CN108398493B - 一种积雪草药材及其提取物与制剂的质量检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种中药材及其制剂的质量检测方法，具体地说，涉及一种积雪草药材及其提取物与制剂的质量检测方法。本发明的方法采用高效液相色谱分离，通过一测多评技术，以积雪草苷为内标物，建立其与羟基积雪草苷、积雪草苷‑B的相对校正因子，并计算羟基积雪草苷和积雪草苷‑B含量的方法。该方法检测灵敏度高，稳定性好，可以客观、全面、准确地评价积雪草药材及其提取物与制剂的质量，可解决因对照品缺乏而无法客观合理地控制药材及其制剂质量的问题，对控制质量和保证疗效具有重要意义。

Description

一种积雪草药材及其提取物与制剂的质量检测方法
技术领域
本发明涉及一种中药材及其制剂的质量检测方法，具体地说，涉及一种积雪草药材及其提取物与制剂的质量检测方法。
背景技术
积雪草为伞形科Centella asiatica(L.)Urb.的干燥全草，具有消炎、增强记忆力、促进胶原蛋白合成和抗癌等多种生理活性，目前认为，三萜皂苷类物质是积雪草的活性成分，主要包括积雪草苷(madecassoside)、羟基积雪草苷(asiaticoside)、以及积雪草苷-B(asiaticoside–B)三种化合物，其结构式如下所示，由于积雪草苷-B为羟基积雪草苷的同分异构体，分离制备大量高纯度的对照品难度较大，直接限制了用常规的外标或内标法来实现其多指标的质量控制，无法全面控制药材质量。
Figure BDA0001221953560000011
对于积雪草总苷中有关成分的HPLC含量测定已有相关报道，均是在一般的HPLC条件下进行测定，而一般的甲醇-水或乙腈-水系统的流动相均无法有效分离羟基积雪草苷与其同分异构体积雪草苷B。
“一测多评”是一种适合中药特点的多指标质量评价的新模式，它利用有效化学成分间内在的函数和比例关系，只测定1个成分(对照品可得到者)来实现对多个成分(对照品没有或难以得到者)的同步监控，克服对照品短缺这一问题，即只测定某个代表性成分(易得、廉价、有效)，同时可计算出其他待测有效成分的含量。
“积雪草总苷及其制剂的含量研究.Ⅱ.积雪草总苷中积雪草苷、羟基积雪草苷和积雪草苷B含量的HPLC法测定”【陈云艳，邵燕，等.积雪草总苷及其制剂的含量研究.Ⅱ.积雪草总苷中积雪草苷、羟基积雪草苷和积雪草苷-B含量的HPLC法测定[J].中国医药工业杂志，2010，41(4)：276-279】以β-环糊精作为流动相添加剂，建立了HPLC法测定积雪草总苷原料中积雪草苷、羟基积雪草苷及同分异构体积雪草苷-B的含量。然而该方法是用来测定积雪草总苷中三种三萜皂苷类成分，而积雪草总苷是积雪草经过提取后再经过纯化工艺的成品，按照中国药典2010年版和2015年版的要求，其所含的羟基积雪草苷和积雪草苷的含量不得低于55％，可见，积雪草总苷中所含的物质成分复杂程度明显不及积雪草、积雪草提取物及其制剂。而且上述方法需要使用3种对照品，其中积雪草苷-B的对照品难以获得、分析成本过高等原因，限制了外标法进行多指标成分质量控制的实际应用。
因此，为了控制好积雪草药材及其提取物与制剂的临床安全性，维护患者的利益，很有必要在现有技术的基础上研究设计出能准确检测多种有效成分的检测方法。
有鉴于此特提出本发明。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，采用高效液相色谱分离，通过一测多评技术，以积雪草苷为内标物，建立其与羟基积雪草苷、积雪草苷-B的相对校正因子，并计算羟基积雪草苷和积雪草苷-B含量的方法。该方法检测灵敏度高，稳定性好，可以客观、全面、准确地评价积雪草药材及其提取物与制剂的质量，可解决因对照品缺乏而无法客观合理地控制药材及其制剂质量的问题，对控制质量和保证疗效具有重要意义。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种积雪草药材及其提取物与制剂的质量检测方法，其中，所述的方法包括如下步骤：
(1)积雪草苷对照品溶液的制备
称取积雪草苷，加甲醇溶解，摇匀，作为积雪草苷对照品储备溶液；吸取积雪草苷对照品储备溶液，加甲醇制成积雪草苷对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备
称取积雪草药材、积雪草药材提取物或积雪草制剂，加入甲醇，超声处理，放冷，称定重量，加甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
(3)积雪草苷的含量测定
分别将积雪草苷对照品溶液及供试品溶液注入高效液相色谱仪，测定供试品溶液中积雪草苷的含量；
(4)计算羟基积雪草苷、积雪草苷-B的含量
利用羟基积雪草苷、积雪草苷-B与积雪草苷之间的校正因子与羟基积雪草苷、积雪草苷B峰面积计算供试品中羟基积雪草苷、积雪草苷-B的含量。
上述方法中，其中，步骤(4)中，供试品中羟基积雪草苷、积雪草苷B的含量按下式计算：
Ci＝fsi×(Ai/As)×Cs
式中Ci为待测成分i的浓度，Ai为待测成分i的峰面积，As为参比成分s的峰面积，Cs为参比成分s的浓度，fsi为参比成分s对待测成分i的校正因子。
进一步的，羟基积雪草苷、积雪草苷-B与积雪草苷之间的校正因子f积雪草苷/羟基积雪草苷、f积雪草苷/积雪草苷-B按如下方法计算得到：
