CN113694103B - 不含甘草酸的中药提取物、制备方法、药物制剂及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种不含甘草酸的中药提取物、制备方法、药物制剂及用途。该中药提取物为重量比8:3:3:2的葛根、黄芩、黄连和甘草的水提取物。本发明提供的中药提取物既保留了葛根芩连组合物的有效成分,又不含甘草酸,且药效优于含甘草酸的葛根芩连初提物。
Description
技术领域
本发明涉及一种不含甘草酸的中药提取物、制备方法、药物制剂及用途。
背景技术
葛根芩连汤临床用于糖尿病及代谢综合征方面的预防和治疗。代谢综合征是以肥胖(或超重)、高血糖、高血压、血脂代谢异常等为主要特征的一组临床综合征。医学界认为胰岛素抵抗是其发病的核心,但胰岛素抵抗是多种类型的组织细胞和信号通路共同作用的结果,难以用一种机制高度概括。常规的西医治疗(包括新型胰岛素、降糖药、代谢手术等)采取单一疾病的治疗模式对代谢综合征的各个症状进行不同方式的干预,缺乏整体干预方案,具有局限性。葛根芩连汤作为中药复方,在预防和治疗代谢综合征方面具有优势及应用前景。
甘草酸来源于方中甘草,是甘草及其相关制剂的特征性化学成分和重要的生物活性成分,常作为质量控制的指标性成分。现有研究认为,甘草酸是葛根芩连汤中的主要有效成分之一,甘草酸和小檗碱化合物组合与葛根芩连汤全方有相似的药效,且甘草酸可促进小檗碱的吸收。
葛根芩连汤用于代谢综合征的预防和治疗需长期服药。然而据文献报道,长期服用含甘草酸的制剂,存在一定的安全隐患。甘草酸在体内水解成甘草次酸,甘草次酸的化学结构类似于甾体激素。甘草酸和甘草次酸是甾体激素代谢失活酶抑制剂,可提高内源性和外源性皮质激素的活性。同时,甘草酸和甘草次酸又可作为配体,与皮质激素受体结合呈现出糖皮质激素、盐皮质激素样作用。早在20世纪60年代就已发现甘草有盐皮质激素样作用,即醛固酮样作用。大量研究表明甘草酸和甘草次酸均能使人和实验动物尿量及钠排出减少、钾排出增多,持续使用可引起高血压、水肿、低血钾、肌无力等。
发明内容
有鉴于此,本发明的一个目的在于提供一种不含甘草酸的中药提取物。发明人惊喜地发现,当不含甘草酸时,该中药提取物在预防和/或治疗代谢综合征方面仍然效果良好,某些方面甚至优于葛根芩连原方,同时又避免了长期服用甘草酸产生的不良反应。本发明的另一个目的在于提供一种不含甘草酸的中药提取物的制备方法。本发明的再一个目的在于提供一种药物制剂。本发明的又一个目的在于提供上述中药提取物在制备预防和/或治疗代谢综合征药物中的应用。本发明采用如下技术方案实现上述目的。
本发明提供一种中药提取物,其为重量比8:3:3:2的葛根、黄芩、黄连和甘草的水提取物,且所述中药提取物不含甘草酸。
在本发明中,甘草酸(Glycyrrhizic acid)的分子式为C42H62O16,分子量为822.93,结构式如下式(I)所示:
本发明还提供一种中药提取物的制备方法,包括如下步骤:
1)按重量比8:3:3:2取葛根、黄芩、黄连和甘草,加水提取,得到葛根芩连初提物;
2)除去所述葛根芩连初提物中的甘草酸,得中药提取物。
上述重量比8:3:3:2的葛根、黄芩、黄连和甘草为传统中药方剂葛根芩连汤的药材组成。本发明中所述葛根芩连组合物是指由葛根、黄芩、黄连和甘草按重量比8:3:3:2的配比经水提取并除去甘草酸后的药物组合物。本发明在不改变原有葛根芩连汤药物组成的基础上,经提取、制备液相色谱分离,选择性去除甘草酸,获得不含甘草酸的中药提取物。
