O-β-D-allopyranosyl,7,25-dihydroxycucurbita-5,23(E)-dien-19-al为白色粉末。1H-NMR (400MHz,氘代甲醇),化学位移δ:9.85,(1H,s,H-19),5.87(1H,brd,J=5.5Hz, H-6),5.58(2H,m,重叠,H-23,24),4.66(1H,d,J=7.8,H-1’),4.00(1H,brd,J=5.6Hz,H-7),1.26(6H,s,重叠,H-26,27),0.95(3H,d,J=5.6Hz,H-21),1.32,1.08, 0.92,0.82(均为3H,s,H-28,29,18,30),0.95(3H,d,J=5.9,H-21)。13C-NMR(100 MHz,氘代甲醇)化学位移δ:210.1(C-19),147.8(C-5),140.9(C-24),125.8(C-23), 123.3(C-6),103.8(C-1’),87.3(C-3),75.1(C-5’),73.2(C-2’),72.7(C-3’),71.2(C-25), 69.0(C-4’),66.7(C-7),63.3(C-6’),51.4(C-8),51.3(C-9),51.1(C-17),49.3(C-14), 46.6(C-13),42.5(C-4),40.3(C-22),37.6(C-20),37.3(C-10),35.7(C-15),30.1(C-27), 30.1(C-26),30.0(C-12),28.7(C-2),28.5(C-16),27.6(C-29),26.1(C-28),23.3(C-11), 23.0(C-1),19.2(C-21),18.7(C-30),15.3(C-18)。NMR图谱见图14。上述波谱数据与 Harinantenaina等在2006年发表在化学与药学简报(Chemical and Phamaceutical Bulletin,第 54卷,第7期,1017-1021页)上的文献数据比对,确定为 3-O-β-D-allopyranosyl,7,25-dihydroxycucurbita-5,23(E)-dien-19-al。
苦瓜皂苷F2为白色粉末。1H-NMR(400MHz,氘代氯仿),化学位移δ:6.03(br d,J=9.6Hz,H-6),5.55(均为1H,m,重叠,H-7,23,24),4.71(d,J=7.6Hz),1.29(6H,重叠,s,H-26,27);0.88(3H,s,H-29),1.14(3H,s,H-28),0.86(3H,m,重叠), 0.84(6H,重叠,H-18,30)。13C-NMR(100MHz,氘代氯仿),化学位移δ:139.5(C-24), 132.8(C-6),130.7(C-7),125.2(C-23),102.0(C-1’),86.4(C-5),84.2(C-3),79.8(C-19), 73.9(C-5’),71.5(C-2’),70.7(C-25),70.6(C-3’),68.3(C-4’),63.1(C-6’),52.0(C-8), 50.1(C-17),48.6(C-14),45.2(C-13),44.8(C-9),39.5(C-10),39.1(C-22),38.6(C-4), 36.2(C-20),33.2(C-15),30.7(C-12),29.9(C-27),29.8(C-26),28.0(C-16),27.4(C-2), 25.6(C-29),23.4(C-11),20.6(C-28),20.0(C-30),18.6(C-21),18.4(C-1),14.9(C-18)。 NMR图谱见图15。上述波谱数据与Okabe等在1982年发表在四面体通讯(Tetrahedron Letters,第23卷,第1期,77-80页)上的文献数据比对,确定为苦瓜皂苷F2。
实施例12:一种中药提取物组合物的质量检测方法
1.试剂与药品:乙腈购自美国Sigma Aldrich,实验用水为去离子水。硅胶G薄层板购自德国 Merck公司。其余试剂均购于国药集团化学试剂有限公司,分析纯。表小檗碱、黄连碱、巴马汀、盐酸小檗碱、非洲防己碱、药根碱、橙黄决明素购于中国药品生物制品鉴定所。对照品苦瓜皂苷L、3-O-β-D-allopyranosyl,7,25-dihydroxycucurbita-5,23(E)-dien-19-al、苦瓜皂苷F2为实验室自制。红莲霉素-6-O-β-龙胆二糖苷购于成都曼斯特,决明子苷C购于成都昂赛斯。
十批中药提取物组合物,批号:XKYS2018042301,XKYS2018042302,XKYS2018042303, XKYS2018122104,XKYS2018122105,XKYS2018122106,XKYS2018122107,XKYS2019062008,XKYS2019062009,XKYS2019062010。
2.性状检测:1、检测方法:目测和口尝。2、检测指标:该组合物为棕黄色粉末,味极苦。 3、检测结果:均符合指标限定。
3.水分检测:1、检测方法:水分按照2015中国药典干燥失重测定法(0831)测定。取本发明组合物3g,平铺于干燥至恒重的扁形称量瓶中,精密称定,开启瓶盖105℃干燥5小时,将瓶盖盖好,移置干燥器中,放冷30分钟,精密称定,再在上述温度干燥1小时,放冷,称重,至连续两次称重的差异不超过5mg为止。根据减失的重量,计算含水量(%)。2、检测结果:十批次的水分测定结果见表12-1。综合十批测定结果,规定:本发明组合物水分不得超过7.0%。
4.浸出物检测:1、检测方法:水溶性浸出物含量按照2015中国药典测定法(通则2201) 项下的热浸法测定。取提取物组合物约3g,精密称定,置250ml的锥形瓶中,精密加水100 ml,密塞,称定重量,静置1小时后,连接回流冷凝管,加热至沸腾,并保持微沸1小时。放冷后,取下锥形瓶,密塞,再称定重量,用水补足减失的重量,摇匀,用干燥滤器滤过,精密量取滤液25ml,置已干燥至恒重的蒸发皿中,在水浴上蒸干后,于105℃干燥3小时,置干燥器中冷却30分钟,迅速精密称定重量。用95%乙醇作溶剂,同法测定醇溶性浸出物含量。2、检测结果:十批次的浸出物测定结果见表12-1。综合十批测定结果,规定:本发明组合物水溶性浸出物含量不少于80.0%,醇溶性浸出物含量不少于35.0%。
表12-1十批次提取物组合物水分、浸出物测定结果
5中药提取物组合物的薄层鉴别
5.1黄连的鉴别:①对照品溶液的制备:精密称取表小檗碱、黄连碱、巴马汀、盐酸小檗碱对照品适量,加甲醇溶解制成每1ml含表小檗碱0.37mg、黄连碱0.33mg、巴马汀0.37mg、盐酸小檗碱0.48mg的混合对照品溶液。②供试品溶液的制备:取中药提取物组合物0.5g三批,批号:XKYS2018042301,XKYS2018042302,XKYS2018042303,精密称定,置具塞锥形瓶中,加甲醇50ml,超声处理30min(600W,40kHz),滤过,取续滤液,即得供试品溶液。③黄连对照药材溶液的制备:取黄连对照药材粉末0.25g,加甲醇25ml,超声处理30min (600W,40kHz),滤过,取滤液作为对照药材溶液。④阴性对照溶液的制备:精密称取缺黄连提取物的中药提取物组合物阴性样品0.4g,按②制成缺黄连的阴性对照溶液。⑤黄连提取物溶液的制备:精密称取黄连提取物0.1g,批号HL2017052802,按5.1.2制成黄连提取物的对照溶液。⑥薄层鉴别方法:吸取供试品溶液、对照品溶液各2μL,点于同一硅胶G薄层板上,以体积比为3:3.5:1:1.5:0.5:1的环己烷-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水-三乙胺混合溶液为展开剂,置用浓氨试液预饱和20min的展开缸内展开,取出晾干,置365nm紫外光灯下检视结果见图16。