分别精密称定积雪草苷、积雪草苷-B和羟基积雪草苷3种对照品置于量瓶中，加甲醇溶解稀释，制得各单一对照品储备液；然后分别量取不同体积单一对照品溶液，混合稀释制成系列浓度混合对照品溶液，备用；
取上述制备得到的混合对照品溶液，进样2、4、6、8、10、15、20μl，用高效液相色谱测定色谱图并进行峰面积积分，选取积雪草苷为内标化合物，利用公式分别计算积雪草苷对羟基积雪草苷、积雪草苷-B的校正因子f积雪草苷/羟基积雪草苷、f积雪草苷/积雪草苷-B。
以上所述的公式为：fsi＝fs/fi＝(As/Cs)/(Ai/Ci)，式中As为参比成分s的峰面积，Cs为参比成分s的浓度，Ai为待测成分i的峰面积，Ci为待测成分i的浓度。
具体地说：
f积雪草苷/羟基积雪草苷＝(A积雪草苷/C积雪草苷)/(A羟基积雪草苷/C羟基积雪草苷)
式中：f积雪草苷/羟基积雪草苷——积雪草苷对羟基积雪草苷的校正因子；A积雪草苷——积雪草苷峰面积；C积雪草苷——积雪草苷浓度；A积雪草苷——羟基积雪草苷峰面积；C积雪草苷——羟基积雪草苷浓度。
f积雪草苷/积雪草苷-B＝(A积雪草苷/C积雪草苷)/(A积雪草苷-B/C羟基积雪草苷-B)
式中：f积雪草苷/积雪草苷-B——积雪草苷对积雪草苷-B的校正因子；A积雪草苷——积雪草苷峰面积；C积雪草苷——积雪草苷浓度；A积雪草苷——积雪草苷-B峰面积；C积雪草苷——积雪草苷-B浓度。
作为优选方案，高效液相色谱仪测定的条件为：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；
流动相：乙腈-β-环糊精水溶液；
流速：0.9-1.1ml/min，优选1.0ml/min；
柱温：35℃；
检测波长：205nm；
洗脱程序：梯度洗脱。
本发明针对积雪草药材、积雪草药材提取物或积雪草制剂有效成分，通过全波长扫描，确定积雪草皂苷类有效成分在205nm处有较大的吸收，灵敏度高，因此本发明采用205nm作为检测波长，可以准确灵敏的检测到各有效化合物。
“积雪草总苷及其制剂的含量研究.Ⅱ.积雪草总苷中积雪草苷、羟基积雪草苷和积雪草苷B含量的HPLC法测定”【陈云艳，邵燕，等.积雪草总苷及其制剂的含量研究.Ⅱ.积雪草总苷中积雪草苷、羟基积雪草苷和积雪草苷B含量的HPLC法测定[J].中国医药工业杂志，2010，41(4)：276-279】采用等度洗脱方式，而本发明采用梯度洗脱方式。由此产生的积极效果在于：通过实验证明，等度洗脱方式所测得积雪草苷-B、积雪草苷、羟基积雪草苷目标峰的对称因子分别为1.20、0.99、0.99，理论塔板数分别为10622、12800、15199；而梯度洗脱方式所测得积雪草苷-B、积雪草苷、羟基积雪草苷目标峰的对称因子分别为0.98、0.99、1.02，理论塔板数分别为79321、106335、149860。首先，由上数据可以判断等度洗脱方式所测得积雪草苷-B目标峰对称性较差，甚至不符合国家的要求，梯度洗脱方式所测得积雪草苷-B、积雪草膏、羟基积雪草苷目标峰的对称性都比较好；其次，梯度洗脱方式所测得积雪草苷-B、积雪草苷、羟基积雪草苷目标峰的理论塔板数明显大于等度洗脱方式，甚至大一个数量级，理论塔板数是色谱的柱效参数之一，用于定量表示色谱柱的分离效率(简称柱效)，通过理论塔板数可以判断出梯度洗脱方式明显优于等度洗脱方式。
作为更优选方案，所述的梯度洗脱按如下程序进行：
Figure BDA0001221953560000041
Figure BDA0001221953560000051
优选：
Figure BDA0001221953560000052
为更好地检测三种三萜皂苷类化合物的含量，本发明以β-环糊精作为流动相添加剂，可以在普通C18分析柱上实现同分异构体的分离分析，同时考虑到甲醇在末端吸收的噪音干扰大、与β-环糊精互溶性差，试验考察对比了乙腈/β-环糊精水溶液系统以不同比例洗脱方式的分离效果：①乙腈-2mmol/Lβ-环糊精(24：76)、②乙腈-2mmol/Lβ-环糊精(乙腈0-27min：22.5％。27-47min：22.5-42.5％)、③乙腈-1mmol/Lβ-环糊精(乙腈0-40min：15％-35％，41-50min：75％)，结果表明以条件③对目标峰的分离度、对称性最好，且保留时间适宜。
作为更优选方案，所述的β-环糊精水溶液的浓度为0.5～1.8mmol/L。
实验证明，β-环糊精浓度的变化对积雪草苷-B的分离效果和液相系统压力有较大的影响：浓度较低时，积雪草苷-B的分离效果差；浓度过大时，β-环糊精在乙腈中析出而使液相系统压力增高甚至管路堵塞。本发明方法选定的β-环糊精的浓度为0.5～1.8mmol/L，既可以保证积雪草苷-B得以较好的分离，又使得液相系统压力处于合理范围，另外还使得所测得皂苷含量、校正因子及相对保留时间等重现性较好。
作为最佳方案，所述的β-环糊精水溶液的浓度为1mmol/L。
上述方法中，所述的以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱为WelchUltimate XB-C18柱，4.6×250mm，5μm或Hibar 250-4.6PUROSPHER STAR LP RP-18endcapped 5μm或CAPCELL PAK C18柱，4.6×250mm，5μm。