在本发明中,葛根芩连提取液可以采用本领域常规水提取方法制备得到,如煎煮提取、加热回流提取、超声提取、浸泡提取等,只要能够将所述药材中的水溶性化学成分充分提取出来即可,没有特别限制。在加水提取时,葛根、黄芩、黄连和甘草可以各自分别提取,也可以将所述四种药材混合后提取,并优选将所述四种药材混合后提取。葛根、黄芩、黄连和甘草可以以饮片的形式投料,也可以将饮片经过粉碎后进行投料,没有特别限制。在一个实施方式中,这些药材以饮片形式投料,混合后加热回流提取。甘草可以为炮制后的炙甘草,也可以为未经炮制的甘草饮片,优选为炙甘草。炙甘草可通过市售购得,或采用本领域常规的炮制方法如加蜂蜜炮制而得。
根据本发明的制备方法,优选地,步骤1)中,按重量比8:3:3:2取葛根、黄芩、黄连和甘草,加水提取,将提取液与药渣分离,得提取液;将提取液减压浓缩,回收溶剂,得到葛根芩连初提物。
根据本发明的制备方法,优选地,步骤1)中,所述提取为煎煮提取、加热回流提取、浸泡提取或超声提取。煎煮提取方法适合小批量制备提取液。加热回流提取通过加水量、提取时间等参数的调整可达到煎煮提取的效果,适合放大工业化生产。浸泡提取能耗较低,操作简单,但提取率低,耗时长。因此本发明优选采用加热回流提取或超声提取,实现高效且最大化地保留葛根芩连组合物中的水溶性化学成分。
根据本发明一个优选的实施方式,步骤1)中,按重量比8:3:3:2取葛根、黄芩、黄连和甘草,用水加热回流提取1~3次,每次加水量为上述原料总重量的5~20倍,每次提取0.5~3小时,将提取液与药渣分离,得提取液;将所述提取液在85℃以下减压浓缩,回收溶剂,得葛根芩连初提取物。每次加水量可以为上述原料总重量的5~20倍,优选为5~15倍,更优选为5~12倍。每次提取时间可以为0.5~3小时,优选为1~3小时,更优选为1~2小时。
根据本发明的制备方法,优选地,步骤2)中,采用制备液相色谱法除去所述葛根芩连初提物中的甘草酸。制备液相色谱以C18硅胶为填充剂;制备液相色谱为梯度洗脱模式,采用紫外检测器检测;检测波长为254nm;采用如下方式进行洗脱:
以0.1%甲酸-水为流动相A,以乙醇为流动相B,按如下梯度进行梯度洗脱:
流速为10ml/min,柱温为室温。先用甘草酸对照品溶液进样,获得甘草酸的保留时间;再用制备液相色谱分离得到的葛根芩连初提物,参照甘草酸的保留时间,选择性地将含甘草酸的洗脱液切换至废液,收集所有不含甘草酸的洗脱液;回收溶剂,得中药提取物。
更优选地,所述制备液相色谱以十八烷基键合硅胶(C18硅胶)为填充剂。
根据本发明的一个实施方式,所述制备方法包括如下步骤:
1)按重量比8:3:3:2取葛根、黄芩、黄连和炙甘草,用水加热回流提取2次,每次加水量为上述原料总重量的5~10倍,每次提取1~2小时,将提取液与药渣分离,得提取液;将所述提取液85℃以下减压浓缩,回收溶剂,得葛根芩连初提物;
2)制备液相色谱以C18硅胶为填充剂,以0.1%甲酸-水为流动相为A,以乙醇为流动相B,按如下梯度进行梯度洗脱:
其中,流速为10ml/min,柱温为室温;采用紫外检测器检测,检测波长为254nm;先用甘草酸对照品溶液进样,获得甘草酸的保留时间;再用制备液相色谱分离得到的葛根芩连初提物,参照甘草酸的保留时间,选择性的将含甘草酸的洗脱液切换至废液,收集所有不含甘草酸的洗脱液;回收溶剂,得中药提取物。
本发明采用C18制备液相色谱法对葛根芩连初提物进行分离,通过优化的工艺条件能够选择性地、有效地去除葛根芩连初提物中的甘草酸。同时,本发明方法对葛根芩连初提物中的其它化学成分的死吸附小,基本不影响其它成分的含量和比例。目前未见可选择性去除葛根芩连初提物中甘草酸的方法报道。活性测试发现,该中药提取物保留了葛根芩连组合物的有效成分,预防和治疗代谢综合征的效果不低于葛根芩连初提物,某些方面的效果比葛根芩连初提物更好,同时能够避免长期服用甘草酸带来的潜在安全隐患,具有更好的安全性。
本发明还提供一种药物制剂,包括上述的中药提取物和药学上可接受的载体。中药提取物中的有效成分即为药物活性成分,该中药提取物在代谢综合征相关疾病模型上表现出良好的药效,较未去除甘草酸的葛根芩连初提物效果更强,且能够消除长期摄入甘草酸带来的潜在不良反应风险,具有更好的安全性。因此,本发明提供的不含甘草酸的中药提取物更适宜开发成预防和治疗代谢综合征的药物制剂。
