CN104597168B - 桑枝精制饮片含量测定方法 - Google Patents
桑枝精制饮片含量测定方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种桑枝精制饮片含量测定方法，采用高效液相色谱法测定桑枝精制饮片中桑皮苷A及氧化白藜芦醇的含量。通过对色谱条件和供试品的制备方法进行优选，精密测定桑枝精制饮片内在质量指标，为临床用药提供指导，为制订桑枝桑皮苷A、氧化白藜芦醇的含量标准提供依据。该测定方法准确、简便、重复性好；优化流动相系统，使主要指标成分得到很好的分离效果，柱效高；能够通过具体指标控制桑枝有效成分的含量及桑枝精制饮片的质量。
Description
技术领域
本发明涉及药物的检测方法，具体是桑枝精制饮片含量的测定方法。
背景技术
桑枝是桑树的树叶、枝条、嫩枝条的总称，桑枝精制饮片是选用优质、道地药材，通过精心加工炮制，选择方便临床用药的几种规格包装得到的饮片。主要作用为祛风通络、行气消肿、降低血压，主治关节风湿痹痛、水气脚气、紫癜风等症。桑枝收载于《中国药典》（2010年版）一部，对性状、显微鉴别、浸出物检查等做出了规定，其中没有含量测定这项定量指标。没有定量质控指标，就不能对桑枝精制饮片内在质量进行监控，也不能反映出桑枝精制饮片质量的优劣。
发明内容
本发明的目的在于提供一种桑枝精制饮片含量测定方法，它能定量的反映桑枝内在质量，为临床用药提供指导。
为了达到上述目的，本发明的技术解决方案是采用高效液相法对桑枝精制饮片进行含量测定，对色谱条件和供试品的制备方法进行优选，所述对桑枝精制饮片进行含量测定就是指测定其中桑皮苷A及氧化白藜芦醇的含量，操作方法如下：
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.2%磷酸溶液为流动相A，以乙腈-0.2%磷酸溶液为流动相B，按下表进行梯度洗脱；流动相B比例为75～85∶15～25，检测波长为325～335nm；柱温为25℃～35℃，理论板数按桑皮苷A峰计算应不低于4000。
表1 流动相梯度
对照品溶液的制备 取桑皮苷A对照品、氧化白藜芦醇对照品适量，精密称定，加60%甲醇溶液制成每1mL分别含桑皮苷A 45～55μg、氧化白藜芦醇20～30μg的混合溶液，即得。
供试品溶液的制备 取本品粉末0.4～0.6g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60%甲醇40～60mL，密塞，称定重量，加热回流处理30～50min，放冷，用60%甲醇补足减失重量，摇匀，用微孔滤膜(0.45µm)滤过，取续滤液，作供试品溶液。
测定法 分别精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
一种优选技术方案，所述色谱条件与系统适用性试验中，流动相B比例为75～83∶17～25，检测波长为325～333nm。
一种优选技术方案，所述色谱条件与系统适用性试验中，流动相B比例为78～85∶15～22，检测波长为327～335nm。
一种优选技术方案，所述对照品溶液的制备中，加60%甲醇溶液制成每1mL分别含桑皮苷A 45～50μg、氧化白藜芦醇20～25 μg。
一种优选技术方案，所述对照品溶液的制备中，加60%甲醇溶液制成每1mL分别含桑皮苷A 48～53μg、氧化白藜芦醇23～28 μg。
一种优选技术方案，所述供试品溶液的制备中，取本品粉末0.45～0.55g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60%甲醇45～55mL，密塞，称定重量，加热回流处理30～40min。
一种优选技术方案，所述供试品溶液的制备中，取本品粉末0.48～0.58g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60%甲醇48～58mL，密塞，称定重量，加热回流处理35～50min。