上述方法中，步骤(1)积雪草苷对照品溶液的制备采用以下方法：精密称取积雪草苷15mg，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为积雪草苷对照品储备溶液，浓度1.4464mg/ml；精密吸取上述对照品储备溶液1.2ml，置10ml量瓶中，加甲醇制成每1ml含0.1736mg的积雪草苷对照品溶液。
步骤(2)供试品溶液的制备采用以下方法：称取积雪草药材、积雪草药材提取物或积雪草制剂0.5g，精密称定，置具塞三角烧瓶中，精密加入80％甲醇20ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，加80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
进一步的，所述的超声处理的功率为210W，频率为40kHz。
本发明的方法可用于检测以积雪草为原料的制剂、积雪草药材及其提取物。
所述的制剂选自：片剂、胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂或贴剂。
本发明采用一测多评方法，即通过测定一个成分，实现对多个成分定量的方法。依据在一定线性范围内，成分的量(质量或浓度)与检测器响应成正比。在多指标质量评价时，以药材中某一易获得或稳定的典型有效成分为内参物(s)，建立内参物(s)与其它待测成分(i)间的相对校正因子(RCF，fsi)，按下式计算：
fsi＝fs/fi＝(As/Cs)/(Ai/Ci) (公式1)
其中，As为参比成分s的峰面积，Cs为参比成分s的浓度，Ai为待测成分i的峰面积，Ci为待测成分i的浓度。
方法学建立时，求出内参物与各待测成分间的RCF，将其作为一个常数用于含量测定中，按常规法测出内参物的浓度后，按下式计算各待测成分的浓度：
Ci＝fsi×(Ai/As)×Cs (公式2)
其中，Ai为待测成分i的峰面积，As为参比成分s的峰面积，Cs为参比成分s的浓度。
待测成分的色谱峰定位采用相对保留时间法，按下式计算：
Rt＝Ts/Ti (公式3)
其中，Ts为参比成分s的保留时间，Ti为待测成分i的保留时间。
本发明提供的一种积雪草药材及其提取物与制剂的质量检测方法和现有技术相比具有如下优点：
(1)本发明根据积雪草中积雪草苷、羟基积雪草苷和积雪草苷-B和杂质成分的结构性质特点，通过大量实验筛选出最佳的流动相组成，洗脱程序、检测波长等分析条件，经多次实验验证。
(2)本发明采用一测多评技术，以积雪草苷为内标物，建立其与羟基积雪草苷、积雪草苷-B的相对校正因子，并计算羟基积雪草苷和积雪草苷-B含量的方法。该方法检测灵敏度高，稳定性好，可以客观、全面、准确地评价积雪草药材及其提取物与制剂的质量，可解决因对照品缺乏而无法客观合理地控制药材及其制剂质量的问题，对控制质量和保证疗效具有重要意义。
(3)可更全面的控制积雪草的质量，同时规避由多成分含量测定带来的成本和操作问题，方法简单便于操作，且测定结果准确，方法重复性、耐用性良好。
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述。
附图说明
图1为积雪草苷-B(190～400nm)全波长扫描图；
图2为羟基积雪草苷(190～400nm)全波长扫描图；
图3为积雪草苷(190～400nm)全波长扫描图；
需要说明的是，这些附图和文字描述并不旨在以任何方式限制本发明的构思范围，而是通过参考特定实施例为本领域技术人员说明本发明的概念。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
(1)积雪草苷对照品溶液的制备
精密称取积雪草苷15mg，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为积雪草苷对照品储备溶液，浓度1.4464mg/ml；精密吸取上述对照品储备溶液1.2ml，置10ml量瓶中，加甲醇制成每1ml含0.1736mg的积雪草苷对照品溶液。
(2)供试品溶液的制备
取积雪草粉末(过二号筛)约0.5g，精密称定，置具塞三角烧瓶中，精密加入80％甲醇20ml，称定重量，超声处理(功率210W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，加80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
(3)积雪草苷的含量测定
分别将积雪草苷对照品溶液及供试品溶液注入高效液相色谱仪，测定供试品溶液中积雪草苷的含量；所用高效液相色谱参数设置如下：
色谱柱：Welch Ultimate XB-C18柱(4.6×250mm，5μm)；
流动相：乙腈-1mmol/Lβ-环糊精；
流速：1.0ml/min；
柱温：35℃；
检测波长：205nm；
洗脱程序：梯度洗脱，所述的梯度洗脱按如下程序进行：
Figure BDA0001221953560000081
(4)校正因子fsi的计算
分别精密称定积雪草苷、积雪草苷-B和羟基积雪草苷3种对照品各适量置于量瓶中，加甲醇配成浓度分别为1.4464mg/ml、1.5870mg/ml和1.4058mg/ml的对照品溶液，分别量取不同体积单一对照品溶液，混合稀释制成系列浓度混合对照品溶液，备用；