5.2苦瓜的鉴别:(1)混合对照品溶液的制备:精密称取苦瓜皂苷L、 3-O-β-D-allopyranosyl,7,25-dihydroxycucurbita-5,23(E)-dien-19-al、苦瓜皂苷F2对照品适量,加甲醇制成每1ml含有苦瓜皂苷L0.32mg、 3-O-β-D-allopyranosyl,7,25-dihydroxycucurbita-5,23(E)-dien-19-al 0.37mg、苦瓜皂苷F2 0.5mg 的混合对照品溶液。(2)供试品溶液的制备:精密称取中药提取物组合物2g,三批,批号: XKYS2018042301,XKYS2018042302,XKYS2018042303,加80%乙醇30ml,超声处理30min (600W,40kHz),滤过,滤液蒸干,残渣加水20ml使溶解,水液用20ml石油醚(60-90℃) 振摇提取2次,弃去石油醚液。水液再用20ml乙酸乙酯振摇提取2次,合并乙酸乙酯液,挥干溶剂,残渣加甲醇1ml使溶解,得供试品溶液。(3)苦瓜提取物溶液的制备:称取苦瓜提取物2g,批号:KG2017120102,按5.2.2制成苦瓜提取物溶液。(4)苦瓜对照药材溶液的制备称取苦瓜饮片2g,按5.2.2法制成苦瓜对照药材溶液。(5)阴性对照溶液的制备:称取缺苦瓜的中药提取物组合物阴性样品1.5g,按照5.2.2制成缺苦瓜阴性对照溶液。(6)薄层鉴别方法:吸取供试品溶液、缺苦瓜阴性对照溶液、苦瓜冻干粉溶液、苦瓜对照药材溶液、对照品溶液各4μL,点于同一硅胶G薄层板上,以体积比为7:2.5:0.5的氯仿-甲醇-水的下层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点颜色清晰,置日光灯下检视。在供试品色谱中,在苦瓜冻干粉及苦瓜对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。缺苦瓜的阴性对照溶液无干扰。结果见图17。
5.3决明子的鉴别:<1>对照品溶液的制备:精密称取橙黄决明素对照品适量,加甲醇制成每1 ml含0.31mg橙黄决明素的对照品溶液。<2>供试品溶液的制备:精密称取中药提取物组合物1.0g,三批,批号:XKYS2018042301,XKYS2018042302,XKYS2018042303,加甲醇20ml,超声处理30min(600W,40kHz),滤过,滤液蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液。<3>决明子提取物对照溶液的制备:精密称取决明子提取物0.1g,批号 JMZ2017122511,按5.3.2制成决明子提取物对照溶液。<4>决明子对照药材溶液的制备:精密称取决明子粉末1g,按5.3.2制成决明子对照药材溶液。<5>阴性对照溶液的制备:称取缺决明子的中药提取物组合物阴性样品1g,按5.3.2制成缺决明子阴性对照溶液。<6>薄层鉴别方法:吸取供试品溶液、缺决明子的阴性对照溶液、决明子提取物溶液、决明子对照药材溶液各2μL,橙黄决明素对照品溶液4μL,点于同一硅胶G薄层板上,以体积比为12:5:0.5 的环己烷-乙酸乙酯-甲酸的混合溶液为展开剂,展开,取出,晾干,置氨蒸气中熏后,日光下拍照记录。供试品色谱中,在决明提取物色谱与橙黄决明素对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的亮黄色荧光斑点。缺决明子阴性对照溶液无干扰。结果见图18。
6.中药提取物组合物的特征图谱检测
6.1高效液相色谱-紫外检测法(HPLC-UVD)测定中药提取物组合物特征图谱
6.1.1材料与方法:仪器:Agilent 1260高效液相色谱仪,Agilent 1260可变波长检测器(VWD)。混合对照品溶液的制备:精密称取橙黄决明素、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、盐酸小檗碱、药根碱及非洲防己碱对照品适量,加甲醇制成每l ml含橙黄决明素6.88μg、表小檗碱4.39μg、黄连碱5.14μg、巴马汀6.37μg、盐酸小檗碱6.06μg、药根碱6.20μg和非洲防己碱2.10μg 的混合对照品溶液。供试品溶液的制备:精密称取中药提取物组合物132mg,置具塞锥形瓶中,精密加入50ml甲醇,称定重量,超声提取30min(600W,40kHz)。放冷后用甲醇补足减失的重量,摇匀滤过,取续滤液,得供试品溶液。色谱条件:采用HPLC-UVD法,以规格为5μm,250mm×4.6mm的Agilent TC-C18(2)作为色谱柱,设置柱温为30℃,检测波长为310nm,进样量为20μl,流速为1.0ml/min,以乙腈为流动相A,乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液(40:60)为流动相B,梯度洗脱40min。梯度洗脱的条件为0~15min,流动相 A为0%;15~30min,流动相A为0%~20%;30~40min,流动相A为20%。
6.1.2 HPLC-UVD法测定特征图谱方法学考察
6.1.2.1精密度实验:取中药提取物组合物,批号:XKYS2018042302,按6.1.1制备供试品溶液并进行检测。连续进样6次,结果显示相对保留时间RSD均小于0.066%,相对峰面积RSD 均小于0.666%,精密度良好。具体结果见表12-2、表12-3。
表12-2相对保留时间精密度实验
表12-3相对峰面积精密度实验
6.1.2.2稳定性实验
取中药提取物组合物,批号:XKYS2018042302,按6.1.1制备供试品溶液并进行检测。分别在0,2,4,8,12,24h进样,结果显示相对保留时间RSD均小于2.347%,相对峰面积RSD均小于1.179%,24小时稳定性良好。具体结果见表12-4、表12-5。
表12-4相对保留时间稳定性实验
表12-5相对峰面积稳定性实验
6.1.2.3重复性实验
取中药提取物组合物,批号:XKYS2018042301,XKYS2018042302,XKYS2018042303,XKYS2018122104,XKYS2018122105,XKYS2018122106,依次简记为批次1-6。按6.1制备供试品溶液并进行检测。结果显示相对保留时间RSD均小于0.066%,相对峰面积RSD均小于2.587%,重复性良好。具体结果见表12-6、表12-7。
表12-6相对保留时间重复性实验
表12-7相对峰面积重复性实验
6.1.3特征图谱的建立
