CN105675734A

CN105675734A - 一种复方丹参浸膏中低聚糖成分的含量测定方法

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Publication number: CN105675734A
Application number: CN201410663130.3A
Authority: CN
Inventors: 徐波; 王苹; 牛涛; 陈红
Original assignee: TIANJIN TASLY MODERN CHINESE MEDICINE RESOURCE CO Ltd
Current assignee: TIANJIN TASLY MODERN CHINESE MEDICINE RESOURCE CO Ltd
Priority date: 2014-11-19
Filing date: 2014-11-19
Publication date: 2016-06-15
Anticipated expiration: 2034-11-19
Also published as: CN105675734B

Abstract

本发明涉及一种中药有效成分的检测方法，特别涉及一种复方丹参浸膏中低聚糖成分的含量测定方法。本发明所述的含量测定方法，包括以下步骤：(1)对照品溶液的制备，称取果糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖和Gal‐Gal‐Glu‐Fru四糖对照品，加水制得混合对照品溶液；(2)供试品溶液的制备，取复方丹参浸膏，加水溶解，上固相萃取柱，用水洗涤，收集上样液和洗涤液，加水制得供试品溶液；(3)测定法：吸取混合对照品溶液和供试品溶液，注入蒸发光散射高效液相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图计算供试品中低聚糖的含量。

Description

一种复方丹参浸膏中低聚糖成分的含量测定方法

技术领域：

本发明涉及一种中药有效成分的检测方法，特别涉及一种复方丹参浸膏中低聚糖成分的含量测定方法。

背景技术：

复方丹参制剂为丹参、三七和冰片制备而成的心血管药物，目前已经上市的有复方丹参胶囊，复方丹参片和复方丹参滴丸。特别是复方丹参滴丸在临床上广泛用于冠心病、心绞痛的预防、治疗、急救。现已成为国内心血管市场上的主导品牌之一。

复方丹参浸膏，为丹参和三七的提取物，是复方丹参制剂的中间体，现有提取方法有多种，主要活性成分包括，原儿茶醛、三七皂苷R1、丹酚酸B、丹参酮ⅡA与丹参素，复方丹参制剂上市十余年中，复方丹参浸膏已经建立起了一整套全面地的工艺质量控制体系，并且不断进行完善和补充。

糖类成分广泛分布于植物的各个部位，也是中药材及中药产品中的主要组成成分，所占含量比例很高。另外，许多糖类成分对于中药活性成分具有辅助药效作用，同时糖类成分本身也具有为机体提供能量的作用，因此糖类成分的测定对于全面掌握中药材及中药产品质量非常重要。

通过高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)测定，复方丹参浸膏中的糖类成分分子量均在2000以下，属于单糖或低聚糖类。采用聚丙烯酰胺凝胶对复方丹参浸膏中的低聚糖成分进行了分离纯化，分离得到了五个低聚糖成分，分别为果糖、葡萄糖、蔗糖、Glu-Fru-Gal三糖和Gal-Gal-Glu-Fru四糖。所以测定它们的含量非常必要。

针对糖类成分的常用测定方法有化学分析法、气相色谱法、离子交换色谱法、凝胶色谱法、毛细管电泳法、衍生化气相色谱法等。但这些方法稳定性差，灵敏度不高。

为得到一种全新的含量测定方法，同时测定复方丹参浸膏中五种低聚糖成分，本发明采用高效液相色谱蒸发光散射检测器(HPLC—ELSD)法，具有稳定性好、灵敏度高、能够进行梯度洗脱等优点。

本发明是以“全面表征中药制剂的质量”为目标，针对复方丹参浸膏产品，采用SPE‐HPLC‐ELSD方法，利用五种低聚糖对照品作为标定物，配合固相萃取技术和HPLC‐ELSD方法，建立了一种复方丹参低聚糖的含量测定方法。

本方法用于低聚糖成分测定，简单快捷、选择性高，分离度好，取得了良好的效果。较前期方法，增加了检测成分，缩短了检测时间，提高了柱效和分离效率，达到了对糖类成分的全面表征和测定，节省了检测时间，降低了溶剂消耗。

发明内容：

本发明提供一种复方丹参浸膏中低聚糖成分的含量测定方法，其中所述复方丹参浸膏，制备方法如下：取丹参、三七饮片，用纯化水煎煮提取两次，第一次1‐2小时，第二次约1‐1.5小时。提取液合并、滤过，滤液浓缩，加入乙醇，静置使沉淀，取上清液，回收乙醇，浓缩成稠膏。

本发明的含量测定方法，包括以下步骤：

(1)对照品溶液的制备

称取果糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖和Gal‐Gal‐Glu‐Fru四糖对照品，加水制得混合对照品溶液；

(2)供试品溶液的制备

取复方丹参浸膏，加水溶解，上固相萃取柱，用水洗涤，收集上样液和洗涤液，加水制得供试品溶液；

(3)测定法：

吸取混合对照品溶液和供试品溶液，注入蒸发光散射高效液相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图计算供试品中低聚糖的含量；