取上述备用的混合对照品溶液，进样2、4、6、8、10、15、20μl，用高效液相色谱测定色谱图并进行峰面积积分，所用高效液相色谱参数设置同上，选取积雪草苷为内标化合物，分别计算积雪草苷对羟基积雪草苷、积雪草苷-B的校正因子f积雪草苷/羟基积雪草苷、f积雪草苷/积雪草苷B的平均值分别为1.009和0.911；
以上所述的公式为：fsi＝fs/fi＝(As/Cs)/(Ai/Ci)，式中As为参比成分s的峰面积，Cs为参比成分s的浓度，Ai为待测成分i的峰面积，Ci为待测成分i的浓度。
(5)计算羟基积雪草苷、积雪草苷-B的含量
利用羟基积雪草苷、积雪草苷-B与积雪草苷之间的校正因子与羟基积雪草苷、积雪草苷-B峰面积，按照公式计算供试品中羟基积雪草苷、积雪草苷-B的含量为：羟基积雪草苷1.39％，积雪草苷B0.64％，与外标法测得值比较无明显差别。
其中，所述公式为：
Ci＝fsi×(Ai/As)×Cs
式中Ci为待测成分i的浓度，Ai为待测成分i的峰面积，As为参比成分s的峰面积，Cs为参比成分s的浓度，fsi为参比成分s对待测成分i的校正因子。
实施例2
(1)积雪草苷对照品溶液的制备
精密称取积雪草苷15mg，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为积雪草苷对照品储备溶液，浓度1.4464mg/ml；精密吸取上述对照品储备溶液1.2ml，置10ml量瓶中，加甲醇制成每1ml含0.1736mg的积雪草苷对照品溶液。
(2)供试品溶液的制备
取积雪草粉末(过二号筛)约0.5g，精密称定，置具塞三角烧瓶中，精密加入80％甲醇20ml，称定重量，超声处理(功率210W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，加80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
(3)积雪草苷的含量测定
分别将积雪草苷对照品溶液及供试品溶液注入高效液相色谱仪，测定供试品溶液中积雪草苷的含量；所用高效液相色谱参数设置如下：
色谱柱：Welch Ultimate XB-C18柱(4.6×250mm，5μm)；
流动相：乙腈-0.5mmol/Lβ-环糊精；
流速：1.0ml/min；
柱温：35℃；
检测波长：205nm；
洗脱程序：梯度洗脱，所述的梯度洗脱按如下程序进行：
Figure BDA0001221953560000091
(4)校正因子fsi的计算
分别精密称定积雪草苷、积雪草苷-B和羟基积雪草苷3种对照品各适量置于量瓶中，加甲醇配成浓度分别为1.4464mg/ml、1.5870mg/ml和1.4058mg/ml的对照品溶液，分别量取不同体积单一对照品溶液，混合稀释制成系列浓度混合对照品溶液，备用；
取上述备用的混合对照品溶液，进样2、4、6、8、10、15、20μl，用高效液相色谱测定色谱图并进行峰面积积分，所用高效液相色谱参数设置同上，选取积雪草苷为内标化合物，分别计算积雪草苷对羟基积雪草苷、积雪草苷-B的校正因子f积雪草苷/羟基积雪草苷、f积雪草苷/积雪草苷B的平均值分别为1.019和0.931；
以上所述的公式为：fsi＝fs/fi＝(As/Cs)/(Ai/Ci)，式中As为参比成分s的峰面积，Cs为参比成分s的浓度，Ai为待测成分i的峰面积，Ci为待测成分i的浓度。
(5)计算羟基积雪草苷、积雪草苷-B的含量
利用羟基积雪草苷、积雪草苷-B与积雪草苷之间的校正因子与羟基积雪草苷、积雪草苷-B峰面积，按照公式计算供试品中羟基积雪草苷、积雪草苷-B的含量为：羟基积雪草苷1.40％，积雪草苷B0.65％，与外标法测得值比较无明显差别。
其中，所述公式为：
Ci＝fsi×(Ai/As)×Cs
式中Ci为待测成分i的浓度，Ai为待测成分i的峰面积，As为参比成分s的峰面积，Cs为参比成分s的浓度，fsi为参比成分s对待测成分i的校正因子。
实施例3
(1)积雪草苷对照品溶液的制备
精密称取积雪草苷15mg，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为积雪草苷对照品储备溶液，浓度1.4464mg/ml；精密吸取上述对照品储备溶液1.2ml，置10ml量瓶中，加甲醇制成每1ml含0.1736mg的积雪草苷对照品溶液。
(2)供试品溶液的制备
取积雪草粉末(过二号筛)约0.5g，精密称定，置具塞三角烧瓶中，精密加入80％甲醇20ml，称定重量，超声处理(功率210W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，加80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
(3)积雪草苷的含量测定
分别将积雪草苷对照品溶液及供试品溶液注入高效液相色谱仪，测定供试品溶液中积雪草苷的含量；所用高效液相色谱参数设置如下：
色谱柱：Welch Ultimate XB-C18柱(4.6×250mm，5μm)；
流动相：乙腈-1.8mmol/Lβ-环糊精；
流速：1.0ml/min；
柱温：35℃；
检测波长：205nm；
洗脱程序：梯度洗脱，所述的梯度洗脱按如下程序进行：
Figure BDA0001221953560000111
(4)校正因子fsi的计算