一种优选技术方案，所述色谱条件与系统适用性试验中，流动相B比例为80∶20，检测波长为330nm；所述对照品溶液的制备中，取桑皮苷A对照品、氧化白藜芦醇对照品适量，精密称定，加60%甲醇溶液制成每1mL分别含桑皮苷A 48μg、氧化白藜芦醇25μg；所述供试品溶液的制备中，取本品粉末0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60%甲醇50mL，密塞，称定重量，加热回流处理40min。
上述方案中技术参数的确定，经过了一系列的实验，下面详细说明实验过程。
、仪器与试药
（1）仪器：LC—10A高效液相色谱仪（日本岛津公司）；SPD-10A紫外检测器（日本岛津公司），KQ2200B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，AE240分析天平(METTLER)。
（2）试药：桑枝精制饮片（自制）；桑皮苷A对照品（供含量测定；批号：102841-42-9）氧化白藜芦醇对照品（供含量测定；批号：29700-22-9）均由北京北研馨绿生物技术有限公司提供；甲醇、乙腈均为色谱纯；其他试剂均为分析纯。
、色谱条件
色谱柱：依利特 C18（200mm×4.6mm ， 5um）柱号：E2323258
流动相：
检测波长：330nm
流速：1.0ml/min。
、供试品溶液的制备
（1）提取方法的选择：取本品粉末（过四号筛），取两份，每份取约0.6g，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇50mL，密塞，称定重量，第1份样品超声处理40min，第2份样品加热回流提取40min，放冷，再称定重量，如有减失，分别用甲醇补足减失重量，摇匀，取上清液，用微孔滤膜(0.45μm)过滤，取续滤液，分别作为供试品溶液。精密吸取上述二种溶液及混合对照品溶液各10μL，分别注入液相色谱仪，照上述色谱条件测定桑皮苷A及氧化白藜芦醇的峰面积，计算平均含量，结果见表2。
表2 提取方法的选择
结果：用上述二种方法处理样品，超声样品含量比回流样品含量低，故本品选用回流处理方法。
（2）提取溶剂的选择：取本品粉末（过四号筛），取四份，每份取约0.6g，精密称定，置具塞锥形瓶中，依次精密加入甲醇、70%甲醇、60%甲醇和50%甲醇50mL，密塞，称定重量，加热回流处理40min，放冷，再称定重量，如有减失，分别用对应浓度的甲醇补足减失重量，摇匀，取上清液，用微孔滤膜(0.45µm)滤过，取续滤液，分别作为供试品溶液。精密吸取上述四种溶液及混合对照品溶液各10μL，分别注入液相色谱仪，照上述色谱条件测定桑皮苷A及氧化白藜芦醇的峰面积，计算平均含量，结果见表3。
表3 提取溶剂的选择
结果：60%甲醇加热回流比甲醇、70%甲醇、50%甲醇加热回流含量高，故选择60%甲醇做提取溶剂。
（3）溶剂用量的选择：取本品粉末（过四号筛），取三份，每份取约0.6g，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，依次精密加入70%甲醇40mL、50mL、60mL，密塞，称定重量，加热回流处理40min，放冷，再称定重量，如有减失，用70%甲醇补足减失重量，摇匀，用微孔滤膜(0.45µm)滤过，取续滤液，分别作为供试品溶液。精密吸取上述三种溶液及混合对照品溶液各10μL，分别注入液相色谱仪，照上述色谱条件测定桑皮苷A及氧化白藜芦醇的峰面积，计算平均含量，结果见表4。
表4 提取溶剂用量的选择
结果：本品用50mL和60mL 加热回流提取含量相差较小，从经济角度考虑，故选用50mL做溶剂用量为宜。
（4）回流时间的选择：取本品粉末（过四号筛），取约0.5g，精密称定三份，置具塞锥形瓶中，精密加入60%甲醇50mL，密塞，称定重量，分别加热回流处理30min、40min、50min，放冷，再称定重量，如有减失，用60%甲醇补足减失重量，摇匀，取上清液，用微孔滤膜(0.45µm)滤过，取续滤液，分别作为供试品溶液。精密吸取上述三种溶液及混合对照品溶液各10μL，分别注入液相色谱仪，照上述色谱条件测定桑皮苷A及氧化白藜芦醇的峰面积，计算平均含量，结果见表5。
表5 不同回流时间比较表
结果：加热回流处理30min时，样品中桑皮苷A及氧化白藜芦醇含量较低，而加热回流处理40min与50min时，样品中的氧化白藜芦醇含量相近，但加热回流40min的桑皮苷A的含量较回流50min含量高，故本品加热回流处理时间确定为40min。
