CN101933990A - 蓬子菜总黄酮在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了利用大孔树脂和聚酰胺柱层析方法首次从茜草科植物蓬子菜Galium verumL.的全草中大量制备高含量蓬子菜总黄酮。并首次证明蓬子菜总黄酮在制备降血糖药物中的应用。具体的说蓬子菜总黄酮在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂药物中的新用途，在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂药物中可以是蓬子菜总黄酮，也可以是含蓬子菜总黄酮的组合物。并且阐述了蓬子菜总黄酮药物制剂，药物制剂可以是片剂、胶囊剂、颗粒剂、滴丸剂或注射剂等。

Description

蓬子菜总黄酮在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂药物中的应用

技术领域

本发明是关于蓬子菜总黄酮的医药新用途，具体的说是蓬子菜总黄酮在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂药物中的应用，也涉及该药物的提取分离和药物制剂，本发明属于医药技术领域。

背景技术

糖尿病是一组由遗传和环境因素相互作用而引起的临床综合征，系因胰岛素分泌绝对或相对不足及靶组织对胰岛素敏感性降低，引起机体糖、脂肪、蛋白质、水和电解质等一系列代谢紊乱，临床以高血糖为主要共同标志。久病可引起多系统损害，病情严重或应激时可发生急性代谢紊乱如酮症酸中毒等。α-葡萄糖苷酶抑制剂是通过竞争性抑制α-葡萄糖苷酶的活性，可阻滞双糖水解为单糖，延缓糖的吸收，使血糖平稳并缓慢的维持在一定的水平，防治餐后高血糖症，同时还可以提高糖耐量，预防和治疗肥胖症，高三酰甘油血症，用于治疗应碳水化合物紊乱而引起的疾病。实验研究表明阿卡波糖治疗糖尿病动物模型的慢性并发症有效，通过降低餐后血糖浓度而减少蛋白糖基化，延迟或阻止肾、视网膜神经病变发生以及缺血性心肌病的发展。文献报道主要α-葡萄糖苷酶抑制剂有多糖、生物碱、苷类、多肽、糖苷类、黄酮类、皂苷和酚类等。一些中草药的提取物也具有很好的抑制α-葡萄糖苷酶的作用，如绿茶提取物和大黄、山茱萸、赤芍、五倍子水煎煮醇沉提取物，以及广西血竭全粉和分步提取物、五味子和虎杖的水提取物等。现有的此类药物成本较高，生产厂家很少，不能满足现有市场的要求，开发成本低、疗效好的具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的药物是现在研究领域中的前沿。

蓬子菜为茜草科植物蓬子菜Galium verumL.的全草。别名有松叶草、铁尺草、月经草(《四川常用中草药》)、黄牛尾(徐州《单方验方新医疗法选编》)、黄米花、柳夫绒篙、疗毒篙、鸡肠草(东北常用中草药手册)等。全草入药，能活血去瘀、解毒止痒、利尿、通经，主治疮痈中毒、跌打损伤、经闭、腹水、蛇咬伤、凤疹瘙痒。全草有利胆作用，其有效成分车叶草甙具有缓泻及降压作用。对蓬子菜采用不同溶媒所得的提取物进行抑菌试验，结果表明：以水提取法抑菌效果为最强，水提醇沉法略有抑菌作用，醇提法则无抑菌作用(佳木斯医学院学报，1994年第17卷第4期，22-23)。其新鲜植物的液汁或煎剂，外用可治皮疹。李传仁报道了由蓬子菜组成的复方制剂用于治疗荨麻疹、各类皮肤病引起的痒症，具有良好的治疗和止痒效果(公开号：CN1110568)。张文斌报道了治疗皮肤病的外用中药(公开号：CN1322544)，是由蓬子菜等药材组成的复方制剂具有治疗皮肤病方面的应用。史国玉硕士研究论文报道了蓬子菜有效部位中黄酮类化合物的化学研究(黑龙江中医药大学)，黄酮类成分用乙醇提取、浓缩后通过AB-8大孔树脂，再经过聚酰胺树脂柱，得到总黄酮类成分。我们提取的总黄酮是利用钙离子技术提取，提取液不经过浓缩直接经过大孔树脂，解决了浓缩后小极性成分析出，包裹有效成分、溶液浑浊不利于上柱的问题。与报道的提取总黄酮的方法有本质的区别和明显的技术进步。到目前为止还没有文献报道蓬子菜总黄酮具有降血糖作用，尤其具有α-葡萄糖苷酶抑制作用。我们在对检索文献及专利的基础上，对蓬子菜总黄酮进行了α-葡萄糖苷酶抑制实验，并且具有良好的药理作用。