根据本发明的药物制剂,优选地,包括上述的中药提取物和药学上可接受的载体,所述中药提取物占药物制剂总重量的0.1~99.9%,其余为药学上可接受的载体。
本发明的药物制剂形式可以是任何可药用的剂型。药物制剂包括颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂、喷剂、膜剂、膏剂、栓剂、凝胶剂、冻干剂或注射剂,片剂如口腔崩解片、分散片等,胶囊剂如软胶囊剂、硬胶囊剂等,丸剂如滴丸、微丸剂等,膏剂如软膏剂、硬膏剂等。
本发明还提供一种如上述的中药提取物在制备预防和/或治疗代谢综合征药物中的应用。本发明的中药提取物具有良好的预防和治疗代谢综合征的作用,其效果不低于原方,且在某些方面优于原方。本发明的中药提取物对高脂饮食诱导的代谢综合征效果尤为显著,能够有效降低高脂饮食造成的体重增长,并且对高脂饮食造成的脂肪肝有着显著的改善与治疗作用。由于不含甘草酸,本发明的中药提取物避免了甘草酸及其在体内的代谢产物甘草次酸的长期服用带来的潜在不良反应风险,具有更好的安全性,更容易为患者接受,适合开发成预防和治疗代谢综合征的中药创新药物。因此,可用于制备预防和/或治疗代谢综合征的药物。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明,但本发明的保护范围并不限于此。
下面介绍实施例和对比例所使用的原料药:
葛根、黄连、黄芩、甘草均为符合国家药典标准的药材。
葛根为豆科植物野葛Pueratia lobata(Willd.)Ohwi的干燥根。
黄连为毛茛科植物黄连Coptis chinensis Franch.、三角叶黄连Coptisdeltoidea C.Y.Cheng et Hsiao或云连Coptis teeta Wall.的干燥根茎。
黄芩为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根。
甘草为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、胀果甘草Glycyrrhizainflata Bat.或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的干燥根和根茎。
实施例1
按重量比8:3:3:2取葛根、黄芩、黄连和炙甘草,用水加热回流提取2次,每次加水量分别为上述原料总重量的8倍、6倍,每次提取时间分别为1.5小时、1小时,过滤,两次的提取液合并,得总提取液。将总提取液85℃以下减压浓缩,回收溶剂,得到葛根芩连初提物。
用制备液相色谱去除葛根芩连初提物中的甘草酸。制备液相色谱以C18硅胶为填充剂(Agilent Prep-C18,21.2mm×250mm,5μm),以0.1%甲酸-水为流动相为A,以乙醇为流动相B,按如下表1中的梯度进行梯度洗脱:
表1制备液相色谱用梯度洗脱表
时间(min) | A% | B% |
0 | 90 | 10 |
20 | 75 | 25 |
40 | 50 | 50 |
50 | 5 | 95 |
60 | 5 | 95 |
流速为10ml/min,柱温为室温。
采用紫外检测器检测,检测波长为254nm。先用甘草酸对照品溶液进样,获得甘草酸的保留时间(保留时间为38.5min)。再用制备液相色谱分离得到的葛根芩连初提物,参照甘草酸的保留时间,选择性的将含甘草酸的洗脱液切换至废液,收集所有不含甘草酸的洗脱液,回收溶剂,得中药提取物。
对比例1
