CN103156869A - 从桑属植物提取的桑根酮c、桑根酮d及组合物的医药新用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种从桑白皮、桑枝、桑叶中提取的桑根酮C、桑根酮D及以桑根酮C、桑根酮D为主要成分的组合物的医药新用途,具体的说是桑根酮C、桑根酮D单一成分及桑根酮C、桑根酮D与桑皮素、桑皮苷、氧化白藜芦醇、白藜芦醇、脱氧野尻霉素组成的组合物在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂药物中的应用,该组合物可以是由含有以上化学成分的药材分别提取后按照一定比例配比,也可以将同时含有以上化学成分的药材利用几种提取方法提取后得到的组合物。本发明还意外的发现桑白皮、桑枝、桑叶中除脱氧野尻霉素等生物碱外,还含有桑根酮C、桑根酮D具有比脱氧野尻霉素等生物碱更强的α-葡萄糖苷酶抑制的药理活性。
Description
技术领域
本发明是关于从桑白皮、桑枝、桑叶中提取的桑根酮C、桑根酮D及以桑根酮C、桑根酮D为主要成分组合物的医药新用途,具体的说是桑根酮C、桑根酮D单一成分及以桑根酮C、桑根酮D为主要成分,再配以适量的桑皮素、桑皮苷、氧化白藜芦醇、白藜芦醇、脱氧野尻霉素组成的组合物在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂药物中的应用,也涉及该药物的药物制剂,本发明属于医药技术领域。
背景技术
糖尿病是目前仅次于肿瘤和心、脑血管病的常见病,近来研究发现其病发过程中往往先出现餐后高血糖,而后发展成糖尿病,故餐后高血糖对机体的危害非常大。目前临床上应用的降血糖药物除胰岛素外,多数为化学合成药物,长期服用化学合成药物给患者带来的毒副作用是比较明显的。中药复方疗效确切、无明显的毒副作用,但疗效慢且加工而成的中成药品种少。
α-葡萄糖苷酶抑制剂可抑制葡萄糖苷酶的活性,使葡萄糖的生成和吸收减缓,从而减低餐后血糖峰值,调整血糖水平,减少血糖对胰腺的刺激,提高胰岛素的敏感性,保护胰腺的功能,有效预防并改善并发症的发生和发展(李玉萍,白冰,叶军,等.α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备和活性研究进展[J].食品科学,2008,29(9):617.)。因此,葡萄糖苷酶抑制剂在治疗糖尿病方面具有广阔的应用前景。天然植物性食物和传统草药在降血糖、糖尿病防治中发挥着重要作用,是α-葡萄糖苷酶抑制剂的主要来源。利用生物导向鉴定、色谱、质谱等分析技术证明具有α-葡萄糖苷酶抑制剂样作用的植物化学物主要包括多糖、酚类物质、生物碱、糖苷、皂苷、植物固醇等(药物生物技术,2009年第16卷4期,388-392)。现今药物市场上缺少有效部位天然化合物制备而成的降血糖药物,本发明通过研究发现桑根酮C、桑根酮D单一成分及桑根酮C、桑根酮D与桑皮素、桑皮苷、氧化白藜芦醇、白藜芦醇、脱氧野尻霉素组成的组合物具明显抑制α-葡萄糖苷酶活性,具有明显降血糖作用。
