CN108593794B - 一种多指标成分uplc检测红花中有效成分含量方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种多指标成分UPLC检测红花中有效成分含量方法，该检测方法测定红花药材中6‑羟基山奈酚‑3，6，7‑三‑O‑葡萄糖苷、羟基红花黄色素A和脱水红花黄色素B活性成分的含量，其具有操作简便、准确、高效的优点，该检测方法可以应用于红花药材的内在质量控制方法。

Description

一种多指标成分UPLC检测红花中有效成分含量方法

技术领域

本发明技术涉及药物检测领域，具体涉及一种多指标成分UPLC检测红花中有效成分含量方法。

背景技术

红花又名红蓝花，刺红花，为菊科红花属植物的干燥管状花。红花是我国传统药材，始载于《开宝本草》。《本草纲目》称红花能“活血、润燥、止痛、散肿通经。中医上认为红花味辛、微苦、性温、归心和肝经，具活血通经、散瘀止痛、讲血压、降血脂的功效，用于经闭、痛经、跌打损伤、冠心病、心绞痛和高血压等疾病。红花在现代临床中成为预防和治疗冠心病、心肌梗死和脑血栓等疾病的重要中药。现代药理实验表明：红花能改善心脑血氧供应、减轻缺血性损伤、抗凝血、抗心肌缺血、抑制血小板聚集、抗氧化、抗肿瘤和抗炎等药理作用。红花化学成分复杂，迄今，从红花中分离鉴定100多种化合物，主要含有查尔酮类色素、黄酮类、酚酸类、甾体类及多糖类等化合物。采用2015版《中国药典》“红花”项下有效成分检测指标和药典之外的2个活性成分为标准，旨在为评价红花的质量提供科学依据。质控指标应选择药材中药理作用比较明确的有效成分或与药材临床功效具有相关性的指标性成分，预试验在质控指标中选择的待测成分，有时可能只是文献数据，能否作为多指标质控指标，需进行实际验证。因此，在确定了多成分同时测定的色谱条件后，应对收集的样品进行初步分析，重点关注分析条件和各待测成分峰面积范围等信息。待测成分含量应有相对较高的含量，原则上应≥1mg·g^-1。

由于红花其在众多的中药组方中都有较频繁的应用，因此，如何有效地评价红花中药材内在质量是许多药厂研究热点，对于传统的中药材多成分、多进行中药材质量的评价，多成分多指标的控制方式应运而生，而这种质量控制方式却存在它的弊端，其高昂的检测费用和繁琐检测操作难以应用于工业化大生产中。本研究拟订通过一测多评的方法对红花中多种有效成分进行含量测定，以建立科学合理的内在质量评价方法。

发明内容

本发明目的在于提供一种多指标成分UPLC检测红花中有效成分含量方法，该检测方法红花药材中3个活性成分含量的方法，该检测方法具有快速，简便，准确的优点。弥补现有药材质量控制技术不够完善和科学的不足，更好的控制红花提取物的质量。

本发明的技术方案为：一种多指标成分定量测定红花中3个活性成分含量的方法：该方法使用的对照品包括：6-羟基山奈酚-3，6，7-三-O-葡萄糖苷、羟基红花黄色素A和脱水红花黄色素B。

为了实现上述发明的目的，本发明专利申请的技术方案为：

一种UPLC多指标成分测定红花中的活性成分含量方法，包括如下步骤：

⑴、红花供试品溶液的制备：精密称取红花药材粗粉，精密加水溶解重量，超声处理30～50min，过滤，得供试品滤液；

⑵、对照品溶液的制备：精密称取对照品6-羟基山奈酚-3,6,7-三-O-葡萄糖苷，羟基红花黄色素，脱水红花黄色素B适量，加甲醇溶解，配制为混合对照品溶液；

⑶、色谱条件：以亚乙基桥杂化颗粒为填充剂，以乙腈为流动相A相，以0.5％甲酸为流动相B相；其体积配比为流动相A相：流动相B相为：2-20：98-80，进行线性梯度洗脱，流速每分钟为0.08～0.12mL，检测波长270～280nm，柱温25～35℃；