（5）供试品溶液的制备：取本品粉末（过四号筛），取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60%甲醇50mL，密塞，称定重量，加热回流处理40min，放冷，用60%甲醇补足减失重量，摇匀，用微孔滤膜(0.45µm)滤过，取续滤液，作供试品溶液。
、对照品溶液的制备
分别精密称取桑皮苷A对照品4.8mg氧化白藜芦醇对照品5.0mg，分别置10mL容量瓶中，加60%甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀；分别精密量取桑皮苷A对照品1mL，氧化白藜芦醇对照品0.5mL，置10mL棕色量瓶中，加60%甲醇至刻度，摇匀，即得（每1mL溶液中含桑皮苷A48μg，氧化白藜芦醇25μg）。
、测定法
分别精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
、线性关系考察
取桑皮苷A对照品溶液（480μg•mL-1）0.5mL于10mL容量瓶中，用60%甲醇稀释至刻度即得桑皮苷A的对照品溶液。精密吸取上述桑皮苷A对照品溶液2μL、4μL、6μL、8μL、10μL、12μL，分别注入液相色谱仪中，测定其峰面积积分值，以桑皮苷A含量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程，其回归方程为：Y＝2368.4x+24712，R＝0.9995。结果表明桑皮苷A在48～288μg范围内具有良好的线性关系。结果见表6、图1。
表6 桑皮苷A线性关系考察结果表
取氧化白藜芦醇对照品溶液（550μg•mL-1）0.5mL于10mL容量瓶中，用60%甲醇稀释至刻度即得氧化白藜芦醇的对照品溶液。精密吸取上述氧化白藜芦醇对照品溶液2μL、4μL、6μL、8μL、10μL、12μL，分别注入液相色谱仪中，测定其峰面积积分值，以氧化白藜芦醇含量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程，其回归方程为：Y＝6945.5x+39070，R＝0.9998。结果表明氧化白藜芦醇在55～330μg范围内具有良好的线性关系。结果见表7、图2。
表7 氧化白藜芦醇线性关系考察结果表
8、精密度试验
分别取桑皮苷A对照品3.8mg、氧化白藜芦醇对照品4.0mg，分别置10mL容量瓶中，加60%甲醇，溶解，并稀释至刻度，即得。分别取桑皮苷A对照品、氧化白藜芦醇对照品各0.5mL，置10mL容量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，取桑皮苷A对照品溶液（19μg/mL),氧化白藜芦醇对照品（20μg/mL）即得。精密吸取上述对照品溶液10μL，重复进样6次，测定其峰面积积分值。结果见表8。
表8 精密度试验(n=6)
结果：桑皮苷A对照品RSD=1.97%，氧化白藜芦醇对照品RSD=1.96%，表明本方法精密度良好。
、稳定性试验
取本品粉末（过四号筛），取约0.5g，照上述方法制备供试品溶液，分别于0、1、2、4、6小时进样10μL，测定其峰面积，结果见表9。
表9 稳定性试验(n=5)
结果：桑皮苷A对照品RSD=1.36%，氧化白藜芦醇对照品RSD=1.69%，供试品溶液在6小时内基本稳定。
、重复性试验
取本品粉末（过四号筛）共6份，每份取约0.5g，照上述方法平行制备供试品溶液，测定样品含量，结果见表10。
表10 重复性试验(n=6)
结果：桑皮苷A对照品RSD=1.35%，氧化白藜芦醇对照品RSD=0.88%，本方法重复性好。
、加样回收率试验
取已知桑皮苷A含量为3.54mg/g，氧化白藜芦醇含量为1.34mg/g样品约0.25g，共6份，精密称定，分别精密加入桑皮苷A对照品溶液（410μg/mL)2mL，即0.8200mg；氧化白藜芦醇对照品溶液（450μg/mL)1mL,即0.4500mg。再精密加入60%甲醇50mL，以下操作按前述含量测定项下的方法进行，按下式计算加样回收率，结果见表11。