其中，所述蒸发光散射高效液相色谱仪的色谱条件如下：

色谱柱选自：氨基柱、钙型柱、复合物色谱柱，柱长：150‐300mm，

流动相：乙腈和0‐0.5％的甲酸水或乙酸水为流动相，进行梯度洗脱，流动相的流速为0.6‐1.0mL/min，柱温25‐35℃，

ELSD检测器漂移管温度为55‐65℃,气压20‐40psi。

根据本发明，步骤(2)中的固相萃取柱选自ProElutPLS，WatersOasisWAX‐SPE，或者采用D101大孔树脂柱。优选ProElutPLS，0.5g.6mL‐1。

根据本发明，步骤(3)中流动相优选为乙腈和0‐0.5％的甲酸水。进一步地，采用乙腈和体积比为0.1％的甲酸水为流动相，进行梯度洗脱，梯度程序见表1；

表1流动相梯度程序

根据本发明，步骤(3)中的色谱柱优选为PrevailTMCarbohydrateES色谱柱。流动相的流速为0.8mL/min，柱温30℃。

根据本发明，优选：Waters2695液相色谱仪，2424ELSD检测器。ELSD检测器漂移管温度为60℃,气压30psi。

根据本发明的实施方式之一，步骤(1)中混合对照品溶液中果糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖和Gal‐Gal‐Glu‐Fru四糖的浓度分别为每毫升含上述物质0.5、0.5、0.5、0.3和2.5mg。

本发明的含量测定方法，优选的，包括以下步骤：

(1)对照品溶液的制备

精密称取经五氧化二磷干燥过的果糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖(Glu‐Fru‐Gal三糖含量以棉子糖计)和Gal‐Gal‐Glu‐Fru四糖对照品适量，加水制得每毫升含上述物质分别为0.5、0.5、0.5、0.3和2.5mg的混合对照品溶液。

(2)供试品溶液的制备

取复方丹参浸膏0.5g，精密称定，加水20ml，超声溶解，上至ProElutPLS，0.5g.6mL‐1固相萃取柱，再用水洗涤固相萃取柱，收集上样液和洗涤流出液，合并，转移至50ml量瓶中，加水至刻度，混匀，取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定即得。

(3)测定法：

分别精密吸取混合对照品溶液5μl、10μl，供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程分别计算果糖、葡萄糖、蔗糖、Glu‐Fru‐Gal三糖和Gal‐Gal‐Glu‐Fru四糖的含量，即得。

其中，色谱条件如下：

PrevailTMCarbohydrateES色谱柱，

乙腈和0.1％甲酸水为流动相梯度洗脱，梯度程序如下：

流速为0.8mL/min,柱温30℃。

ELSD检测器漂移管温度为60℃,气压30psi。

以下为本发明相关术语解释

ELSD‐HPLC：蒸发光散射高效液相色谱检测法。SPE固相萃取法。

Glu‐Fru‐Gal三糖：α‐D‐吡喃葡萄糖‐(1→2)‐β‐D‐呋喃果糖‐(1→1)‐β‐D‐吡喃半乳糖

Gal‐Gal‐Glu‐Fru四糖：O‐α‐D‐吡喃半乳糖‐(1→6)‐O‐α‐D‐吡喃半乳糖‐(1→6)‐O‐α‐D‐吡喃葡萄糖‐(1→2)‐O‐α‐D‐呋喃果糖

棉子糖：α‐D‐吡喃半乳糖基‐(1→6)‐α‐D‐吡喃葡萄糖基‐(1→2)‐β‐D‐呋喃果糖

本发明的方法是经过筛选获得的，筛选过程如下：

一、色谱条件考察：

(1)色谱柱的选择

本发明对比了两种不同厂牌色谱柱，(A)HypersilGOLDAmide；(B)PrevailTMCarbohydrateES.。从液相色谱图(参见附图1)的对比中可以看出，待分析成分在A型色谱柱上出峰较快，但前三个色谱峰分离效果不好，B型色谱柱分离度良好，且时间适中，因此本发明优化选用(B)型色谱柱。

(2)洗脱梯度的筛选：

本方法选择最常用的乙腈—水系统，使果糖、葡萄糖和蔗糖色谱峰得到了良好的分离效果。对于后面的低聚糖色谱峰采用了不同梯度条件，在保证分离度的前提下寻求最短检验周期，梯度条件如下：

梯度条件1、

时间/min	乙腈/％	0.1％甲酸水/％
			0	70	70
10	70	30
			15	60	40
20	70	30

梯度条件2、

时间/min	乙腈/％	0.1％甲酸水/％
			0	75	25
10	70	30
			15	60	40
20	75	25

不同条件下所得色谱图参见附图2，可见条件2的情况下检验周期最短。

二、方法学考察

(1)精密度试验

依法制备供试品溶液，重复进样6次，记录果糖、葡萄糖、蔗糖、Glu‐Fru‐Gal三糖和Gal‐Gal‐Glu‐Fru四糖的峰面积，计算得峰面积的平均值分别为953247、284451和3086571、278499和1095142，RSD分别为2.2％、2.4％、1.9％、2.4％和1.5％，仪器精密度良好。