有文献报道了桑叶、桑枝、桑白皮的提取物或总黄酮具有降血糖作用,这种提取物或总黄酮是一种粗提物,没有明确粗体物的化学成分,是一种复杂的混合物。潘勤发明专利(公开号:CN1981814A)报道了桑叶提取物具有降血糖作用,其中总生物碱和总黄酮的含量之和大于提取物总成分的50%,也没有明确起作用的化学成分是什么。白钢等发明专利(申请号:200410018677.4)报道了从桑白皮中提取的总生物碱(采用离子交换树脂)与槲皮素、茶多酚、儿茶素等一般的黄酮组成的组合物具有α-葡萄糖苷酶抑制剂活性。段震文发明专利(公开号:CN101297863B、CN101108206B)报道了一种桑白皮提取物具有α-葡萄糖苷酶抑制剂活性,这种提取物利用离子交换树脂或活性炭进行纯化,实际是一种生物碱组合物。赵忠启研究报道了桑枝皮中生物碱脱氧脱氧野尻霉素具有降血糖活性。周锋等研究表明,桑白皮总黄酮具有降血糖作用(激光杂志,2010,31(5),93-94),其实质这种总黄酮是一种粗提取物,同时含有脱氧野尻霉素等生物碱,所以并不能说明主要的活性成分是什么。周应军发明专利(公开号:CN1318034C)报道了桑白皮提取物具有预防和治疗糖尿病的作用,这种提取物是一种粗体物,而且里面含有脱氧野尻霉素,在做药效学试验时称为桑皮素,实际上并不是单一成分,而是一种多种成分的混合物,没有明确药效学成分。金晓明等研究报道了桑皮素具有降血糖的作用,实际用的原料也是周应军发明专利中提到的混合物,简称桑皮素,并不是桑皮素单一成分。王琳等发明专利(公开号:CN101955487A)报道了一种制备桑皮素的方法,但是没有明确药效学成分。卢艳花发明专利(公开号:CN101716165A )报道了氧化白藜芦醇具有在α-葡萄糖苷酶抑制剂活性。
本发明首次发现从桑属植物中提取的桑根酮C、桑根酮D具有抑制α-葡萄糖苷酶的活性。本发明的组合物是以桑根酮C、桑根酮D为主要活性成分的组合物,其中也包括适量的桑皮素、桑皮苷、氧化白藜芦醇、白藜芦醇、脱氧野尻霉素成分,该组合物可以是由含有以上化学成分的药材分别提取后按照一定比例配比,也可以将同时含有以上化学成分的药材利用几种提取方法提取后得到的组合物。本发明专利是将桑白皮药材利用不同的分离手段得到本发明专利中的各个单一化合物,然后将其进行配比,得到具有很强的α-葡萄糖苷酶抑制剂活性的组合物。
本发明完成前未发现有关桑根酮C、桑根酮D单一成分及由桑根酮C、桑根酮D、桑皮素、桑皮苷、氧化白藜芦醇、白藜芦醇、脱氧野尻霉素组成的组合物具有抑制α-葡萄糖苷酶的活性及其预防和治疗高血糖方面应用的报道。
发明内容
本发明的目的是首次发现了从桑白皮、桑枝、桑叶中提取的桑根酮C及桑根酮D具有抑制α-葡萄糖苷酶的活性,具有明显的创新性和技术进步。
本发明的另一目的是提供一种以桑根酮C、桑根酮D为主要活性成分并含有桑皮素、桑皮苷、氧化白藜芦醇、白藜芦醇、脱氧野尻霉素等成分组成的药物组合物,该组合物可用于制备α-葡萄糖苷酶抑制剂类药物及保健品, 该组合物具有在制备高血糖疾病的药物及保健品中的新用途,具有明显的创新性和技术进步。
本发明的另一目的及特点是:提供了一种可产业化的以桑根酮C、桑根酮D为主要活性成分的组合物,既具有中药化学成分复方的特点、又具有化学成分明确、组成比例搭配得当的优势,该组合物是由桑根酮C、桑根酮D、桑皮素、桑皮苷、氧化白藜芦醇、白藜芦醇、脱氧野尻霉素组成。与以往文献报道从桑白皮、桑枝、桑叶中提取的提取物、总黄酮、生物碱有明显的区别,以往报道的提取物均是粗提取物,所以具体的活性成分不清楚;总黄酮也是一种粗提取物,已公开的文献和专利主要以芦丁或槲皮素为对照品测定的总黄酮的含量,故此,生物活性的化学成分也不清楚;其中的生物碱主要是脱氧野尻霉素及其他的生物碱。本发明的组合物明显的技术进步在于:将桑白皮、桑枝、桑叶中含有的桑根酮C、桑根酮D、桑皮素,二苯乙烯类化合物桑皮苷、氧化白藜芦醇、白藜芦醇及生物碱脱氧野尻霉素,经过现代的提取手段得到单一化合物,按照一定的比例配比得到全新的复方化学成分的组合物,具有明显的抑制α-葡萄糖苷酶活性。本发明充分利用化学成分的协调作用,具有明显的创新性和有益的效果。