分别精密称定积雪草苷、积雪草苷-B和羟基积雪草苷3种对照品各适量置于量瓶中，加甲醇配成浓度分别为1.4464mg/ml、1.5870mg/ml和1.4058mg/ml的对照品溶液，分别量取不同体积单一对照品溶液，混合稀释制成系列浓度混合对照品溶液，备用；
取上述备用的混合对照品溶液，进样2、4、6、8、10、15、20μl，用高效液相色谱测定色谱图并进行峰面积积分，所用高效液相色谱参数设置同上，选取积雪草苷为内标化合物，分别计算积雪草苷对羟基积雪草苷、积雪草苷-B的校正因子f积雪草苷/羟基积雪草苷、f积雪草苷/积雪草苷B的平均值分别为1.019和0.931；
以上所述的公式为：fsi＝fs/fi＝(As/Cs)/(Ai/Ci)，式中As为参比成分s的峰面积，Cs为参比成分s的浓度，Ai为待测成分i的峰面积，Ci为待测成分i的浓度。
(5)计算羟基积雪草苷、积雪草苷-B的含量
利用羟基积雪草苷、积雪草苷-B与积雪草苷之间的校正因子与羟基积雪草苷、积雪草苷-B峰面积，按照公式计算供试品中羟基积雪草苷、积雪草苷-B的含量为：羟基积雪草苷1.40％，积雪草苷B0.65％，与外标法测得值比较无明显差别。
其中，所述公式为：
Ci＝fsi×(Ai/As)×Cs
式中Ci为待测成分i的浓度，Ai为待测成分i的峰面积，As为参比成分s的峰面积，Cs为参比成分s的浓度，fsi为参比成分对待测成分的校正因子。
试验例、试验条件的选择
1.1对照品溶液的制备
精密称取置五氧化二磷干燥器中干燥至恒重的积雪草苷-B对照品15mg(实际称样量为15.87mg)，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为积雪草苷-B对照品储备溶液，浓度1.5870mg/ml。
精密称取羟基积雪草苷15mg(实际称样量为15.30mg)，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为羟基积雪草苷对照品储备溶液，浓度1.4058mg/ml。
精密称取积雪草苷15mg(实际称样量为15.86mg)，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为积雪草苷对照品储备溶液，浓度1.4464mg/ml。
分别精密吸取上述三种对照品储备溶液各1.0、1.6、1.2ml，置10ml量瓶中，加甲醇制成每1ml分别含0.1587、0.2248、0.1736mg的混合对照品溶液。
2.1液相条件的选择
2.1.1检测波长的选择
由于积雪草皂苷类成分紫外吸收弱，经190～400nm范围内进行全波长扫描检测，结果显示积雪草苷-B、羟基积雪草苷、积雪草苷分别在192、192、191nm处有最大紫外吸收(见图1至图3)，但考虑到此波长范围下基线噪音大，检测灵敏度低，因此参考《中国药典一部》(2015版)收载的积雪草含量测定方法，选择205nm作为检测波长。
2.1.2流动相的选择
通过在流动相中加入少量的β-环糊精，可以在普通C18分析柱上实现同分异构体的分离分析，同时考虑到甲醇在末端吸收的噪音干扰大、与β-环糊精互溶性差，因此试验对比了乙腈/β-环糊精系统以不同比例洗脱方式的分离效果：①乙腈-2mmol/Lβ-环糊精(24:76)、②乙腈-2mmol/Lβ-环糊精(乙腈0-27min:22.5％，27-47min:22.5-42.5％)、③乙腈-1mmol/Lβ-环糊精(乙腈0-40min:15％-35％,41-50min:75％)，结果表明以条件③对目标峰的分离度、对称性最好，且保留时间适宜，故本发明优选③为流动相。结果见表1。
表1、流动相选择数据
Figure BDA0001221953560000131
根据实验结果，确定本发明的色谱条件为：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，乙腈-1mmol/Lβ-环糊精(乙腈0-40min：15％-35％，41-50min：75％)为流动相梯度洗脱，灵敏度1.2AU，205nm为检测波长，柱温35℃，流速：1.0ml/min。
2.2供试品溶液制备方法的选择
2.2.1提取溶剂的选择
取积雪草(四川筠连县150901批)粉末约0.5g(过二号筛)，精密称定，置具塞三角烧瓶中，分别精密加入甲醇、80％甲醇、50％甲醇20ml，称定重量，超声处理(功率210W，频率40kHz)40分钟，放冷，再称定重量，用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。每种溶剂平行处理2份样品，照含量测定项下方法进行测定，计算积雪草苷-B、羟基积雪草苷及积雪草苷的平均含量，结果见表2。
表2、不同提取溶剂含量测定结果比较
提取溶剂 积雪草苷-B含量/％ 羟基积雪草苷含量/％ 积雪草苷含量/％
甲醇 0.35 0.65 0.67
80％甲醇 0.40 0.71 0.73
50％甲醇 0.32 0.59 0.60
结果表明，80％甲醇提取效果最好，故选择80％甲醇为提取溶剂。
2.2.2提取方法的考察
取积雪草(四川筠连县150901批)粉末约0.5g(过二号筛)，精密称定，置具塞三角烧瓶中，精密加入80％甲醇20ml，称定重量，分别采用超声处理(功率210W，频率40kHz)、加热回流的方式提取40分钟，提取结束后放冷，再称定重量，加80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。每种提取方法平行处理2份样品，照含量测定项下方法进行测定，计算积雪草苷-B、羟基积雪草苷及积雪草苷的平均含量，结果见表3。