6.1.3.1中药提取物组合物HPLC-UVD特征图谱测定:取中药提取物组合物,批号:XKYS2018042301,XKYS2018042302,XKYS2018042303,XKYS2018122104, XKYS2018122105,XKYS2018122106,XKYS2018122107,XKYS2019062008,XKYS2019062009,XKYS2019062010。依次简记为批次1-10。按6.1制备供试品溶液并进行检测。记录10批样品的色谱图。采用"中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)软件进行相似度分析,并计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。以批号为XKYS2018042302 的中药提取物组合物的特征图谱为参照图谱,经过多点校正,自动匹配,采用中位数法,时间窗0.10min,生成了对照特征图谱(图19)。10批中药提取物组合物溶液的相似度数据、特征图谱和对照特征图谱见表12-8,图20。
表12-8相似度分析结果
6.1.3.2共有峰的构建与标定:参考2015年版《中国药典》一部中相关产品特征图谱质量标准的规定和要求,确定中药提取物组合物的特征图谱中应呈现7个共有峰。通过与混合标准品图谱进行比对,4号峰是橙黄决明素、5号峰是非洲防己碱、6号峰是药根碱、7号峰是表小檗碱、9号峰是黄连碱、10号峰是巴马汀、11号峰是小檗碱。分析所得的特征图谱,发现 11号峰小檗碱吸收较强,且小檗碱为黄连的主要活性成分,出峰时间稳定,峰形较好,分离度好,前后无干扰,峰面积相对较高,故选择11号峰小檗碱为参照峰(S峰)。此外,2号峰与3号峰,5号峰与6号峰未达到基线分离,故合并计算其相对峰面积。
以11号峰为S峰,计算其余各峰的相对保留时间和相对峰面积。结果见表12-9、表12-10。十批中药提取物组合物特征图谱见图20。
表12-9相对保留时间
表12-10相对峰面积
6.1.3.3共有峰的归属及标定:分别精密称取黄连提取物96.0mg,湖北麦冬多糖提取物244mg,苦瓜提取物126mg,决明子提取物49mg,分别置于具塞锥形瓶中,精密加入50ml甲醇,称定重量,超声30min(600W,40kHz)。冷却至室温,甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,分别得黄连提取物、湖北麦冬多糖提取物、苦瓜提取物及决明子提取物供试品溶液。按6.1项下色谱条件进行检测。记录4种单味原料药材提取物的色谱图,与混合对照品图谱及对照图谱进行比对,指认其来源和归属,确定如下:4号峰来源于决明子提取物;5号、 6号、7号、8号、9号、10号和11号峰来源于黄连提取物;1号与2号峰来源于决明子提取物、黄连提取物和苦瓜冻干粉;3号峰来源于决明子提取物和黄连提取物。具体见图21。
6.2高效液相色谱-蒸发光散射检测法(HPLC-ELSD)测定中药提取物组合物特征图谱
6.2.1仪器与方法
仪器:Agilent 1260高效液相色谱仪,Agilent 1260蒸发光散射检测器(ELSD)。
对照品溶液的制备:分别取红莲霉素-6-O-β-龙胆二糖苷、决明子苷C、苦瓜皂苷L、苦瓜皂苷F2、3-O-β-D-allopyranosyl,7,25-dihydroxycucurbita-5,23(E)-dien-19-al适量,精密称定,置10ml容量瓶,甲醇溶解,定容,配成每毫升含有红莲霉素-6-O-β-龙胆二糖苷10μg、决明子苷C19μg、苦瓜皂苷L 11μg、苦瓜皂苷F2 9μg、 3-O-β-D-allopyranosyl,7,25-dihydroxycucurbita-5,23(E)-dien-19-al 9μg的混合对照品溶液。
供试品溶液的制备:精密称取中药提取物组合物1.0g,加入50ml水,超声10min(600 W,40kHz),冷却至室温后,加入乙酸乙酯萃取3次,合并乙酸乙酯部位。加入正丁醇萃取 3次,弃去正丁醇部位。合并水部位和乙酸乙酯部位,挥干溶剂,加10ml 70%甲醇溶解,过滤,取续滤液,得供试品溶液。色谱条件及检测:采用HPLC-ELSD法,以粒径为5μm,规格为250mm×4.6mm的Agilent TC-C18(2)作为色谱柱,设置柱温为20℃,蒸发光散射检测仪参数为:氮气流量1.6L/min,汽化室温度60℃,雾化室温度40℃。进样量为20μl,流速为1.0ml/min,以水为流动相A,乙腈为流动相B,梯度洗脱100min。梯度洗脱的条件为 0~5min,流动相A为85%~81%;5~30min,流动相A为80.1%~80%;30~38min,流动相A为80%~79%;38~48min,流动相A为79%~70%;48~60min,流动相A为70%~ 60%;60~63min,流动相A为60%~57.5%;63~73min,流动相A为57.5%;73~83min,流动相A为57.5%~30%;83.01~100min,流动相A为10%。
6.2.2 HPLC-ELSD方法学考察
6.2.2.1精密度实验:取中药提取物组合物,批号:XKYS2018042302,按6.2.1制备供试品溶液并进行检测。连续进样6次,结果显示相对保留时间RSD均小于1.37%,精密度良好。具体结果见表12-11。
表12-11相对保留时间精密度
6.2.2.2稳定性实验:取中药提取物组合物,批号:XKYS2018042302,按6.2.1制备供试品溶液并进行检测。分别在0,2,4,8,12,24h进样,结果显示相对保留时间RSD均小于1.710%, 24小时稳定性良好。具体结果见表12-12。
表12-12相对保留时间稳定性
6.2.2.3重复性实验:取中药提取物组合物,批号:XKYS2018042301,XKYS2018042302, XKYS2018042303,XKYS2018122104,XKYS2018122105,XKYS2018122106,依次简记为批次1-6。按6.2.1制备供试品溶液并进行检测。结果显示相对保留时间RSD均小于1.608%,重复性良好,具体结果见表12-13。
表12-13相对保留时间重复性
6.2.3特征图谱的建立
6.2.3.1中药提取物组合物HPLC-ELSD特征图谱测定
取中药提取物组合物,批号:XKYS2018042301,XKYS2018042302,XKYS2018042303,XKYS2018122104,XKYS2018122105,XKYS2018122106,XKYS2018122107, XKYS2019062008,XKYS2019062009,XKYS2019062010。依次简记为批次1-10。按6.1制备供试品溶液并进行检测。记录10批样品的色谱图。采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统 (2004A版)软件。进行相似度分析,并计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。以批号为XKYS2018042302的中药提取物组合物的特征图谱为参照图谱,经过多点校正,自动匹配,采用中位数法,时间窗0.10min生成了对照特征图谱,10批中药提取物组合物特征图谱的相似度数据见表12-14,对照特征图谱见图22,十批中药提取物组合物特征图谱见图23。