⑷、色谱峰测定：将上述步骤(⑴所制得的红花供试品溶液注入高效液相色谱仪，得到红花有效成分的色谱图，即得。

优选的，所述步骤⑴红花供试品溶液制备方法中，精密称取红花药材粗粉，精密加水50mL，超声处理40min，过滤，取滤液，经0.22μm滤膜过滤。

作为本发明色谱条件的进一步优选，所述流动相A相为乙腈，流动相B为0.5％甲酸，其流动相所采用的线性梯度洗脱条件为：

流速每分钟为0.1mL，检测波长为275nm，柱温30℃。

优选的，步骤⑶色谱条件中，所述检测波长275nm；柱温35℃，进样量5μL。

优选的，步骤⑶色谱条件中色谱柱的型号为BEH C18 4.6mm×100mm，1.7μm。

本发明多指标成分UPLC红花含量检测方法的色谱条件优化

①、流动相的选择

本发明通过大量的实验筛选了不同的流动相体系，采用以下流动相体系进行测定：甲醇-水、乙腈-水、乙腈-甲酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液、乙腈-乙酸水溶液、乙腈-0.1％甲酸水溶液、乙腈-0.3％甲酸水溶液和乙腈-0.5％甲酸水溶液。筛选实验结果表明，选用乙腈-0.5％甲酸水流动相系统，得到的分析图谱分离度好、峰形佳。

②、柱温的选择

本发明分别在25℃、30℃、35℃、40℃时柱温下进行分析，实验结果表明，在30℃柱子温条件下，色谱峰分离度最好，因此，将30℃最为最佳的柱温条件。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

⑴、本发明建立一种高效UPLC多指标成分测定红花中有效活性成分的方法，该检测方法具有梯度洗脱程序简单、方便，结合UPLC独特的性能，半小时(约26分钟)内完成了所需的分析任务，大大提高了分析效率，减少了流动相的消耗。

⑵、本发明红花提取物药材建立科学、全面多指标质量评价控制方法。该方法结合高效液相色谱指纹图谱分析方法，采用一测多评法及测定红花提取物中3种有效成分的含量，6-羟基山奈酚-3，6，7-三-O-葡萄糖苷、羟基红花黄色素A和脱水红花黄色素B，且上述3种指标性成分吸收值较大、峰形较好、分离度好、检测时间短。可以全面表征红花提取物内在质量，保证其质量的稳定性、均一性、可控性。本发明建立UPLC多指标成分检测方法，精密度实验结果表明，上述3个检测指标成分RSD≤0.9％，重复性实验(RSD≤5.0％)、回收率实验结果良好(96.47％～100.34％)，可操作性强等优点。

综上所述，本发明所述的一种多指标成分UPLC红花中有效成分含量检测方法，具有操作简便、准确、高效的优点，该检测方法可以应用于红花药材的内在质量控制方法，具有广阔的市场应用前景。

附图说明

图1-A红花水提液样品色谱图；B-混合对照品色谱图，色谱峰1为：6-羟基山奈酚-3,6,7-三-O-葡萄糖苷；色谱峰2-羟基红花黄色素A；色谱峰3为：脱水红花黄色素B；C-空白溶剂色谱图。

图2–为红花药材线性堆叠色谱图(从左至右峰名依次为：6-羟基山奈酚-3,6,7-三-O-葡萄糖苷、羟基红花黄色素A和脱水红花黄色素B)。

具体实施方式

为了更加充分理解本发明的实施，下面通过典型的实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1

1.1实验仪器

Waters Acquity H-Class超高效液相色谱仪；电子分析天平；超声波清洗器；Millipore超纯水。

1.2试剂与药品

红花药材粉碎成30-40目粗粉备用，6-羟基山奈酚-3,6,7-三-O-葡萄糖苷对照品、羟基红花黄色素A对照品、脱水红花黄色素B对照品。甲醇(色谱纯)，乙腈(色谱纯，超纯水，其余试剂均为分析纯。