取实施例1的葛根芩连初提物,过滤后上C18硅胶制备液相色谱(Agilent Prep-C18,21.2mm×250mm,5μm),以甲醇为流动相A,水为流动相B,梯度洗脱(0~60min,20%~100%A),流速为10ml/min,柱温为室温,采用紫外检测器检测,检测波长为254nm。测定甘草酸与相邻色谱峰的分离度。
对比例2
取实施例1的葛根芩连初提物,过滤后上C18硅胶制备液相色谱(Agilent Prep-C18,21.2mm×250mm,5μm),以乙醇为流动相A,水为流动相B,梯度洗脱(0~60min,20%~100%A),流速为10ml/min,柱温为室温,采用紫外检测器检测,检测波长为254nm。测定甘草酸与相邻色谱峰的分离度。
对比例3
取实施例1的葛根芩连初提物,过滤后上C18硅胶制备液相色谱(Agilent Prep-C18,21.2mm×250mm,5μm),以乙腈为流动相A,水为流动相B,梯度洗脱(0~60min,20%~100%A),流速为10ml/min,柱温为室温,采用紫外检测器检测,检测波长为254nm。测定甘草酸与相邻色谱峰的分离度。
对比例4
取实施例1的葛根芩连初提物,过滤后上C18硅胶制备液相色谱(Agilent Prep-C18,21.2mm×250mm,5μm),以80%甲醇水为流动相,等度洗脱,流速为10ml/min,柱温为室温,采用紫外检测器检测,检测波长为254nm。观察甘草酸与相邻色谱峰的分离效果。
对比例5
取实施例1的葛根芩连初提物,过滤后上C18硅胶制备液相色谱(Agilent Prep-C18,21.2mm×250mm,5μm),以70%乙醇水为流动相,等度洗脱,流速为10ml/min,柱温为室温,采用紫外检测器检测,检测波长为254nm。观察甘草酸与相邻色谱峰的分离效果。
对比例6
取实施例1的葛根芩连初提物,过滤后上C18硅胶制备液相色谱(Agilent Prep-C18,21.2mm×250mm,5μm),以70%乙腈水为流动相,等度洗脱,流速为10ml/min,柱温为室温,采用紫外检测器检测,检测波长为254nm。观察甘草酸与相邻色谱峰的分离效果。
实施例2
取实施例1制备的中药提取物10重量份,加淀粉6重量份和滑石粉2重量份,混匀,用80%(体积百分浓度)乙醇制粒,60℃以下干燥,加入硬脂酸镁0.2重量份,混匀,压制成片,即得含有中药提取物的片剂。
实施例3
取实施例1制备的中药提取物50重量份,加蔗糖粉63重量份和糊精31.5重量份,混匀,以80%(体积百分浓度)乙醇制粒,60℃以下干燥,整粒,分装,即得含有中药提取物的颗粒剂。
实施例4
取实施例1制备的中药提取物30重量份,加淀粉12重量份和滑石粉8重量份,混匀,用80%(体积百分浓度)乙醇制粒,60℃以下干燥,装胶囊,即得含有中药提取物的胶囊剂。
实施例5
取实施例1制备的中药提取物1重量份,加21重量份聚乙二醇-6000,混合均匀,加热熔融,化料后移至滴丸滴灌中,药液滴至6~8℃液体石蜡中,除油,制滴丸,即得含有中药提取物的滴丸剂。
实施例6
取实施例1制备的中药提取物10重量份、葡萄糖90重量份、硫代硫酸钠18重量份和蒸馏水20重量份,混合均匀后,冷冻干燥,分装,即得含有中药提取物的冻干剂。
实验例1
实施例1和对比例1-3采用不同流动相的梯度洗脱方法。采用实施例1的洗脱方法,甘草酸与相邻色谱峰的分离度为1.5。采用对比例1-3的洗脱方法,甘草酸与相邻色谱峰的分离度依次为1.1、1.2、1.1。
对比例4-6采用等度洗脱方法,甘草酸与相邻色谱峰均无法实现基线分离,且保留较强的成分无法从色谱柱上洗脱,不能达到选择性去除甘草酸而不影响其它成分的目的。
实施例1的梯度洗脱方法分离效果更好,甘草酸与相邻色谱峰分离度良好,且全部成分可以从色谱柱上洗脱,能够达到选择性去除甘草酸而不影响其它成分的目的。甲酸的加入有效调整色谱峰峰形,改善分离效果。