表12-14特征图谱的相似度分析
6.2.3.2共有峰的的构建与标定:参考2015年版《中国药典》一部中相关产品特征图谱质量标准的规定和要求,确定中药提取物组合物特征图谱要求如下:供试品图谱中应呈现5个特征峰。与混合标准品溶液比对确认11号峰为决明子苷C、12号峰为红莲霉素-6-O-β-龙胆二糖苷、18号峰为苦瓜皂苷L、19号峰为3-O-β-D-allopyranosyl,7,25-dihydroxycucurbita-5,23(E)- dien-19-al、20号峰为苦瓜皂苷F2。以12号峰为S峰(分析所得的特征图谱,发现12号峰吸收较强,为决明子的主要活性成分,出峰时间稳定,峰形较好,分离度好,前后无干扰,峰面积相对较高,故选择12号峰(红莲霉素-6-O-β-龙胆二糖苷为参照峰)。以12号峰为S 峰,计算共有峰的相对保留时间。
6.2.3.3共有峰的归属:精密称取中药提取物组合物1g,按7.1.3下制备供试品样品,按7.1.4 项下色谱条件进行检测。记录中药提取物组合物与各单味原料药材提取物的色谱图,与混合对照品图谱及对照图谱进行比对,指认其来源和归属,见图24。确定如下:3号、4号、5 号、8号、9号、10号、11号、12号、13号、14号、15号和16号峰来源于决明子提取物;17号、18号、19号、20号、21号和22号峰来源于苦瓜提取物;7号峰来源于黄连提取物。 6号峰为决明子提取物和黄连提取物共有,1号与2号为四种中药提取物共有。
7中药提取物组合物含量限定检测
7.1紫外分光光度法测定中药提取物组合物中总多糖含量:
7.1.1仪器与方法:仪器:Agilent Cary 60紫外-可见分光光度计。对照品溶液的制备:精密称取烘干至恒重的葡萄糖对照品,加水制成每1ml含100μg葡萄糖的对照品溶液。标准曲线的建立:精密量取对照品溶液0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml,分别置于10ml具塞试管中,各加水补至1.0ml,精密加入临用配制的5%苯酚溶液1.0ml,摇匀,再精密加入硫酸 5.0ml,摇匀,置沸水浴中加热20min,取出,置冰水浴中5min,以相应试剂为空白,测定490nm波长处吸光度,以吸光度为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线。供试品溶液的制备:精密称取取中药提取物组合物1.0g,精密加水50ml,称定重量。热水浴加热30min,放冷,补足重量,精密量取续滤液1.0ml,置离心管中,精密加入无水乙醇19.0ml,摇匀,冷藏6-18小时,取出,以每分钟4000转的转速离心20min,弃去上清液,沉淀以95%乙醇洗涤两次,即:加入10ml 95%乙醇,离心,弃去上清液。沉淀加水溶解,定容至100ml,即得供试品溶液。测定:精密量取供试品溶液1.0ml,按照“标准曲线的建立”方法,自“精密加入5%苯酚溶液1.0ml”起,依法测定490nm波长处吸光度,从标准曲线上读出供试品溶液中葡萄糖的浓度,计算,即得。
7.1.2方法学考察
7.1.2.1线性:回归方程为Y=9.1363x-0.0069(r=0.9993),线性关系良好,线性范围为0.01 mg/mL~0.10mg/mL。
7.1.2.2精密度:取对照品溶液0.5mL置10mL具塞试管中,加水补至1.0mL,连续测定6 次,记录吸光度,计算其RSD值为0.09%,表明仪器精密度良好。见表12-15。
表12-15精密度试验
7.1.2.3稳定性试验:取中药提取物组合物,批号:XKYS2018042302,按7.1.1制备供试品溶液并进行检测。于0min,20min,40min,60min,80min,100min,120min时测定其吸光度,计算RSD值为1.35%,表明供试品溶液在2小时内稳定。见表12-16。
表12-16稳定性试验
7.1.2.4重复性试验:取中药提取物组合物,批号:XKYS2018042302,按7.1.1制备供试品溶液并进行检测。计算RSD值为1.84%,表明方法重复性良好。见表12-17。
表12-17重复性试验
7.1.2.5加样回收率试验:精密吸取已知含量的供试品溶液0.5mL置于9个10mL具塞试管中,分别精密加入对照品溶液0.27mL各三份、0.34mL各三份、0.41mL各三份,加水补至 1.0mL,按供试品测定方法测定吸光度,计算回收率,结果见表12-18,该方法回收率良好。
表12-18加样回收率试验
7.1.2.6样品含量测定:测定十批次中药提取物组合物的总多糖含量,批号为:XKYS2018042301,XKYS2018042302,XKYS2018042303,XKYS2018122104, XKYS2018122105,XKYS2018122106,XKYS2018122107,XKYS2019062008, XKYS2019062009,XKYS2019062010。
表12-19十批次中药提取物组合物的总多糖含量测定结果
综合十批次中药提取物组合物含量测定结果,总多糖含量以葡萄糖(C6H12O6)计,不少于25.0%。
7.2高效液相色谱-紫外检测法测定中药提取物组合物主要有效成分含量
7.2.1仪器与方法:仪器:Agilent 1260液相色谱系统,Agilent 1260紫外检测器。混合对照品溶液的制备:精密称取橙黄决明素、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、盐酸小檗碱对照品适量,加甲醇制成每l ml含橙黄决明素8.8μg、表小檗碱113.4μg、黄连碱86.4μg、巴马汀97.2μg、盐酸小檗碱200μg的混合对照品溶液。混合对照品溶液图谱见图25A。供试品溶液的制备:同6.1.1。代表性供试品溶液图谱见图25B。色谱条件及检测:同6.1.1。阴性对照溶液的制备:精密称取缺黄连提取物、决明子提取物的中药提取物组合物0.4g,按照6.1.1下方法制备。阴性对照溶液图谱见图25C。
7.2.2方法学考察
7.2.2.1线性关系:取混合对照品,分别进样2μL、4μL、6μL、8μL、10μL、12μL、14μL、16μL、18μL、20μL,按6.1.1色谱条件测定各峰面积,以进样量(μg)为纵坐标,峰面积为横坐标,绘制标准曲线,结果见表12-20。
表12-20线性关系考察
7.2.2.2精密度:取混合标准品,连续进样6次,按6.1.1色谱条件测定各峰面积,计算其RSD,结果5种对照品的RSD分别为橙黄决明素0.39%,表小檗碱0.24%,黄连碱0.12%,巴马汀 C 0.27%,小檗碱0.27%。表明仪器的精密度良好。结果见表12-21。
表12-21仪器精密度试验
7.2.2.3稳定性:取中药提取物组合物,批号:XKYS2018042302,按6.1.1制备供试品溶液并进行检测。在第0h,2h,4h,6h,8h,12h,24h进样,记录各峰面积,计算其RSD,结果各峰RSD分别为橙黄决明素0.57%,表小檗碱1.04%,黄连碱0.41%,巴马汀0.61%,小檗碱0.37%。样品稳定性良好。结果见表12-22。
表12-22样品稳定性试验