计算公式：
表11 桑皮苷A回收率测定结果表
表12 氧化白藜芦醇回收率测定结果表
结果：桑皮苷A 平均回收率=99.57% RSD=1.97%，氧化白藜芦醇平均回收率=100.98% RSD=1.94%,本方法回收率好。
、样品测定
取不同批号的样品，分别按前述供试品溶液制备方法及色谱条件，测定，计算样品中绿原酸的含量，结果见表13。
表13 含量测定结果 (n=2)
本发明的优点：
1、制订桑枝桑皮苷A、氧化白藜芦醇的含量测定指标及参照标准。
2、采用高效液相色谱测定桑枝桑皮苷A、氧化白藜芦醇两种指标成分，方法准确、简便、重复性好。
3、优化流动相系统，使主要指标成分得到很好的分离效果，柱效高。
4、能够通过具体指标控制桑枝有效成分的含量及桑枝精制饮片的质量。
附图说明
图1是对照品HPLC色谱图。
图2是桑枝精制饮片HPLC色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
采用高效液相色谱法测定桑枝精制饮片中桑皮苷A及氧化白藜芦醇的含量。操作方法如下：
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.2%磷酸溶液为流动相A，以乙腈-0.2%磷酸溶液为流动相B，按下表进行梯度洗脱；流动相B比例为75～83∶17～25，检测波长为325～333nm；柱温为30℃，理论板数按桑皮苷A峰计算应不低于4000。
表14 流动相梯度
对照品溶液的制备 取桑皮苷A对照品、氧化白藜芦醇对照品适量，精密称定，加60%甲醇溶液制成每1 mL分别含桑皮苷A 45～50μg、氧化白藜芦醇20～25μg的混合溶液，即得。
供试品溶液的制备 取本品粉末（过四号筛），取约0.45～0.55g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60%甲醇45～55mL，密塞，称定重量，加热回流处理30～40min，放冷，用60%甲醇补足减失重量，摇匀，用微孔滤膜(0.45µm)滤过，取续滤液，作供试品溶液。
测定法 分别精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液各10µL，注入液相色谱仪，测定，即得。
实施例2
采用高效液相色谱法测定桑枝精制饮片中桑皮苷A及氧化白藜芦醇的含量。操作方法如下：
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.2%磷酸溶液为流动相A，以乙腈-0.2%磷酸溶液为流动相B，按下表进行梯度洗脱；流动相B比例为78～85∶15～22，检测波长为327～335nm；柱温为30℃，理论板数按桑皮苷A峰计算应不低于4000。
表15 流动相梯度
对照品溶液的制备 取桑皮苷A对照品、氧化白藜芦醇对照品适量，精密称定，加60%甲醇溶液制成每1mL分别含桑皮苷A 48～53μg、氧化白藜芦醇23～28μg的混合溶液，即得。
供试品溶液的制备 取本品粉末（过四号筛），取约0.45～0.55g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60%甲醇48～58mL，密塞，称定重量，加热回流处理35～50min，放冷，用60%甲醇补足减失重量，摇匀，用微孔滤膜(0.45µm)滤过，取续滤液，作供试品溶液。
测定法 分别精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液各10µL，注入液相色谱仪，测定，即得。
实施例3
采用高效液相色谱法测定桑枝精制饮片中桑皮苷A及氧化白藜芦醇的含量。操作方法如下：
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.2%磷酸溶液为流动相A，以乙腈-0.2%磷酸溶液为流动相B，按下表进行梯度洗脱；流动相B比例为80∶20，检测波长为330nm；柱温为30℃，理论板数按桑皮苷A峰计算应不低于4000。
表16 流动相梯度
对照品溶液的制备 取桑皮苷A对照品、氧化白藜芦醇对照品适量，精密称定，加60%甲醇溶液制成每1mL分别含桑皮苷A 48μg、氧化白藜芦醇25μg的混合溶液，即得。