此外,发明人还尝试了以下对甘草酸的去除方法:
(一)取实施例1的葛根芩连初提物5g,上硅胶柱(装柱硅胶100g,径高比1:10),依次以氯仿甲醇10:1、氯仿甲醇5:1、氯仿甲醇2:1、氯仿甲醇1:1、甲醇梯度洗脱,每个梯度洗脱4个柱体积,收集洗脱液,回收溶剂。该实验方法不能实现将甘草酸有效地分离。
(二)取实施例1步骤1)制备的葛根芩连初提物5g,上Sephadex LH-20色谱柱(Sephadex LH-20填料300g,径高比1:50),以甲醇洗脱,共洗脱15个柱体积,收集洗脱液,回收溶剂。该实验方法不能实现将甘草酸有效地分离。
实验例2
取实施例1制备的中药提取物0.1g,称定重量,加70vol%甲醇20mL,超声提取2次,每次30min,合并上清,12000r/min,离心10min,取上清300μL,氮气吹干。用300μL 70vol%甲醇复溶,13000r/min,离心10min,吸取上清液2μL注入LC-MS。
采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS对实施例1制备的中药提取物的化学成分进行分析。UHPLC-Q-TOF-MS/MS色谱条件如下:
色谱柱:Waters Acquity BEH C18 column(2.1×100mm,1.7μm);
柱温:35℃;
流动相A为0.1%甲酸-水;
流动相B为乙腈;
流速:0.3ml/min;
进样体积:2μl;
洗脱梯度如下表2所示:
表2
时间(min) | A% | B% |
0 | 95 | 5 |
3 | 95 | 5 |
10 | 70 | 30 |
15 | 60 | 40 |
25 | 46 | 54 |
28 | 46 | 54 |
34 | 5 | 95 |
38 | 5 | 95 |
39 | 95 | 5 |
UHPLC-Q-TOF-MS/MS质谱条件如下:
电喷雾离子源ESI,正负离子扫描模式,扫描范围m/z 100-1500,参见表3。
表3
离子模式 | ESI(+) | ESI(-) |
GS1 | 55 | 55 |
GS2 | 55 | 55 |
CUR | 35 | 35 |
TEM | 550 | 550 |
ISVF | 5500 | -4500 |
DP(MS) | 60 | -60 |
CE(MS) | 5 | 5 |
DP(MS/MS) | 50 | 50 |
CE(MS/MS) | 30 | -30 |
CES | 5 | 5 |
结合MS精确分子量,MS/MS二级裂解规律,以及Pubchem等开放数据库的结果,共鉴定出16个化合物。鉴定结果及色谱峰归属参见下表4和表5。
表4负离子模式鉴定结果及色谱峰归属
表5正离子模式鉴定结果及色谱峰归属
由表可知,实施例1制备的中药提取物中未检测到甘草酸。
实验例3
通过高脂饮食诱导代谢综合征小鼠模型对葛根芩连初提物及不含甘草酸的中药提取物在体内药效功能进行验证,评价药效。
C57BL/6J雄鼠4周龄。
二甲双胍:Sigma-Aldrich;
生理盐水:河南科伦药业有限公司;
普通饲料:北京科澳协力饲料有限公司;
高脂饲料:常州市鼠一鼠二生物科技有限公司;
PCR试剂盒:北京全式金生物技术有限公司;
C57BL/6J雄鼠,4周龄(体重16~18克)。小鼠自由饮水饮食,12小时光照/黑暗循环,温度控制在21±2℃,湿度50-70%。适应性喂养一周后,随机分为5组,每组6只,分为空白对照组、模型组、二甲双胍组(阳性药对照组)、全方组(给予实施例1的葛根芩连初提物)和去甘草酸组(给予实施例1的中药提取物)。其中空白对照组正常饮食,另外4组给予高脂饮食(HFD,60%能量来自脂肪)。
空白对照组正常饮食,每只灌生理盐水0.2ml/次,每周5天,共14周;
模型组给予高脂饮食,每只灌生理盐水0.2ml/次,每周5天,共14周;