7.2.2.4重复性:取中药提取物组合物,批号:XKYS2018042302,平行制备6份样品,按6.1.1 制备供试品溶液并进行检测,计算其RSD,其RSD分别为橙黄决明素1.68%,表小檗碱1.81%,黄连碱1.06%,巴马汀1.07%,小檗碱1.14%。表明重复性良好。结果见表12-23。
表12-23方法精密度试验
7.2.2.5回收率试验:取9份已知含量的中药提取物组合物,批号:XKYS2018042302约66mg,精密称定,置于50ml具塞锥形瓶中,然后分别向其中3份加入加样回收对照品溶液各5mL,再向另外3份加入加样回收对照品溶液各10mL,剩下3份加入加样回收对照品溶液各15mL,补足至50ml,摇匀,称定重量,超声30min,放冷后用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,分别进样,记录各峰面积,计算回收率及RSD,结果见表12-24。
表12-24加样回收率试验结果
7.2.2.6样品含量测定:取中药提取物组合物,批号:XKYS2018042301,XKYS2018042302, XKYS2018042303,XKYS2018122104,XKYS2018122105,XKYS2018122106,XKYS2018122107,XKYS2019062008,XKYS2019062009,XKYS2019062010。依次简记为批次1-10。按6.1制备供试品溶液并进行检测。结果见表12-25。代表性液相图谱见图25。
表12-25中药提取物组合物含量测定
综合十批含量测定结果,规定中药提取物组合物中橙黄决明素含量不少于0.08%,表小檗碱不少于0.4%,黄连碱不少于1.5%,巴马汀不少于0.6%,小檗碱不少于4.5%;四种生物碱总含量不少于7.5%。
实施例13:组成本发明所述的中药提取物组合物的四种中药提取物的质量检测方法
1试剂与药品:乙腈购自美国Sigma Aldrich,实验用水为去离子水。表小檗碱、黄连碱、巴马汀、盐酸小檗碱、橙黄决明素购于中国药品生物制品鉴定所。Dextran系列标准葡聚糖D-3, T-5,T-10,T-40,T-70,相对分子质量分别为3000,5000,10000,40000及70000,购于美国Pharmacia(GE)。对照品苦瓜皂苷L、 3-O-β-D-allopyranosyl,7,25-dihydroxycucurbita-5,23(E)-dien-19-al、苦瓜皂苷F2为实验室自制。橙黄决明素-6-O-葡萄糖苷购于江苏永健医药,红莲霉素-6-O-β-龙胆二糖苷购于成都曼斯特,决明子苷、决明子苷C购于成都昂赛斯。
其余试剂均购于国药集团化学试剂有限公司,分析纯。四种中药提取物批号见实施例1 及实施例9。
2黄连提取物的质量检测:混合对照品溶液的制备:精密称取表小檗碱、黄连碱对照品、巴马汀对照品、小檗碱对照品适量,精密称定,加甲醇制成每l ml含180μg、50μg、60μg、 60μg的混合对照品溶液。供试品溶液的制备:精密称取黄连提取物适量,加甲醇制成每1ml 含黄连提取物280μg的溶液,取续滤液,得供试品溶液。色谱条件及测定:采用HPLC-UVD法,以粒径为5μm,规格为250mm×4.6mm的Agilent TC-C18(2)作为色谱柱,以乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液(50:50)(每100ml中加十二烷基硫酸钠0.4g,再以磷酸调节pH值为4.0)为流动相;检测波长为345nm。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,根据峰面积,计算表小檗碱、黄连碱、巴马汀和小檗碱的含量,结果见表13-1,代表性液相谱见图26。
表13-1十批黄连提取物含量测定结果
结合十批黄连提取物含量测定结果,规定含表小檗碱不少于3%,黄连碱不少于10%,巴马汀不少于5%,小檗碱不少于28%。表小檗碱、黄连碱、巴马汀和小檗碱的总含量不少于50%。
3湖北麦冬多糖提取物的质量检测
3.1湖北麦冬多糖提取物重均分子量测定:混合对照品溶液的制备:精密称取Dextran系列的标准葡聚糖,D-3,T-5,T-10,T-40,T-70适量,其相对分子质量分别为3000,5000,10000, 40000及70000对照品,加水制成每1ml含有上述对照品各10mg的混合对照品溶液。标准曲线的建立:分别精密吸取对照品溶液20μ1,注入液相色谱仪,测定。以标准葡聚糖重均分子量的对数(log Mw)为横坐标,保留时间(tR)为纵坐标,建立标准曲线。供试品溶液的配制:精密称取湖北麦冬多糖提取物适量,加水制成每1ml含提取物10mg的供试品溶液。色谱条件及检测:采用分子排阻色谱法,Hitachi L-2130高效液相色谱仪,蒸发光散射检测器, HP1100HPLC泵,色谱柱为G4000PWXL(7.8mm×300mm,日本TOSOH公司),流动相为水,流速为0.6ml/min,柱温25℃,氮气流速为3.0L/min,漂移管温度为110℃。分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各20μl,注入液相色谱仪,测定。从标准曲线上读出供试品溶液中湖北麦冬多糖的重均分子量。
十批湖北麦冬多糖提取物的重均分子量见表13-2,高效液相色谱图见图27A。综合十批湖北麦冬多糖提取物重均分子量测定结果,其重均分子量范围为3000-5000Da。
3.2湖北麦冬多糖总糖含量测定:对照品溶液的制备:精密称取干燥至恒重的果糖对照品适量,加水制成每1ml含果糖100μg的对照品溶液。供试品溶液的制备:精密称取干燥至恒重的湖北麦冬多糖提取物适量,加水制成每1ml含湖北麦冬多糖提取物100μg的溶液,取续滤液,即得供试品溶液。标准曲线的建立:精密量取对照品溶液0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、 1.0ml分别置于5个10ml具塞试管中,各加水至1.0ml,摇匀,在冰水浴中滴加5.0ml蒽酮 -硫酸溶液(精密称取蒽酮固体0.1g于10ml棕色容量瓶中,用80%硫酸水溶液定容),混匀,封口膜封口,沸水浴中加热15min,取出,冷却至室温。另取蒸馏水1ml,加入蒽酮-硫酸溶液5.0ml,同法操作,为空白。按分光光度法在625nm波长处测定吸光度,以吸光度为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线。回归方程为Y=0.1506X-0.008(R2=0.9994),线性范围0.02mg/ml~0.10mg/ml。测定与计算:精密吸取供试品溶液0.6ml置于10ml具塞试管中,加水补足至1.0ml,在冰水浴中滴加5.0ml蒽酮-硫酸溶液,混匀,封口膜封口,沸水浴中加热15min,取出,冷却至室温。取上述反应液于两小时内,在625nm波长处测定吸光度,从标准曲线上读出供试品溶液中含果糖的重量,再按下式计算样品中总糖含量(含量%)。总糖含量%=(0.904×C×D)/W×100%。(C.待测液中果糖浓度;D.待测液稀释倍数;W.待测样品质量)。十批湖北麦冬多糖提取物的总糖含量见表13-2。结合十批湖北麦冬多糖提取物总糖含量测定结果,其总糖含量以果糖(C6H12O6)计不少于90%。