1.3实验步骤与结果

1.4色谱条件为：

色谱柱为：BEH C18(4.6mm×100mm，1.7μm)色谱柱；以亚乙基桥杂化颗粒为填充

剂；以流动相A：乙腈、流动相B：0.5％甲酸，按照下表进行梯度洗脱：

平衡时间5分钟；流速每分钟为0.1mL；检测波长为275nm；柱温30℃。

1.5一种UPLC红花中有效成分含量检测方法

(1)供试品溶液的制备

精密称取红花样品0.5134g，置具塞三角瓶中,精密加水50mL，超声处理40min，过滤，取滤液，0.22μm滤膜过滤。

(2)对照品溶液的制备

精密称取各对照品适量，加25％甲醇溶液制成每1mL分别含6-羟基山奈酚-3,6,7-三-O-葡萄糖苷1.02mg、羟基红花黄色素A 5.245mg、脱水红花黄色素B 0.312mg的溶液作为对照品储备溶液。再分别精密移取6-羟基山奈酚-3，6，7-三-O-葡萄糖苷15μL、羟基红花黄色素A 57μL和脱水红花黄色素B 220μL的对照品储备溶液置2mL进样小瓶中，加25％甲醇908μL定容至1.2mL。

(3)测定方法

分别精密吸取红花水提液与对照品溶液各10μL，注入超高效液相色谱仪检测。

1.6线性关系考察

将6份不同浓度的3个成分混合对照品溶液，分别进样10μL，以3个成分的质量浓度为横坐标(X)，以峰面积为纵坐标(Y)，计算回归方程及线性范围。具体色谱图结果见图2和表1。

表1 3个成分的线性关系和线性范围

1.6精密度试验

精密吸取红花样品溶液和混合对照品溶液各10μL，按2.1项下色谱条件分别连续进样6次。测得样品溶液中6-羟基山奈酚-3,6,7-三-O-葡萄糖苷、羟基红花黄色素A和脱水红花黄色素B三个成分的峰面积RSD分别为0.5％，0.5％和0.9％，测得标准品溶液中三个成分的峰面积RSD分别为0.7％，0.8％和0.6％。结果表明该仪器的精密度良好，实验结果见表2。

表2精密度试验结果

1.7重复性实验

取同一批次样品6份，依照供试品溶液的制备方法制备样品，按2.1项下色谱条件测定6-羟基山奈酚-3,6,7-三-O-葡萄糖苷、羟基红花黄色素A和脱水红花黄色素B的含量。三个指标含量RSD结果分别为0.3％，0.9％和5.0％，表明该方法的重复性良好，实验结果具体见下表3。

表3重复性试验结果

1.8加样回收率试验

精密称取已知含量的红花样品6份，精密加入6-羟基山奈酚-3,6,7-三-O-葡萄糖苷0.1806mg、羟基红花黄色素A 2.4681mg和脱水红花黄色素B 1.2232mg，置具塞三角瓶中，加水50mL，超声处理40min，过滤，取滤液，0.22μm滤膜过滤。按2.1项下色谱条件进样10μL进行测定，计算回收率，实验结果具体见下表4。

表4加样回收试验结果(n＝6)

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (4)

1.一种多指标成分UPLC检测红花中有效成分的含量检测方法，其特征在于，所述含量检测方法包括如下步骤：

⑴、红花供试品溶液的制备：精密称取红花药材粗粉，加水溶解重量，超声处理30～50min，过滤，得供试品滤液；

⑵、对照品溶液的制备：精密称取对照品6-羟基山奈酚-3,6,7-三-O-葡萄糖苷，羟基红花黄色素，脱水红花黄色素B适量，加甲醇溶解，配制为混合对照品溶液；

⑶、色谱条件：所述色谱柱的型号为BEH C₁₈ 4.6mm×100mm，1.7μm，以亚乙基桥杂化颗粒为填充剂，以乙腈为流动相A相，以0.5％甲酸为流动相B相；其流动相所采用的线性梯度洗脱条件为：

流速每分钟为0.08～0.12mL，检测波长270～280nm，柱温25～35℃；

⑷、色谱峰测定：将上述步骤⑴所制得的红花供试品溶液注入高效液相色谱仪，得到红花有效成分的色谱图，即得。

2.根据权利要求1所述含量检测方法，其特征在于，所述步骤⑴红花供试品溶液制备方法中，精密称取红花药材粗粉，精密加水50mL，超声处理40min，过滤，取滤液，经0.22μm滤膜过滤。

3.根据权利要求1所述含量检测方法，其特征在于，所述步骤⑶的色谱条件中，流速每分钟为0.1mL，检测波长为275nm，柱温30℃。

4.根据权利要求1所述含量检测方法，其特征在于，所述步骤⑶的色谱条件中，所述检测波长275nm；柱温35℃，进样量5μL。

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