二甲双胍组给予高脂饮食,给予二甲双胍,药物剂量为200mg/kg,灌胃剂量0.2ml/次,每周5天,共14周;
全方组给予高脂饮食,以葛根芩连初提物灌胃,按照每只小鼠灌胃0.2ml,单次剂量为2.01g/kg,早晚各一次,总剂量为4.027g/kg/d,共14周;
去甘草酸组给予高脂饮食,以不含甘草酸的中药提取物灌胃,按照每只小鼠灌胃0.2ml,单次剂量为2.01g/kg,早晚各一次,总剂量为4.027g/kg/d,共14周;
每周测量动物体重。实验结束时处死小鼠,收集肝脏组织样本留作实验例4的病理分析。
各组动物在实验过程中的体重增加量见表6。结果显示全方组和去甘草酸组均能抑制高脂饮食造成的体重异常增长,具有显著的控制体重增加的功能,且去甘草酸组较全方组效果更好。
表6药理实验中各组动物体重增加量的结果
分组/时间点 | 空白对照组 | 去甘草酸组 | 二甲双胍组 | 全方组 | 模型组 |
D0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
D7 | 1.57±0.48 | 1.77±0.24 | 1.88±0.73 | 1.70±0.38 | 1.98±0.65 |
D14 | 2.65±0.92 | 2.60±0.27 | 3.00±0.81 | 3.27±0.79 | 3.72±1.24 |
D21 | 3.73±0.85 | 3.58±0.12 | 3.72±0.89 | 4.13±1.11 | 4.93±1.65 |
D28 | 3.60±1.04 | 4.13±0.65 | 4.78±0.95 | 4.75±1.33 | 6.15±1.89 |
D35 | 4.28±1.24 | 5.97±0.67 | 6.60±1.34 | 6.77±1.84 | 6.62±1.87 |
D42 | 4.68±1.46 | 6.87±1.09 | 7.95±1.59 | 7.72±1.46 | 9.27±2.31 |
D49 | 6.01±1.37 | 8.87±1.31 | 9.00±1.91 | 8.70±1.72 | 11.20±2.59 |
D56 | 5.73±1.43 | 9.68±1.86 | 9.05±2.38 | 10.18±2.24 | 12.83±2.93 |
D63 | 6.58±1.39 | 10.00±2.06 | 10.20±2.44 | 11.07±2.30 | 13.87±3.12 |
D70 | 7.05±1.47 | 12.05±2.43 | 12.27±3.31 | 11.85±4.51 | 16.98±3.58 |
D77 | 7.20±1.49 | 13.40±2.96 | 13.72±3.59 | 14.83±2.61 | 19.03±3.82 |
D84 | 7.22±1.19 | 14.68±3.24 | 14.73±4.64 | 15.83±3.32 | 20.75±3.77 |
D91 | 7.90±1.24 | 14.90±3.65 | 15.17±5.28 | 17.15±3.53 | 21.95±3.93 |
D98 | 7.77±1.34 | 14.67±3.59 | 14.48±5.63 | 16.25±3.49 | 21.23±3.88 |
注:D表示天数,体重增加量的单位为克。
实验例4
观察葛根芩连初提物和不含甘草酸的中药提取物对高脂饮食诱导的代谢综合征小鼠肝脏的影响。
采用上述实验例3药理实验中收集的的小鼠肝脏组织。
多聚甲醛:上海麦克林生化科技有限公司(MACKLIN);
无水乙醇:广东光华科技股份有限公司(JHD);
脱蜡剂:珠海贝索生物技术有限公司;
包埋石蜡:上海华灵康复器械厂;
苏木素:深圳市鹏一医疗器有限公司;
伊红:深圳市鹏一医疗器有限公司;