本发明所述的蓬子菜总黄酮有效组分，是指包含多种黄酮类活性成分的组合物，这些黄酮类成分主要包括香叶木苷、木犀草苷、芸香苷、异槲皮苷、槲皮素等，以及以其为母核的衍生物。

本发明完成前未发现有关蓬子菜总黄酮作为α-葡萄糖苷酶抑制剂的报道，也未发现蓬子菜总黄酮在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂药物中的应用的报道。

本发明的特点在于蓬子菜用乙醇或甲醇提取时，加入氧化钙或氢氧化钙，利用钙离子技术除去一些色素、鞣质、油脂类化学成分，提取后，得到提取液不浓缩直接上大孔树脂，操作简单，并且解决了浓缩后小极性的成分析出，包裹有效成分、溶液浑浊不利于上柱的问题。回收溶剂后。再经聚酰胺柱纯化、可获高含量总黄酮组合物；整个生产工艺仅用乙醇，不使用易燃易爆和有毒溶剂，生产工艺简单、生产周期短，安全、不污染环境，成本低，收率高，特别适合产业化大量生产。

发明内容

本发明通过进一步动物试验研究证明了蓬子菜总黄酮在制备降血糖药物方面的应用，尤其在制备α-糖苷酶抑制剂类药物方面的应用。

在本发明申请前未发现有关蓬子菜总黄酮具有在制备降血糖药物方面的应用，尤其在制备α-糖苷酶抑制剂类药物方面的应用的报道。在制备α-糖苷酶抑制剂类药物方面的应用是本发明的一个主要创新点。α-葡萄糖苷酶抑制剂有多糖、生物碱、苷类、多肽、糖苷类、黄酮类、皂苷和酚类等。一些中草药的提取物也具有很好的抑制α-葡萄糖苷酶的作用，如绿茶提取物和大黄、山茱萸、赤芍、五倍子水煎煮醇沉提取物，以及广西血竭全粉和分步提取物、五味子和虎杖的水提取物等。所以并未见蓬子菜黄酮类成分在制备α-糖苷酶抑制剂类药物方面的应用报道。

本发明目的之二是提供了蓬子菜总黄酮提取分离方法，以往公开的提取蓬子菜总黄酮的方法多是利用乙酸乙酯或正丁醇萃取，仅限于实验室的分离，不适合产业化生产。或以水或乙醇提取，浓缩后用大孔树脂或聚酰氨分离与本发明有很大的差别。本发明采用了乙醇提取和大孔树脂或聚酰胺柱层析的方法纯化的蓬子菜总黄酮组合物，可操作性强，适合工业生产。本发明首次采用了加入氧化钙或氢氧化钙，利用乙醇或甲醇提取蓬子菜，提取液加入活性炭脱色、不经过浓缩，直接在大孔树脂上吸附纯化，解决了乙醇或甲醇提取液浓缩后极性小的化学成分析出，包裹有效成分、药液混浊，不利于在大孔树脂或聚酰胺柱上吸附纯化的问题。也是本发明的创新点之一。

并且本发明还公开了此总黄酮中，主要含有香叶木苷、木犀草苷、芸香苷、异槲皮苷、槲皮素，以及以香叶木苷和槲皮素为母核的衍生物。总黄酮的含量可以达70％以上。

本发明的目的之三是提供蓬子菜总黄酮的药物制剂。主要是口服制剂，主要选自片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、混悬剂、滴丸剂，口服制剂中的任何一种。