供试品溶液的制备 取本品粉末（过四号筛），取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60%甲醇50mL，密塞，称定重量，加热回流处理40min，放冷，用60%甲醇补足减失重量，摇匀，用微孔滤膜(0.45µm)滤过，取续滤液，作供试品溶液。
测定法 分别精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液各10µL，注入液相色谱仪，测定，即得。
Claims (8)
1.一种桑枝精制饮片含量测定方法，其特征在于：采用高效液相色谱法测定桑枝精制饮片中桑皮苷A及氧化白藜芦醇的含量，操作方法如下：
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.2％磷酸溶液为流动相A，以乙腈-0.2％磷酸溶液为流动相B，按下表进行梯度洗脱；流动相B中0.2％磷酸溶液和乙腈的比例为75～85∶15～25，检测波长为325～335nm；柱温为25℃～35℃，理论板数按桑皮苷A峰计算应不低于4000；
表1流动相梯度
对照品溶液的制备取桑皮苷A对照品、氧化白藜芦醇对照品适量，精密称定，加60％甲醇溶液制成每1mL分别含桑皮苷A 45～55μg、氧化白藜芦醇20～30μg的混合溶液，即得；
供试品溶液的制备取本品粉末0.4～0.6g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60％甲醇40～60mL，密塞，称定重量，加热回流处理30～50min，放冷，用60％甲醇补足减失重量，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，作供试品溶液；
测定法分别精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
2.根据权利要求1所述的桑枝精制饮片含量测定方法，其特征在于：所述色谱条件与系统适用性试验中，流动相B比例为75～83∶17～25，检测波长为325～333nm。
3.根据权利要求1所述的桑枝精制饮片含量测定方法，其特征在于：所述色谱条件与系统适用性试验中，流动相B比例为78～85∶15～22，检测波长为327～335nm。
4.根据权利要求1、2或3所述的桑枝精制饮片含量测定方法，其特征在于：所述对照品溶液的制备中，加60％甲醇溶液制成每1mL分别含桑皮苷A 45～50μg、氧化白藜芦醇20～25μg的混合溶液。
5.根据权利要求1、2或3所述的桑枝精制饮片含量测定方法，其特征在于：所述对照品溶液的制备中，加60％甲醇溶液制成每1mL分别含桑皮苷A 48～53μg、氧化白藜芦醇23～28μg的混合溶液。
6.根据权利要求1、2或3所述的桑枝精制饮片含量测定方法，其特征在于：所述供试品溶液的制备中，取本品粉末0.45～0.55g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60％甲醇45～55mL，密塞，称定重量，加热回流处理30～40min。
7.根据权利要求1、2或3所述的桑枝精制饮片含量测定方法，其特征在于：所述供试品溶液的制备中，取本品粉末0.48～0.58g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60％甲醇48～58mL，密塞，称定重量，加热回流处理35～50min。
8.根据权利要求1所述的桑枝精制饮片含量测定方法，其特征在于：所述色谱条件与系统适用性试验中，流动相B比例为80∶20，检测波长为330nm；所述对照品溶液的制备中，取桑皮苷A对照品、氧化白藜芦醇对照品适量，精密称定，加60％甲醇溶液制成每1mL分别含桑皮苷A 48μg、氧化白藜芦醇25μg；所述供试品溶液的制备中，取本品粉末0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60％甲醇50mL，密塞，称定重量，加热回流处理40min。
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