中性树胶:中国上海标本模型厂;
组织脱水机:泰维科技,TC-120C;
包埋机:泰维科技,TB-718D;
切片机:Leica,HistoCore BIOCUT;
恒温摊片烤片机:泰维科技,TK-218II;
光学显微镜:ZEISS,Primo Star;
组织经4%多聚甲醛固定24小时以上,常规脱水,石蜡包埋。包埋后使用切片机切片,切片厚度3μm。切片根据下表7顺序进行预处理,然后根据下表8的顺序进行HE染色,晾干后使用中性树胶封片,树胶凝固后显微镜下观察。
表7
表8
试剂 | 时间 |
苏木素 | 8min |
流水洗涤 | 3次 |
0.5%盐酸酒精(分化) | 5s |
流水洗涤 | 3次 |
自来水(返蓝) | 10min |
95%乙醇 | 1min |
伊红 | 10min |
100%乙醇I | 25s |
100%乙醇II | 25s |
100%乙醇III | 25s |
脱蜡剂III | 2min |
从肝脏组织切片中可以看出,正常饮食的空白对照组小鼠肝脏形态正常,正常对照组肝细胞体积大、排列紧密、嗜酸性,肝细胞索之间为肝血窦,血窦壁可见内皮细胞和肝巨噬细胞。而高脂喂养模型组小鼠肝脏则肝细胞肿胀,细胞内均出现大小不一、圆形、有张力的脂滴,主要位于肝小叶周边区,并出现炎性细胞浸润。模型组脂滴数量最多,大小为0.4~1.0μm,体积较大。
二甲双胍组脂滴大小为0.4~0.7μm,数量也较多。
全方组脂滴有所减少,但是仍然有较明显的脂滴存在,大小为0.3~0.6μm,体积中等偏大。
去甘草酸组(不含甘草酸的中药提取物组)脂滴减少明显,大小为脂滴大小为0.3~0.5μm,数量上明显下降,体积略有下降。
结果显示葛根芩连初提物对高脂饮食造成的脂肪肝有着显著的改善与治疗作用,而去甘草酸后的中药提取物对脂肪肝的治疗效果没有影响,甚至更优。
文献报道部分敏感患者(如原发高血压患者或盐皮质激素敏感个体)应用小剂量甘草酸类药物即能产生假性醛固酮增多症,引起高血压(张明发,沈雅琴.甘草酸及其苷元甘草次酸的盐皮质激素样作用研究进展.现代药物与临床,2011,26(6):448-452.)。显然,不含甘草酸的中药提取物在不降低代谢综合症治疗效果的基础上,能够基本排除长期服用甘草酸带来的潜在安全隐患,具有更好的安全性和成药性。
本发明并不限于上述实施方式,在不背离本发明的实质内容的情况下,本领域技术人员可以想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的范围。
Claims (1)
1.一种不含甘草酸的中药提取物的制备方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:
按重量比8:3:3:2取葛根、黄芩、黄连和炙甘草,用水加热回流提取2次,每次加水量分别为上述原料总重量的8倍、6倍,每次提取时间分别为1.5小时、1小时,过滤,两次的提取液合并,得总提取液;将总提取液在85℃以下减压浓缩,回收溶剂,得到葛根芩连初提物;
用制备液相色谱去除葛根芩连初提物中的甘草酸;制备液相色谱以C18硅胶为填充剂,以0.1%甲酸-水为流动相为A,以乙醇为流动相B,按如下梯度进行梯度洗脱:
流速为10ml/min,柱温为室温;
采用紫外检测器检测,检测波长为254nm;先用甘草酸对照品溶液进样,获得甘草酸的保留时间,其保留时间为38.5min;再用制备液相色谱分离得到的葛根芩连初提物,参照甘草酸的保留时间,选择性地将含甘草酸的洗脱液切换至废液,收集所有不含甘草酸的洗脱液,回收溶剂,得中药提取物;
所述中药提取物用于制备预防和/或治疗代谢综合征,且不具有由甘草酸引起的不良反应的药物。
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