本发明目的之四是提供药物优选含有1％-99％的蓬子菜总黄酮和99％-1％的药用赋形剂或其它可组方的药物。本发明药物中的其它配伍的药物，指的是以有效剂量的蓬子菜总黄酮为一定的药物原料，再配伍其它允许合用的中药或化学药品。

蓬子菜总黄酮利用紫外比色法测定：

对照品溶液的制备 精密称取香叶木苷对照品，用乙醇溶解制成0.005mg/ml的对照品溶液。

供试品溶液的制备 取蓬子菜总黄酮提取物5mg，精密称定，置100ml量瓶中，加乙醇80ml，超声30min，放置至室温，乙醇定容至刻度，摇匀，精密量取1ml，置10ml量瓶中，加乙醇至刻度，作为供试品溶液。

测定法 分别取对照品溶液、供试品溶液、空白对照。照分光光度法(《中国药典》2005年版一部附录V B)，在波长334nm处分别测定吸收度，计算。

提取物中含总黄酮以香叶木苷计不低于70％。

蓬子菜总黄酮具有α-糖苷酶抑制作用，通过以下药效学试验例得到证实。

蓬子菜总黄酮对α-糖苷酶的抑制作用

1.标准反应体系 67mmol/L磷酸钾缓冲液(pH6.8)150ul，1mg/ml谷胱甘肽溶液50μl，0.1mg/mlα-葡萄糖苷酶溶液100μl，37℃保温10min，20mmol/LPNPG溶液100ul，37℃反应20min后加入0.2mol/L Na₂CO₃溶液400ul终止反应，测定400nm处光吸收值。

样品对酶活性的抑制率计算公式：

抑制率(％)＝(A对照-A样品)/A对照×100％

2.拜糖平对α-葡萄糖苷酶活性的影响取研磨后的拜糖平配制成10mg/ml的原溶液，并以此稀释成20，10，5，2.5，1mg/ml不同浓度。将100ul拜糖平加入到酶反应体系中，先与酶在37℃保温10min，再加底物反应20min，用Na₂CO₃溶液终止反应，测定400nm处光吸收值。

3蓬子菜总黄酮对α-葡萄糖苷酶活性的影响

蓬子菜总黄酮用二甲基亚砜溶解，用缓冲液稀释至1.0mg/ml，抑制率高于70％，然后进行复筛。用缓冲液将蓬子菜总黄酮稀释至浓度为1.0，0.5，0.25，0.125，0.0625，0.03125mg/ml。将100ul蓬子菜总黄酮加入到反应体系中，测定蓬子菜总黄酮对α-葡萄糖苷酶的抑制作用。实验结果见表1。

        表1 蓬子菜总黄酮对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

结果表明，改变拜糖平的浓度，拜糖平对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用具有良好的量效关系。蓬子菜总黄酮在浓度为20，10，5，2.5，1，0.5mg/ml浓度下，对α-葡萄糖苷酶的抑制作用存在良好的量效关系，有很强的抑制作用。蓬子菜总黄酮对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用是阳性药拜糖平的4倍，对α-葡萄糖苷酶表现出非常强的抑制作用。

本发明是通过如下的实验施例得以实现(证实)

实施例1、蓬子菜总黄酮的提取制备：

蓬子菜药材1kg，用10倍量含3％氧化钙的70％的乙醇回流提取3次，每次2小时，过滤，滤液中加药液体积0.5％药用活性碳，过滤，滤液直接通过大孔树脂柱，再用70％乙醇洗脱3BV，收集流出液及洗脱液，回收溶剂，浓缩至每1ml含0.5g药材，通过聚酰胺树脂柱，先用水洗脱2BV，再用60％乙醇洗脱，收集60％乙醇洗脱液，回收溶剂，浓缩干燥，得蓬子菜总黄酮。收率为：0.75％，总黄酮含量为86.5％。

实施例2、蓬子菜总黄酮的提取制备：

蓬子菜药材1kg，用8倍量含4％氧化钙的60％的乙醇回流提取2次，每次3小时，过滤，滤液中加药液体积0.3％药用活性碳，过滤，滤液直接通过大孔树脂柱，再用60％乙醇洗脱3BV，收集流出液及洗脱液，回收溶剂，浓缩至每1ml含0.5g药材，通过聚酰胺树脂柱，先用水洗脱2BV，再用60％乙醇洗脱，收集60％乙醇洗脱液，回收溶剂，浓缩干燥，得蓬子菜总黄酮。收率为：0.80％，总黄酮含量为90.2％。