表3、不同提取方式含量测定结果比较
提取方式 积雪草苷-B含量/％ 羟基积雪草苷含量/％ 积雪草苷含量/％
超声40分钟 0.40 0.68 0.70
回流40分钟 0.38 0.69 0.78
结果表明，超声40分钟与回流40分钟提取的积雪草苷-B及羟基积雪草苷的含量基本一致，但经回流处理的样品使积雪草苷目标峰与杂质峰不能完全分离，导致测定结果偏高，因此采用无杂质干扰且较为简便的超声提取方法。
2.2.3超声提取时间的考察
取积雪草(四川筠连县150901批)粉末约0.5g(过二号筛)，精密称定，置具塞三角烧瓶中，精密加入80％甲醇20ml，称定重量，分别超声处理(功率210W，频率40kHz)20分钟、30分钟、40分钟，放冷，再称定重量，加80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。每个提取时间平行处理2份样品，照含量测定项下方法进行测定，计算积雪草苷-B、羟基积雪草苷及积雪草苷的平均含量，结果见表4。
表4、不同提取时间含量测定结果比较
提取时间 积雪草苷-B含量/％ 羟基积雪草苷含量/％ 积雪草苷含量/％
20分钟 0.30 0.53 0.53
30分钟 0.38 0.70 0.71
40分钟 0.39 0.70 0.71
结果表明，超声处理(功率210W，频率40kHz)30分钟，积雪草苷-B、羟基积雪草苷、积雪草苷提取已经达到平衡，因此确定超声提取时间为30分钟。
综上研究，供试品制备方法确定为：取本品粉末(过二号筛)约0.5g，精密称定，置具塞三角烧瓶中，精密加入80％甲醇20ml，称定重量，超声处理(功率210W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，加80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
3.方法学验证
3.1线性范围
精密吸取1.1项下的混合对照品溶液2、4、6、8、10、15、20μl进样分析，每个浓度进样2次，取平均值，以进样量对峰面积积分值进行回归处理，得三种皂苷成分的回归方程及相关系数r，结果表明，积雪草苷-B在0.3174～3.174μg，羟基积雪草苷在0.4496～4.496μg、积雪草苷在0.3472～3.472μg范围内的进样量与峰面积均呈良好的线性关系，见表5～6。
表5、线性范围考察数据
Figure BDA0001221953560000141
表6、线性回归方程及范围
组分 回归方程 r 线性范围/μg
积雪草苷-B Y＝29433x-3906 0.9999 0.3174～3.174
羟基积雪草苷 Y＝59451x-3398 0.9999 0.4496～4.496
积雪草苷 Y＝46420x-3535 0.9999 0.3472～3.472
3.2定量限
以信噪比为10:1时注入仪器的量确定定量限的方法进行测定，积雪草苷-B、羟基积雪草苷、积雪草苷的定量限分别为0.1587、0.1406、0.2893μg。
3.3校正因子和相对保留时间计算
精密吸取1.1项下的混合对照品溶液2、4、6、8、10、15、20μl进样测定结果，以积雪草苷为内参物，按公式1和公式3，分别计算积雪草苷对积雪草苷-B、羟基积雪草苷的校正因子和相对保留时间，取平均值，结果表明，以积雪草苷为参照物，积雪草苷-B、羟基积雪草苷的校正因子分别为0.911和1.009，RSD分别为1.11％、0.88％，相对保留时间分别为1.334和1.194，RSD分别为0.13％、0.08％。结果见表7。
表7、校正因子和相对保留时间计算结果
Figure BDA0001221953560000151
3.4精密度试验
取同一份供试品溶液(四川筠连县150901批)，连续进样6次，测定峰面积，结果见表，结果表明精密度良好，见表8。
表8、精密度考察试验
序号 积雪草苷-B峰面积 羟基积雪草苷峰面积 积雪草苷峰面积
1 496654 810383 835024
2 497944 811001 832364
3 506539 819373 838284
4 506368 820121 843562
5 505399 821942 838971
6 512317 827146 851977
均值 504203.5 818327.7 840030.3
RSD 1.17％ 0.80％ 0.83％
3.5稳定性试验
取同一份供试品溶液(四川筠连县150901批)，分别于0、4、8、16、24h时进样分析，测定各待测成分峰面积，计算含量。稳定性考察结果表明供试品在24h内稳定，见表9。
表9、稳定性试验结果
时间/h 积雪草苷-B含量/％ 羟基积雪草苷含量/％ 积雪草苷含量/％
0 0.37 0.64 0.66
4 0.38 0.69 0.71
8 0.41 0.70 0.72
16 0.40 0.70 0.73
24 0.39 0.69 0.71
均值 0.39 0.68 0.71
RSD 3.83％ 3.62％ 4.06％
3.6重复性试验
取同一批号样品(四川筠连县150901批)，平行制备6份供试品溶液，测定含量，结果见表，结果表明方法重复性较好，见表10。
表10、重复性试验结果
序号 积雪草苷-B含量/％ 羟基积雪草苷含量/％ 积雪草苷含量/％