本发明的另一个目的是以桑根酮C、桑根酮D为主要成分组成的全新的组合物,其特征在于:按重量百分比计:桑根酮C占30-70%,桑根酮D占30-70%,桑皮素5-20%,桑皮苷占5-20%,氧化白藜芦醇占2-10%,白藜芦醇占2-10%,脱氧野尻霉素占2-10%,组合物中桑根酮C、桑根酮D的含量不低于60%。实验证明具有很强的抑制α-葡萄糖苷酶活性,无明显毒副作用;性能稳定,可以制成各种不同的剂型。本发明完成前没发现有关桑白皮、桑枝、桑叶中提取的以桑根酮C、桑根酮D、桑皮素、桑皮苷、氧化白藜芦醇、白藜芦醇、脱氧野尻霉素组成的组合物具有抑制α-葡萄糖苷酶药理活性的研究报道。
本发明的药效学试验证明,在桑白皮、桑枝、桑叶中除脱氧野尻霉素等生物碱外,又意外的发现了桑根酮C、桑根酮D具有比脱氧野尻霉素等生物碱更强的α-葡萄糖苷酶抑制的药理活性(在浓度为0.5mg/ml时,桑根酮C抑制率为92.64 %,桑根酮D抑制率为93.89 %,桑皮素抑制率为90.35%,脱氧野尻霉素生物碱抑制率为84.67%),这一结果也是本发明的另一个明显的技术进步、创新性和突出贡献。
组合物中各个成分的制备可以按照以下方法制备得到,也可以是从不同的含有上述成分的植物中提取分离得到,也可以是从一种植物中采用现代提取手段得到的复合比例的组合物。
桑根酮C、桑根酮D、桑皮素的制备方法:桑白皮粉碎成粗粉,先加入药材重量2%氧化钙,再加入6-10倍量40-85%乙醇溶液回流提取2-3次,提取液调节pH为7,回收乙醇至无醇味,加入大孔树脂柱吸附,先用水洗4个柱体积,再用50-85%乙醇溶液洗脱4个柱体积,收集乙醇洗脱液,回收乙醇,浓缩液加酸调pH1-4,放置沉淀;沉淀物滤出用5-10倍量丙酮回流,趁热过滤,加入硅胶柱,丙酮水溶液梯度洗脱,收集有效成分,回收丙酮放置结晶;粗结晶物滤出,以甲醇-水(70-30)为流动相,通过C18常压柱,收集,有效组分,合并,得桑根酮C、桑根酮D及桑皮素。
桑皮苷制备方法:桑白皮粉碎,加6-15倍量30-90%乙醇溶液回流提取1-3次,提取液减压回收乙醇,调节pH4-5放置沉淀,过滤得浓缩液;上述浓缩液加入超滤膜超滤,透过液加入大孔树脂吸附,先用水洗脱,再用40-60%乙醇,收集洗脱液减压浓缩,浓缩液调节pH4-5,加乙酸乙酯萃取,得萃取液;上述萃取液回收试剂,加活性炭干燥,装入活性炭柱,乙醇溶液梯度洗脱,薄层检测,收集目标成分,浓缩低温干燥,即得。
氧化白藜芦醇和白藜芦醇制备方法:取桑白皮原料,用药材粉碎机粉碎成10目粗粉,加水浸泡药材,并加入相当于原药材0.5%的酵母,温度控制在35℃,酶解24小时,酶解完后,加入10倍量浓度为65%的乙醇回流提取三次,每次提取1小时,合并三次提取液,经回收乙醇,浓缩,静置放冷后,过滤,滤液直接上已处理好的D101大孔型树脂柱,先加水洗脱,再加浓度为65%的乙醇洗脱,收集65%乙醇洗脱液,回收乙醇,浓缩干燥,利用ODS常压柱分离,得到氧化白藜芦醇和白藜芦醇。
脱氧野尻霉素的制备方法:桑白皮粉碎,加6-15倍量20-60%乙醇溶液回流提取1-3次,每次2小时,合并提取液,过滤,浓缩,浓缩液,加入大孔树脂吸附,用水洗脱,收集水洗脱液,浓缩,浓缩液上柱到处理好的JK-008阳离子吸附树脂层析柱内,静置吸附2小时,水洗脱至无色后,用3mol/L的二乙胺洗脱,收集碱水洗脱液,直至无色,合并碱水洗脱液,浓缩至干。干燥物用硅胶柱分离,收集相同组分,得到脱氧野尻霉素。