3.3湖北麦冬多糖提取物单糖组成分析:混合对照品溶液的制备:精密称取果糖、葡萄糖对照品适量,加水制成每1ml含果糖、葡萄糖各2mg的混合溶液。取100μl放入具塞试管中,加入0.3mol/L的氢氧化钠水溶液500μl,再加入0.5mol/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP) 甲醇溶液500μl,混合均匀,在80℃水浴中反应4小时,反应结束后取出试管冷却至室温,再加入0.15mol/L的盐酸水溶液1000μl中和反应液中的碱。用2ml氯仿萃取反应液三次,取水层溶液过0.22μm微孔滤膜,即为混合对照品溶液。供试品的制备:精密称取湖北麦冬多糖提取物适量,加水制成每1ml含提取物5mg的溶液。取2.0ml上述溶液,加入0.2mol/L的三氟乙酸溶液2.0ml,摇匀、封管。置于80℃水浴中反应1.5h。反应结束后放于冰水中冷却,减压浓缩至干,转移至5ml容量瓶中定容,取100μl放入具塞试管中,按混合对照品溶液的制备方法,自“加入0.3mol/L的氢氧化钠水溶液500μl”起,同法操作,制备供试品溶液。色谱条件及测定:采用HPLC-UVD法,以粒径为5μm,规格为250mm×4.6mm的Agilent TC-C18作为色谱柱;以乙腈-pH为7.0的磷酸缓冲液(20:80)为流动相;流速1.0ml/min,柱温25℃,检测波长250nm。分别精密吸取混合对照品溶液10μl,供试品溶液10μl,注入液相色谱仪,测定,分别计算果糖、葡萄糖含量。注:多糖水解后,糖单位加入了1分子水,故按果糖C6H12O6计算,其含量会超过100%。十批湖北麦冬多糖提取物的果糖与葡萄糖含量及比值见表13-2,高效液相色谱图见图27B。综合十批湖北麦冬多糖提取物果糖与葡萄糖含量及比值测定结果,该比值范围应为17-22:1。
表13-2十批湖北麦冬多糖提取物质量检测结果
4.苦瓜提取物中三萜皂苷成分的含量测定:混合对照品溶液的制备:精密称取苦瓜皂苷L、 3-O-β-D-allopyranosyl,7,25-dihydroxycucurbita-5,23(E)-dien-19-al、苦瓜皂苷F2对照品适量,加 70%甲醇水溶液制成每1ml含上述三种对照品分别为0.6mg、0.5mg、1.5mg的混合对照品溶液。
供试品溶液的制备:精密称取苦瓜提取物1g,置具塞锥形瓶中,精密加入10ml70%甲醇,称定重量,超声提取30min。放冷后70%甲醇补足重量,摇匀滤过,取续滤液,即得供试品溶液。
色谱条件及测定:采用HPLC-ELSD法,以粒径为5μm,规格为250mm×4.6mm的Agilent TC-C18(2)作为色谱柱;流动相乙腈(A)-水(B)梯度洗脱(0~10min,20%~30%A;10~30min,30%~50%A;30~50min,50%~70%A)。流速1.0ml/min,柱温25℃。蒸发光散射检测器条件:汽化室温度60℃,雾化室温度40℃;氮气流速1.6L/min。分别精密吸取对照品溶液10μ1、20μ1,供试品溶液20μ1,注入液相色谱仪,测定,用外标两点法对数方程分别计算三种苦瓜皂苷含量。
苦瓜提取物中苦瓜皂苷L、3-O-β-D-allopyranosyl,7,25-dihydroxycucurbita-5,23(E)-dien-19-al、苦瓜皂苷F2含量见表13-3,代表性液相谱图见图28。结合十批苦瓜提取物苦瓜皂苷含量测定结果,苦瓜提取物中苦瓜皂苷L不少于0.1%, 3-O-β-D-allopyranosyl,7,25-dihydroxycucurbita-5,23(E)-dien-19-al不少于0.05%,苦瓜皂苷F2不少于0.1%,以上三种皂苷总含量不少于0.3%。
表13-3苦瓜提取物中三萜皂苷含量测定结果
5.决明子提取物的质量检测:混合对照品溶液的制备:精密称取决明子标准品决明子苷、红莲霉素-6-O-β-龙胆二糖苷、橙黄决明素-6-O-葡萄糖苷、决明子苷C、橙黄决明素适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含有决明子苷36μg、红莲霉素-6-O-β-龙胆二糖苷36μg、橙黄决明素-6-O-葡萄糖苷39μg、决明子苷C 30μg、橙黄决明素21μg的混合对照品溶液。
供试品溶液的制备:精密称取决明子提取物20mg,置25ml容量瓶中,加甲醇超声使溶解并稀释至刻度,摇匀滤过,取续滤液,即得供试品溶液。
色谱条件与测定:采用HPLC-UVD法,以粒径为5μm,规格为250mm×4.6mm的AgilentTC-C18作为色谱柱;流动相乙腈(A)-0.1%甲酸溶液(B)梯度洗脱(0~10min,15%A;10~60min,15%~20%A;60~70min,20%~25%A;70~100min,25%~70%A),流速1.0 ml/min,柱温25℃,检测波长280nm。分别精密吸取对照品溶液10μ1,供试品溶液10μ1,注入液相色谱仪,测定。
决明子提取物含量测定结果见表13-4,代表性液相谱图见图29。结合十批决明子提取物含量测定结果,决明子提取物中,决明子苷不少于3%,红莲霉素-6-O-β-龙胆二糖苷不少于 2%,橙黄决明素-6-O-葡萄糖苷不少于3%,决明子苷C不少于2%,橙黄决明素不少于1%。规定以上五种化合物总含量不少于12%。
表13-4决明子提取物含量测定结果
本领域的技术人员容易理解,以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (17)
1.一种用于治疗糖尿病或/和糖尿病肾病的中药提取物组合物,其特征在于,该组合物由80-100重量份的黄连提取物、220-250重量份的湖北麦冬多糖提取物、130-180重量份的苦瓜提取物和40-60质量份的决明子提取物组成;所述的黄连提取物是将黄连的干燥根茎采用乙醇水溶液提取后经酸沉纯化所制得的提取物;所述的湖北麦冬多糖提取物是将湖北麦冬的干燥块根经水煎煮、除杂、超滤所得的提取物;所述的苦瓜提取物是将压榨苦瓜果实所得的榨汁液与压榨残渣的乙醇冷浸液合并后醇沉所制得的提取物;所述的决明子提取物是将决明子的干燥成熟种子经乙醇水溶液提取后经大孔树脂纯化所得的提取物。
3.根据权利要求1所述的中药提取物组合物,其特征在于,每克该中药提取物组合物中相当于含黄连生药材0.9-1.2g,湖北麦冬生药材1.3-1.6g,鲜苦瓜生药材12-16g,决明子生药材2.3-2.6g。
4.根据权利要求1、2或3所述的中药提取物组合物,其特征在于,所述的将黄连的干燥根茎采用乙醇水溶液提取后经酸沉纯化制得黄连提取物的具体方法是:取黄连(Coptischinensis Franch.)的干燥根茎为原料药材,将黄连药材粉碎后,用8-15倍原料药材重量的50-70%乙醇水溶液回流提取;提取液浓缩至浸膏状;用3-4倍浸膏重量的醋酸溶液加热溶解,过滤,取滤液用浓盐酸调pH值至1-1.5,每升溶液中加入100-180克氯化钠,混匀,4-8℃冷藏24-48小时,过滤,取沉淀经冰水洗涤,烘干,碾碎即得到黄连提取物。