1 0.47 0.85 0.90
2 0.47 0.84 0.89
3 0.47 0.85 0.88
4 0.47 0.84 0.88
5 0.48 0.85 0.88
6 0.48 0.84 0.88
均值 0.47 0.84 0.88
RSD 1.01％ 0.42％ 1.09％
3.7加样回收率试验
精密称取适量已知含量的积雪草粉末(四川筠连县150901批)6份(积雪草苷-B0.47％、羟基积雪草苷0.84％、积雪草苷0.88％)，分别加入一定量的对照品，按供试品溶液制备方法制备样品，测定含量，计算加样回收率。结果表明方法准确度较好，见表11-1～11-3。
表11-1、积雪草苷-B加样回收试验结果
Figure BDA0001221953560000161
表11-2、羟基积雪草苷加样回收试验结果
Figure BDA0001221953560000162
Figure BDA0001221953560000171
表11-3积雪草苷加样回收试验结果
Figure BDA0001221953560000172
3.8耐用性试验
3.8.1β-环糊精浓度变化的影响
考察了β-环糊精浓度为0.5、0.9、1.8、2.5mmol/L条件下样品的测定结果变化。结果发现β-环糊精浓度的变化对积雪草苷-B的分离效果有较大影响，浓度较低时，积雪草苷-B与羟基积雪草苷的保留时间仅间隔1.5分钟，且含量测定结果偏小；浓度过大易导致β-环糊精在乙腈中析出使液相系统压力增高甚至管路堵塞；浓度为0.9—1.8mmol/L时，皂苷含量、校正因子及相对保留时间等重现性较好。为保证结果的可靠性应适当控制β-环糊精浓度的变化范围，见表12。
表12、β-环糊精浓度变化影响结果
Figure BDA0001221953560000173
3.8.2流速变化的影响
考察了流速为0.9、1.0、1.1ml/min条件下样品的测定结果变化，结果表明耐用性较好，见表13。
表13、流速变化影响结果
流速/ml/min 0.9 1 1.1 均值 RSD/％
积雪草苷-B含量/％ 0.39 0.42 0.41 0.41 3.76
羟基积雪草苷含量/％ 0.69 0.68 0.70 0.69 1.45
积雪草苷含量/％ 0.70 0.70 0.70 0.70 0
f<sub>积雪草苷/积雪草苷-B</sub> 0.907 0.926 0.919 0.917 1.05
f<sub>积雪草苷/羟基积雪草苷</sub> 1.003 1.000 1.003 1.002 0.17
R<sub>t积雪草苷/积雪草苷-B</sub> 1.334 1.331 1.368 1.344 1.53
R<sub>t积雪草苷/羟基积雪草苷</sub> 1.191 1.194 1.206 1.197 0.66
3.8.3不同品牌色谱柱的影响
考察了柱1(Hibar 250-4.6PUROSPHER STAR LP RP-18endcapped 5μm)、柱2(Welch Ultimate XB-C18柱，4.6×250mm，5μm)、柱3(CAPCELL PAK C18柱，4.6×250mm，5μm)对样品测定结果的影响，结果表明方法对不同品牌的色谱柱耐用性良好。同时根据考察结果，确定本液相色谱方法的理论塔板数以积雪草苷峰计算应不低于100000。结果见表14-1～14-3。
表14-1、不同品牌色谱柱对积雪草苷-B测定的影响
色谱柱 柱1 柱2 柱3 均值 RSD/％
含量/％ 0.38 0.42 0.40 0.40 5.00
f<sub>积雪草苷/积雪草苷-B</sub> 0.926 0.926 0.927 0.926 0.06
R<sub>t积雪草苷/积雪草苷-B</sub> 1.343 1.331 1.343 1.339 0.52
分离度 1.76 1.75 1.64 / /
对称因子 0.92 1.04 0.99 / /
理论塔板数 103218 74762 60926 / /
表14-2、不同品牌色谱柱对羟基积雪草苷测定的影响
色谱柱 柱1 柱2 柱3 均值 RSD/％
含量/％ 0.68 0.68 0.68 0.68 0
f<sub>积雪草苷/羟基积雪草苷</sub> 1.002 1.000 1.002 1.001 0.12
R<sub>t积雪草苷/羟基积雪草苷</sub> 1.198 1.194 1.200 1.197 0.26
分离度 9.94 8.13 3.69 / /
对称因子 0.95 0.92 0.94 / /
理论塔板数 140175 106461 85213 / /
表14-3、不同品牌色谱柱对积雪草苷测定的影响
色谱柱 柱1 柱2 柱3 均值 RSD/％
含量/％ 0.69 0.70 0.70 0.70 0.83
分离度 18.51 15.94 3.46 / /
对称因子 0.92 0.92 0.94 / /
理论塔板数 197713 154477 109121 / /
3.8.4不同色谱系统的影响
考察了Waters2690-2487和Waters e2695-2996不同色谱系统对样品测定结果的影响，结果表明本法对不同色谱系统耐用性良好，见表15。
表15、不同色谱系统考察结果
色谱系统 Waters2690-2487 Waters e2695-2996
积雪草苷-B含量/％ 0.42 0.38
羟基积雪草苷含量/％ 0.68 0.68