由于本发明首次公开了以桑根酮C、桑根酮D为主要成分的组合物具有抑制α-葡萄糖苷酶的药用作用,因此,将本组合物单独或与其它活性组份或辅料配合制成药剂,只要是该药剂用于预防和治疗高血糖,均属于本发明的保护范围。本发明的组合物在制成任何一种剂型时,均具有预防和治疗高血糖的作用。
由桑根酮C、桑根酮D、桑皮素、桑皮苷、氧化白藜芦醇、白藜芦醇、野尻霉素组成的组合物(简称组合物)具有α-葡萄糖苷酶的抑制作用,通过以下药效学实验得到证实。
本药效学试验用到的桑根酮C、桑根酮D、桑皮素、桑皮苷、氧化白藜芦醇、白藜芦醇、野尻霉素及组合物均为自制,拜糖平购于中国北京拜耳医药保健有限公司,批号为116986。
α-糖苷酶液为自制:取正常大鼠,处死后,立即取出小肠,洗净内容物,按质量体积比1:3加入4℃预冷的0.1mol/L,pH=6.8 PBS,匀浆,4℃、8000 rpm,离心20分钟,取上清液分装入EP管中,-20℃冷冻备用。
1、桑根酮C、桑根酮D、桑皮素、桑皮苷、氧化白藜芦醇、白藜芦醇、脱氧野尻霉素及组成的组合物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用
标准反应体系67mmol/L磷酸钾缓冲液(ph6.8)150μl,1mg/ml谷胱甘肽溶液,50μl,0.1mg/mlα-葡萄糖苷酶溶液100μl,37℃保温10min,20mmol/LPNPG溶液100μl,37℃保温10min,再加底物反应20min,用Na2CO3溶液终止反应测定,400nm处光吸收值。
样品对酶活性的抑制率计算公式:
抑制率(%)=(A对照-A样品)/A对照*100%
拜糖平对α-葡萄糖苷酶活性的影响 取研磨后的拜糖平配制成10mg/ml的原溶液,并以此稀释成10,5,2.5,1,0.5,0.25mg/ml不同浓度。将100μl拜糖平加入到酶反应体系中,先与酶在37℃保温10min,再加底物反应20min,用Na2CO3溶液终止反应,400nm处光吸收值。
各单一成分及组合物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性的影响
各单一成分及组合物用二甲基亚砜溶解,用缓冲液稀释至1.0mg/ml,抑制率高于70%,然后进行复筛。用缓冲液将本发明组合物稀释至浓度为0.5,0.25,0.125,0.0625,0.03125,0.01mg/ml。桑根酮C、桑根酮D、桑皮素、氧化白藜芦醇、桑皮苷、白藜芦醇、脱氧野尻霉素稀释至浓度为0.5,0.25,0.125,0.0625mg/ml。将100μl供试品加入到反应体系中,测定各供试品对α-葡萄糖苷酶的抑制作用。实验结果见表1。
表1、组合物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用
结果表明,改变拜糖平的浓度,拜糖平对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用具有良好的量效关系。本发明组合物在浓度为0.5,0.25,0.125,0.0625,0.03125,0.01mg/ml浓度下,对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用具有良好的量效关系,且抑制作用很强。桑根酮C、桑根酮D、桑皮素也对α-葡萄糖苷酶活性具有很强的抑制作用。氧化白藜芦醇较桑根酮C、桑根酮D、桑皮素弱,脱氧野尻霉素与氧化白藜芦醇差不多。