5.根据权利要求1、2、3或4所述的中药提取物组合物,其特征在于,所述的将湖北麦冬的干燥块根经水煎煮、除杂、超滤制得湖北麦冬多糖提取物的具体方法是:取湖北麦冬(Liriope spicata(Thunb.)Lour.var.prolifera Y.T.Ma)的干燥块根为原料药材,湖北麦冬药材粉碎后,水煎煮,取煎煮滤液,滤液用磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液调节pH值至5-7;于40-55℃水浴上加入0.002-0.004倍湖北麦冬原料药材重量的比活力为12U/mg的木瓜蛋白酶,酶解1-2.5h除蛋白,煮沸5-8min,冷却、过滤得滤液即湖北麦冬提取液;滤液按超滤条件:截留分子量为1000Da,浓度:湖北麦冬提取液体积与所用湖北麦冬原料药材质量之比为7.5-13g:1ml,压力0.8-1.2bar,切向流速1.0-1.5L/min进行超滤;超滤保留液过DEAE-52纤维素层析柱,收集水洗脱液,减压浓缩,减压干燥或冷冻干燥即得到湖北麦冬多糖提取物。
6.如权利要求5所述的中药提取物组合物,其特征在于,所述水浴的温度为45℃。
7.根据权利要求1、2、3或4所述的中药提取物组合物,其特征在于,所述的将压榨苦瓜果实所得的榨汁液与压榨所得残渣的乙醇冷浸液合并后醇沉后制得苦瓜提取物的具体方法是:取新鲜苦瓜(Momordica charantia L.)果实,压榨后取榨汁液;压榨所得残渣加入60-80%的乙醇水溶液冷浸,再进行压榨,收集冷浸液;榨汁液与冷浸液合并,浓缩至无醇味,且40-50℃时测其相对密度为1.05-1.10,用80-90%乙醇水溶液沉淀12-36h,过滤,取滤液浓缩,冷冻干燥即得苦瓜提取物。
8.根据权利要求1、2、3或4所述的中药提取物组合物,其特征在于,所述的将决明子的干燥成熟种子经乙醇水溶液提取后经大孔树脂纯化制得决明子提取物的具体方法是:取决明(Cassia obtusifolia L.)或/和小决明(Cassia tora L.)的干燥成熟种子为原料药材,药材粉碎后,加原料药材重量的6-10倍量的65-85%乙醇水溶液,浸泡过夜;回流提取,抽滤,滤液回收至无醇味,并制成浓度为每毫升溶液含有0.5-0.7g原生药的浓缩液,过D101大孔树脂柱,用4倍柱体积水洗脱,弃去;再用6倍柱体积的80-95%乙醇水溶液洗脱,收集洗脱液,减压浓缩、真空干燥即制得决明子提取物。
9.如权利要求1-8任一所述的治疗糖尿病或/和糖尿病肾病的中药提取物组合物的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤一、以黄连、湖北麦冬、苦瓜和决明子为原料药材,分别制取黄连提取物、湖北麦冬多糖提取物、苦瓜提取物和决明子提取物;
步骤二、将步骤一制得的黄连提取物、湖北麦冬多糖提取物、苦瓜提取物和决明子提取物充分碾碎混匀即制得所述中药提取物组合物。
10.根据权利要求9所述的制备方法,其特征在于,所述的黄连提取物以高效液相色谱-紫外检测法测定黄连提取物中生物碱的含量,含表小檗碱不少于3%,黄连碱不少于10%,巴马汀不少于8%,小檗碱不少于28%;表小檗碱、黄连碱、巴马汀和小檗碱的总含量不少于50%;
所述的湖北麦冬多糖提取物以紫外-可见分光光度法测定湖北麦冬多糖提取物的总糖含量,以果糖计不少于90.0%;以1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生化结合高效液相色谱-紫外检测法测定单糖组成,果糖与葡萄糖含量比值范围为17~22:1;以分子排阻色谱法测定湖北麦冬多糖提取物的重均分子量,范围为3000-5000Da;
所述的苦瓜提取物以高效液相色谱-蒸发光散射法测定苦瓜提取物中三萜皂苷含量,苦瓜皂苷L不少于0.1%,7,25-二羟基-葫芦烷-5,23(E)二烯-19-醛基-3-O-β-D-阿洛糖苷不少于0.05%,苦瓜皂苷F2不少于0.1%,以上三种皂苷总含量不少于0.3%;
所述的决明子提取物以高效液相色谱-紫外检测法测定决明子提取物中决明子苷不少于3%,红莲霉素-6-O-β-龙胆二糖苷不少于2%,橙黄决明素-6-O-葡萄糖苷不少于3%,决明子苷C不少于2%,橙黄决明素不少于1%;以上五种化合物总含量不少于12%。
11.根据权利要求9所述的制备方法,其特征在于,以黄连、湖北麦冬、苦瓜和决明子为原料药材,分别制取黄连提取物、湖北麦冬多糖提取物、苦瓜提取物和决明子提取物的具体方法是:
取黄连(Coptis chinensis Franch.)的干燥根茎为原料药材,将黄连药材粉碎后,用8-15倍原料药材重量的50-70%乙醇水溶液回流提取;提取液浓缩至浸膏状;用3-4倍浸膏重量的醋酸溶液加热溶解,过滤,取滤液用浓盐酸调pH值至1-1.5,每升溶液中加入100-180克氯化钠,混匀,4-8℃冷藏24-48小时,过滤,取沉淀经冰水洗涤,烘干,碾碎即得到黄连提取物;
取湖北麦冬(Liriope spicata(Thunb.)Lour.var.prolifera Y.T.Ma)的干燥块根为原料药材,湖北麦冬药材粉碎后,水煎煮,取煎煮滤液,滤液用磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液调节pH值至5-7;于40-55℃水浴上加入0.002-0.004倍湖北麦冬原料药材重量的比活力为12U/mg的木瓜蛋白酶,酶解1-2.5h除蛋白,煮沸5-8min,冷却、过滤得滤液即湖北麦冬提取液;滤液按超滤条件:截留分子量为1000Da,浓度:湖北麦冬提取液体积与所用湖北麦冬原料药材质量之比为7.5-13g:1ml,压力0.8-1.2bar,切向流速1.0-1.5L/min进行超滤;超滤保留液过DEAE-52纤维素层析柱,收集水洗脱液,减压浓缩,减压干燥或冷冻干燥即得到湖北麦冬多糖提取物;
取新鲜苦瓜(Momordica charantia L.)果实,压榨后取榨汁液;压榨所得残渣加入60-80%的乙醇水溶液冷浸,再进行压榨,收集冷浸液;榨汁液与冷浸液合并,浓缩至无醇味,且40-50℃时测其相对密度为1.05-1.10,用80-90%乙醇水溶液沉淀12-36h,过滤,取滤液浓缩,冷冻干燥即得苦瓜提取物;
取决明(Cassia obtusifolia L.)或/和小决明(Cassia tora L.)的干燥成熟种子为原料药材,药材粉碎后,加原料药材重量的6-10倍量的65-85%乙醇水溶液,浸泡过夜;回流提取,抽滤,滤液回收至无醇味,并制成浓度为每毫升溶液含有0.5-0.7g原生药的浓缩液,过D101大孔树脂柱,用4倍柱体积水洗脱,弃去;再用6倍柱体积的80-95%乙醇水溶液洗脱,收集洗脱液,减压浓缩、真空干燥即制得决明子提取物。
12.一种治疗糖尿病或/和糖尿病肾病的药剂,其特征在于,它由权利要求1所述的中药提取物组合物和药剂学上可接受的载体、添加剂或/和赋形剂制成。
13.一种治疗糖尿病或/和糖尿病肾病的药剂,其特征在于,它是以权利要求1所述的中药提取物组合物为有效成分按常规方法制备的颗粒剂、片剂、胶囊剂或丸剂。
14.权利要求1至8中任一项所述的中药提取物组合物的质量检测方法,其特征在于,该质量检测方法包括采用高效液相色谱-紫外检测法测定所述的中药提取物组合物的特征图谱,以与对照品橙黄决明素、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、盐酸小檗碱、药根碱、非洲防己碱相一致的7个共有峰为特征峰对所述的中药提取物组合物进行检测的具体方法,包括以下步骤:
S1-混合对照品溶液的制备:精密称取橙黄决明素、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、盐酸小檗碱、药根碱、非洲防己碱对照品适量,加甲醇制成每1ml含上述七种对照品各1-10μg的混合对照品溶液;
S2-供试品溶液的制备:精密称取中药提取物组合物100-150mg,置具塞锥形瓶中,精密加入40-60ml甲醇,称定重量,超声提取15-45min。放冷后用甲醇补足减失的重量,摇匀滤过,取续滤液,得供试品溶液;
S3-色谱条件及检测:采用高效液相色谱-紫外检测法,以粒径为5μm,规格为250mm×4.6mm的Agilent TC-C18(2)作为色谱柱,设置柱温为30℃,检测波长为310nm,进样量为10-30μl,流速为1.0ml/min,以乙腈为流动相A,乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液为流动相B,流动相B中乙腈和0.05mol/L磷酸二氢钾溶液的体积比为40:60,梯度洗脱40min。梯度洗脱的条件为0~15min,流动相A为0%;15~30min,流动相A为0%~20%;30~40min,流动相A为20%;
供试品特征图谱中应呈现7个与对照品相一致的特征峰,并应分别与相应的对照品溶液的保留时间一致。
15.根据权利要求14所述的质量检测方法,其特征在于,该质量检测方法还包括采用高效液相色谱-蒸发光散射检测法测定所述的中药提取物组合物的特征图谱,以与对照品红莲霉素-6-O-β-龙胆二糖苷、决明子苷C、苦瓜皂苷L、7,25-二羟基-葫芦烷-5,23(E)二烯-19-醛基-3-O-β-D-阿洛糖苷、苦瓜皂苷F2相一致的5个共有峰对所述的中药提取物组合物进行检测的具体方法,包括以下步骤:
S1-混合对照品溶液的制备:精密称取红莲霉素-6-O-β-龙胆二糖苷、决明子苷C、苦瓜皂苷L、7,25-二羟基-葫芦烷-5,23(E)二烯-19-醛基-3-O-β-D-阿洛糖苷、苦瓜皂苷F2对照品适量,加甲醇制成每1ml含有上述五种对照品各5-30μg的混合对照品溶液;
S2-供试品溶液的制备:取中药提取物组合物1.6-2.4g,加入40-60ml水,超声处理8-12min,冷却至室温后,加入乙酸乙酯萃取2-3次,合并乙酸乙酯部位。加入正丁醇萃取2-3次,弃去正丁醇部位;合并水部位和乙酸乙酯部位,挥干溶剂,加10ml 70%甲醇溶解,过滤,取续滤液,得供试品溶液;
S3-色谱条件及检测:采用高效液相色谱-蒸发光散射检测法,以粒径为5μm,规格为250mm×4.6mm的Agilent TC-C18(2)作为色谱柱,设置柱温为20℃,蒸发光散射检测仪参数为:氮气流量1.6L/min,汽化室温度60℃,雾化室温度40℃;进样量为20μl,流速为1.0ml/min,以水为流动相A,乙腈为流动相B,梯度洗脱100min;梯度洗脱的条件为0~5min,流动相A为85%~81%;5~30min,流动相A为80.1%~80%;30~38min,流动相A为80%~79%;38~48min,流动相A为79%~70%;48~60min,流动相A为70%~60%;60~63min,流动相A为60%~57.5%;63~73min,流动相A为57.5%;73~83min,流动相A为57.5%~30%;83.01~100min,流动相A为10%;
供试品特征图谱中应呈现5个与对照品相一致的特征峰,并应分别与相应的对照品溶液的保留时间一致。
16.根据权利要求14所述的质量检测方法,其特征在于,该质量检测方法还包括采用高效液相色谱-紫外检测法测定中药提取物组合物中橙黄决明素、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、盐酸小檗碱的含量的具体方法,包括如下步骤:
S1-混合对照品溶液的制备:精密称取橙黄决明素、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、盐酸小檗碱对照品适量,加甲醇制成每1ml含橙黄决明素5-10μg、表小檗碱90-130μg、黄连碱70-110μg、巴马汀80-120μg、盐酸小檗碱180-220μg的混合对照品溶液;
S2-供试品溶液的制备:精密称取中药提取物组合物100-150mg,置具塞锥形瓶中,精密加入40-60ml甲醇,称定重量,超声提取15-45min,放冷后用甲醇补足减失的重量,摇匀滤过,取续滤液,得供试品溶液;
S3-色谱条件及检测:采用高效液相色谱-紫外检测法,以粒径为5μm,规格为250mm×4.6mm的Agilent TC-C18(2)作为色谱柱,设置柱温为30℃,检测波长为310nm,进样量为10-30μl,流速为1.0ml/min,以乙腈为流动相A,乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液为流动相B,梯度洗脱40min,梯度洗脱的条件为0~15min,流动相A为0%;15~30min,流动相A为0%~20%;30~40min,流动相A为20%;
所述的中药提取物组合物中,橙黄决明素含量不少于0.08%,表小檗碱不少于0.4%,黄连碱不少于1.5%,巴马汀不少于0.6%,小檗碱不少于4.5%;四种生物碱总含量不少于7.5%。
17.根据权利要求14所述的质量检测方法,其特征在于,该质量检测方法还包括采用紫外分光光度法测定所述的中药提取物组合物中总多糖含量的具体方法,包括以下步骤:
S1-对照品溶液的制备:精密称取烘干至恒重的葡萄糖对照品,加水制成每1ml含80-120μg葡萄糖的对照品溶液;
S2-标准曲线的建立:精密量取对照品溶液0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml,分别置于10ml具塞试管中,各加水补至1.0ml,精密加入临用配制的5%苯酚溶液1.0ml,摇匀,再精密加入硫酸5.0ml,摇匀,置沸水浴中加热10-30min,取出,置冰水浴中5min,以相应试剂为空白,测定490nm波长处吸光度,以吸光度为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线;
S3-供试品溶液的制备:精密称取中药提取物组合物0.8-1.2g,精密加水40-60ml,称定重量,热水浴加热15-45min,放冷,补足重量,精密量取续滤液1.0ml,置离心管中,精密加入无水乙醇19.0ml,摇匀,冷藏6-18小时,取出,以每分钟4000转的转速离心15-25min,弃去上清液,沉淀以95%乙醇洗涤两次,每次加入10ml 95%乙醇,离心,弃去上清液;沉淀加水100ml溶解,即得供试品溶液;
S4-测定:精密量取供试品溶液1.0ml,按照S2下的方法,自“精密加入5%苯酚溶液1.0ml”起,依法测定490nm波长处吸光度,从标准曲线上读出供试品溶液中葡萄糖的浓度,计算,即得;
所述的中药提取物组合物中,总多糖含量以葡萄糖计,不少于25.0%。
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