积雪草苷含量/％ 0.70 0.71
f<sub>积雪草苷/积雪草苷-B</sub> 0.926 0.919
f<sub>积雪草苷/羟基积雪草苷</sub> 1.000 1.013
R<sub>t积雪草苷/积雪草苷-B</sub> 1.331 1.355
R<sub>t积雪草苷/羟基积雪草苷</sub> 1.194 1.205
4.多批次样品测定
采用外标法测定不同批次样品，并与一测多评法(f积雪草苷/积雪草苷-B和f积雪草苷/羟基积雪草苷分别为0.911和1.009)计算结果(按公式2计算)进行比较，结果表明两种方法所得积雪草苷-B、羟基积雪草苷及积雪草苷的含量值无明显差别，表明一测多评法可用来测定积雪草三种皂苷成分的含量。结果见表16。
表16、不同批次样品三种皂苷成分的含量
Figure BDA0001221953560000191
以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本发明的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许变动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。

Claims (4)

1.一种积雪草药材及其提取物与制剂的质量检测方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：
(1)积雪草苷对照品溶液的制备
称取积雪草苷，加甲醇溶解，摇匀，作为积雪草苷对照品储备溶液；吸取积雪草苷对照品储备溶液，加甲醇制成每1ml含0.1736mg的积雪草苷对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备
称取积雪草药材、积雪草药材提取物、积雪草制剂或积雪草粉末，积雪草粉末过二号筛，加入浓度为80％的甲醇，超声处理30分钟，超声处理的功率为210W，频率为40kHz，放冷，称定重量，加80％的甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
(3)积雪草苷的含量测定
分别将积雪草苷对照品溶液及供试品溶液注入高效液相色谱仪，测定供试品溶液中积雪草苷的含量；
(4)计算羟基积雪草苷、积雪草苷-B的含量
利用羟基积雪草苷、积雪草苷-B与积雪草苷之间的校正因子与羟基积雪草苷、积雪草苷-B峰面积计算供试品中羟基积雪草苷、积雪草苷-B的含量；
高效液相色谱仪测定的条件为：
色谱柱：WelchUltimateXB-C18柱4.6×250mm，5μm；
流动相：乙腈-1mmol/Lβ-环糊精水溶液；
流速：1.0ml/min；
柱温：35℃；
检测波长：205nm；
灵敏度：1.2AU；
洗脱程序：梯度洗脱；
梯度洗脱程序为：
时间/min 乙腈/% β-环糊精水溶液/% 0 15 85 40 35 65 41 75 25 50 75 25
供试品中羟基积雪草苷、积雪草苷-B的含量按下式计算：
Ci＝fsi×(Ai/As)×Cs
式中Ci为待测成分i的浓度，Ai为待测成分i的峰面积，As为参比成分s的峰面积，Cs为参比成分s的浓度，fsi为参比成分s对待测成分i的校正因子；
羟基积雪草苷、积雪草苷B与积雪草苷之间的校正因子f积雪草苷/羟基积雪草苷、f积雪草苷/积雪草苷-B按如下方法计算得到：
分别精密称定积雪草苷、积雪草苷-B和羟基积雪草苷3种对照品置于量瓶中，加甲醇溶解稀释，制得各单一对照品储备液；然后分别量取不同体积单一对照品溶液，混合稀释制成系列浓度混合对照品溶液，备用；
取上述制备得到的混合对照品溶液，进样2、4、6、8、10、15、20μl，用高效液相色谱测定色谱图并进行峰面积积分，选取积雪草苷为内标化合物，利用公式分别计算积雪草苷对羟基积雪草苷、积雪草苷B的校正因子f积雪草苷/羟基积雪草苷、f积雪草苷/积雪草苷-B；
以上所述的公式为：fsi＝fs/fi＝(As/Cs)/(Ai/Ci)，式中As为参比成分s的峰面积，Cs为参比成分s的浓度，Ai为待测成分i的峰面积，Ci为待测成分i的浓度。
2.根据权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于，步骤(1)积雪草苷对照品溶液的制备采用以下方法：精密称取积雪草苷15mg，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为积雪草苷对照品储备溶液，浓度1.4464mg/ml；精密吸取上述对照品储备溶液1.2ml，置10ml量瓶中，加甲醇制成每1ml含0.1736mg的积雪草苷对照品溶液。
3.根据权利要求2所述的质量检测方法，其特征在于，步骤(2)供试品溶液的制备采用以下方法：称取积雪草药材、积雪草药材提取物或积雪草制剂0.5g，精密称定，置具塞三角烧瓶中，精密加入80％甲醇20ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，加80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
4.根据权利要求3所述的质量检测方法，该方法用于检测以积雪草为原料的制剂、积雪草药材及其提取物。
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