2、本发明组合物对正常小鼠糖耐量实验
取小鼠90只,每组10只,随机分成9组,按表2分组。阴性对照组灌生理盐水,阳性对照为拜糖平灌胃30mg/kg,按照表2给药连续给药7天,末次给药前禁食8h,给药时同时淀粉(5g/kg)灌胃,测定给淀粉后0.5h,1h,2h,3h的血糖值。眼眶静脉窦采血。用葡萄糖氧化酶试纸法测定血糖值。结果见表2。
表2、本发明组合物对正常小鼠糖耐量实验结果
*与阴性对照组比较,*P﹤0.01;**P﹤0.001
说明本发明组合物能抑制正常小鼠餐后血糖升高,各剂量组具有显著性差异。本发明组合物抑制正常小鼠餐后血糖升高效果与桑根酮C、桑根酮D差别不大。
3、本发明组合物对四氧嘧啶诱导的高血糖小鼠耐糖量实验
取雄性小鼠110只,每组10只,禁食14h后,腹腔注射2%四氧嘧啶(200mg/kg)生理盐水溶液,注射72h后,眼眶静脉窦采血。测定空腹血糖(取血前禁食10h),用葡萄糖氧化酶试纸法测定血糖值。血糖高于11.1mmol/L的为糖尿病模型小鼠。模型按照表3分组,模型对照组灌生理盐水,阳性对照为拜糖平灌胃30mg/kg,按照表3给药连续给药10天,末次给药前禁食6h,给药同时淀粉(5g/kg)灌胃,测定给淀粉后0.5h,1h,2h的血糖值。眼眶静脉窦采血。用葡萄糖氧化酶试纸法测定血糖值。结果见表3。
表3 、本发明组合物对四氧嘧啶诱导的高血糖小鼠耐糖量实验结果
*与模型对照组比较,*P﹤0.05;**P﹤0.001
说明本发明组合物能延缓四氧嘧啶诱导的高血糖小鼠餐后血糖升高。各剂量组均有显著性差异。本发明组合物高剂量组延缓四氧嘧啶诱导的高血糖小鼠餐后血糖升高效果与桑根酮C、桑根酮D差别不大,本发明低剂量组延缓四氧嘧啶诱导的高血糖小鼠餐后血糖升高效果没有桑根酮C、桑根酮D好。
4、本发明组合物对四氧嘧啶诱导的高血糖小鼠血糖值实验
取雄性小鼠110只,每组10只,禁食14h后,腹腔注射2%四氧嘧啶(200mg/kg)生理盐水溶液,注射72h后,眼眶静脉窦采血。测定空腹血糖(取血前禁食10h),用葡萄糖氧化酶试纸法测定血糖值。血糖高于11.1mmol/L的为糖尿病模型小鼠。模型按照表4分组,模型对照组灌生理盐水,阳性对照为拜糖平灌胃30mg/kg,按照表4给药连续给药10天,末次给药前禁食10h,眼眶静脉窦采血,离心取血清。用葡萄糖氧化酶试纸法测定血糖值。结果见表4。
表4 、本发明组合物对四氧嘧啶诱导的高血糖小鼠血糖值实验结果
*与模型对照组比较,*P﹤0.05;**P﹤0.001
说明本发明组合物高、低剂量组均能显著降低四氧嘧啶诱导的高血糖小鼠血糖水平。本发明组合物高剂量组与桑皮苷、氧化白藜芦醇、白藜芦醇相比均具有更强的活性,桑根酮C、桑根酮D、桑皮素、脱氧野尻霉素的活性与本发明组合物相差不大。
本发明是通过下面的实施例进行详细的说明,但不意味着本发明仅限于此,具体实施方案如下:
实施例1、各单一化合物的提取制备
桑根酮C、桑根酮D、桑皮素的制备方法:桑白皮10kg粉碎成粗粉,先加入氧化钙2000g,再加入8倍量70%乙醇溶液回流提取3次,每次2小时,提取液调节pH为7,回收乙醇至无醇味,加入AB-8大孔树脂柱吸附,先用水洗4个柱体积,再用70%乙醇溶液洗脱4个柱体积,收集乙醇洗脱液,回收乙醇,浓缩液加酸调pH=2,放置沉淀;沉淀物滤出用8倍量丙酮回流,趁热过滤,加入硅胶柱,丙酮水溶液梯度洗脱,收集有效成分,回收丙酮放置结晶;粗结晶物滤出,以甲醇-水(70-30)为流动相,通过C18常压柱,收集,有效组分,合并,得桑根酮C、桑根酮D及桑皮素。