实施例3、蓬子菜总黄酮的提取制备：

蓬子菜药材500g，用10倍量含3％氧化钙的70％的甲醇回流提取2次，每次3小时，过滤，滤液中加药液体积0.5％药用活性碳，过滤，滤液直接通过大孔树脂柱，再用70％甲醇洗脱3BV，收集流出液及洗脱液，回收溶剂，浓缩至每1ml含0.5g药材，通过聚酰胺树脂柱，先用水洗脱2BV，再用70％甲醇洗脱，收集70％甲醇洗脱液，回收溶剂，浓缩干燥，得蓬子菜总黄酮。收率为：0.72％，总黄酮含量为92.6％。

实施例4、(胶囊剂)

蓬子菜总黄酮原料200g，药用淀粉适量，混合均匀，制粒，干燥，整粒，装入1号胶囊，制成1000粒，即得。每次3粒、每日2次。

实施例5、(片剂)

蓬子菜总黄酮原料200g，药用淀粉适量，糊精适量，混合均匀，制粒，干燥，整粒，干燥，加入润滑剂适量，压片，制成1000片，即得。每次3片、每日2次。

实施例6、(滴丸剂)

称取30g聚乙二醇4000，在水浴上熔化，蓬子菜总黄酮原料20g，搅拌均匀，倾入保温管中，调节恒温装置，使药液在80-90℃下滴入冷却过的液体石蜡中，滴完后，将药丸倾入滤纸上吸干石蜡油，制成1000粒，即得。每次30粒、每日2次。

实施例7、(颗粒剂)

蓬子菜总黄酮原料300g，糖粉200g，混合均匀，用适量乙醇制粒，干燥、整粒、分装，制成500袋，即得。每次1袋、每日2次。

Claims (9)

1.蓬子菜总黄酮在制备降血糖药物中的应用及制剂。

2.按照权利要求1所述应用，其特征为制备α-葡萄糖苷酶抑制剂的药物中的应用。

3.权利要求1所述蓬子菜总黄酮是从茜草科植物蓬子菜Galium verumL.的全草中提取得到。

4.权利要求1所述蓬子菜总黄酮制备方法其特征在于：药材用含0.2-5.0％氧化钙或氢氧化钙的50-80％的乙醇或甲醇回流提取2-3次，每次1-3小时，加药液体积0.2-2.0％药用活性碳，过滤，滤液直接通过大孔树脂柱，再用50-80％乙醇或甲醇洗脱，收集流出液及洗脱液，回收溶剂，浓缩至每1ml含0.5g药材，通过聚酰胺树脂柱，先用水洗脱，再用40-80％乙醇或甲醇洗脱，收集40-80％乙醇或甲醇洗脱液，回收溶剂，浓缩干燥，得蓬子菜总黄酮。

5.权利要求4所述的大孔树脂为D101、D201、AB-8、D4020、HPD826，S-8，优选D101和AB-8树脂。

6.根据权利要求1所述的应用其特征在于：含有有效治疗剂量的蓬子菜总黄酮及一种或多种药学上可接受的药用赋形剂，或可与蓬子菜总黄酮组方的其它药物制成的制剂。

7.根据权利要求6所述的药物制剂，其特征在于优选含有1％-99％的蓬子菜总黄酮和99％-1％的药用赋形剂或其它可组方的药物制成口服制剂的剂型。

8.根据权利要求7所述的药物制剂，其特征在于所说的口服制剂选自于片剂、丸剂、胶囊剂、软胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、滴丸、口服液体制剂当中的任何一种。

9.权利要求8所述的药用赋形剂包括填充剂、崩解剂等，填充剂选自淀粉、乳糖、微晶纤维素、糊精、磷酸钙等；崩解剂选自羧甲基淀粉钠、羟丙纤维素、交联聚维酮；也可选加黏合剂、润湿剂和润滑剂。