桑皮苷制备方法:桑白皮10kg粉碎成粗粉,加10倍量60%乙醇溶液回流提取3次,每次2小时,提取液过滤,减压回收乙醇,调节pH为4,放置沉淀,过滤得浓缩液;上述浓缩液加入超滤膜超滤,透过液加入D101大孔树脂吸附,先用水洗脱,再用50%乙醇,收集洗脱液减压浓缩,浓缩液调节pH为4,加乙酸乙酯萃取,得萃取液;上述萃取液回收试剂,加活性炭干燥,装入活性炭柱,乙醇溶液梯度洗脱,薄层检测,收集目标成分,浓缩低温干燥,即得。
氧化白藜芦醇和白藜芦醇制备方法:取桑白皮10kg,用药材粉碎机粉碎成10目粗粉,加水浸泡药材,并加入相当于原药材0.5%的酵母,温度控制在35℃,酶解24小时,酶解完后,加入10倍量浓度为65%的乙醇回流提取三次,每次提取1小时,合并三次提取液,经回收乙醇,浓缩,静置放冷后,过滤,滤液直接上已处理好的D101大孔型树脂柱,先加水洗脱,再加浓度为65%的乙醇洗脱,收集65%乙醇洗脱液,回收乙醇,浓缩干燥,利用ODS常压柱分离,得到氧化白藜芦醇和白藜芦醇。
脱氧野尻霉素的制备方法:桑白皮10kg,粉碎成粗粉,加6-15倍量20-60%乙醇溶液回流提取1-3次,每次2小时,合并提取液,过滤,浓缩,浓缩液加入大孔树脂吸附,用水洗脱5个柱体积,收集水洗脱液,浓缩,浓缩液上柱到处理好的JK-008阳离子吸附树脂层析柱内,静置吸附2小时,水洗脱至无色后,用3mol/L的二乙胺洗脱,收集碱水洗脱液,直至无色,合并碱水洗脱液,浓缩至干。干燥物用硅胶柱分离,收集相同组分,得到脱氧野尻霉素。
实施例2、组合物的制备
取桑根酮C 4g,桑根酮D 3.5g,桑皮素1g,桑皮苷0.5g,氧化白藜芦醇占0.3g,白藜芦醇0.2g,脱氧野尻霉素0.5g,混合均匀得到本发明组合物。
Claims (6)
1.从桑属植物中提取的桑根酮C、桑根酮D在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂药物或保健食品中的应用。
2.根据权利要求1所述的桑根酮C、桑根酮D为主要成分的组合物在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂药物或保健食品中的应用。
3.根据权利要求2所述以桑根酮C、桑根酮D为主要成分的组合物在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂的药物或保健品中的用途,其特征在于:组合物含有桑根酮C、桑根酮D、桑皮素、桑皮苷、氧化白藜芦醇、白藜芦醇、脱氧野尻霉素。
4.根据权利要求3所述的药物组合物,其特征在于:按重量百分比计:桑根酮C占30-70%,桑根酮D占30-70%,桑皮素5-20%,桑皮苷占5-20%,氧化白藜芦醇占2-10%,白藜芦醇占2-10%,脱氧野尻霉素占2-10%,组合物中桑根酮C、桑根酮D的含量不低于60%。
5.根据权利要求3所述的用途其特征在于:在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂的药物中的应用是指含有效治疗剂量的桑根酮C、桑根酮D、桑皮素、桑皮苷、氧化白藜芦醇、白藜芦醇、脱氧野尻霉素组成的组合物与一种或多种药学上可接受的药用赋形剂。
6.根据权利要求5所述药物制剂其特征在于:所说的口服制剂选自于片剂、胶囊剂、软胶囊剂、颗粒剂、丸剂、混悬剂、滴丸、口服液体制剂当中的任何一种。
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