(2)重复性实验

取复方丹参浸膏样品，依法制备供试品溶液6份，分别测定果糖、葡萄糖、蔗糖、Glu‐Fru‐Gal三糖和Gal‐Gal‐Glu‐Fru四糖的含量，计算得含量的平均值分别为3.77％、2.91％、8.44％、2.28％和21.11，RSD分别为1.8％、1.8％、1.6％、2.3％和1.8％，样品重现性良好。

(3)稳定性试验

取复方丹参浸膏样品，依法制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、24小时进样，记录峰面积并计算相对标准偏差，果糖、葡萄糖、蔗糖、Glu‐Fru‐Gal三糖和Gal‐Gal‐Glu‐Fru四糖峰面积的RSD分别为1.2％、1.6％、1.5％、2.0％和1.8％，表明供试品溶液在24小时内稳定性良好。

三、线性关系考察

精密称取经五氧化二磷干燥过的果糖、葡萄糖、蔗糖、水苏糖和Gal‐Gal‐Glu‐Fru四糖对照品适量，加水制成系列混合对照溶液，注入液相色谱仪，测定，以浓度的对数对测得的峰面积的对数进行线性回归，求得回归方程。结果见表2。

表2回归方程、相关系数及线性范围

结果表明在相应浓度范围内，五种低聚糖的峰面积的对数与浓度线性关系良好。

四、测量结果的加样回收率考察

精密称取0.20g、0.25g和0.30g的复方丹参浸膏，各称3份，置烧杯中，分别精密加入与含量相应的对照品，自“加水约20ml”起，照含量测定项下依法处理，作为供试品溶液，取10ul注入色谱仪，分别计算回收率，结果表明样品回收率良好。

表3回收率实验结果(mg,n＝6)

本发明采用自制Gal-Gal-Glu-Fru四糖标准品作为Gal-Gal-Glu-Fru四糖对照品，经过对复方丹参浸膏的五步分离纯化，纯度达到98.2％。

本发明采用自制棉子糖标准品作为Glu-Fru-Gal三糖对照品，经过方法学验证，符合含量测定要求。

本发明采用PrevailTMCarbohydrateES色谱柱，对于各个低聚糖类成分均有良好的分离度水平。同时相对于常用的氨基柱和钙离子柱，具有噪音低，色谱柱寿命长、溶剂兼容性强的特点，是本专利的优势所在。

本发明以最简单的乙腈—0.1％甲酸水溶液为流动相，梯度洗脱，能够在20分钟内有效的分离检测5种低聚糖成分，分离度均大于3，达到高效、快速分离。

本发明采用固相萃取技术，能够有效去除酚酸、皂苷等干扰成分。

经验证本发明的质量控制方法精密度、灵敏度、稳定性和回收率良好，能够有效测定复方丹参浸膏中的低聚糖成分含量。

本发明是针对复方丹参提取物中含量较高的糖类成分建立的含量测定方法，目的是进一步提升产品质量控制水平，从而更加准确的把握产品质量。

本发明建立了一种利用SPE‐HPLC‐ELSD法测定复方丹参浸膏中低聚糖成分的方法。本方法简便易行、准确有效、分离度高。相比于原方法检验周期短，检测成分增多。通过本测定方法产品的可测定成分大大提高，完善了现有质量标准，提高了产品的质量控制水平。

附图说明：

图1.不同色谱柱液相色谱图，上图为A型色谱柱，下图为B型色谱柱；

图2.洗脱梯度色谱图比较，上图为梯度条件1，下图为梯度条件2。

具体实施方式：

以下通过实施例进一步说明本发明。实施例中均采用Waters2695液相色谱仪，2424ELSD检测器，葡萄糖、果糖、蔗糖对照品购自中国药品生物制品检定所，棉子糖对照品购自百灵威公司，Gal‐Gal‐Glu‐Fru四糖为自制。

实施例1

照高效液相色谱法(中国药典2010版一部附录VID)测定。

色谱条件和系统适用性试验

采用PrevailTMCarbohydrateES色谱柱，以乙腈为流动相A，0.1％甲酸水为流动相B，流速0.8ml/min，柱温30℃；以WATERS2420ELSD检测器进行检测，参数设置为增益10，气压30psi，漂移管60℃，Nebheater：60％。理论板数按蔗糖色谱峰计算应不低于4000，果糖与葡萄糖的色谱分离度大于2.0。

时间(分钟)	乙腈	0.1％甲酸水
			0	75	25
10	70	30
			15	60	40
20	75	25

对照品溶液的制备精密称取经五氧化二磷干燥过的果糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖和Gal-Gal-Glu-Fru四糖对照品适量，加水制得每毫升含上述物质分别为0.5、0.5、0.5、0.3和2.5mg的混合对照品溶液。。

供试品溶液的制备取复方丹参提取物约0.5g，精密称定，加水约20ml，超声溶解，上至已处理好的固相萃取柱(ProElutPLS，0.5g/6ml)，流速约1ml/min，再用水分次洗涤，收集上样液和洗涤流出液约45ml，转移至50ml量瓶中，加水至刻度，混匀，即得。

测定法分别精密吸取各对照品溶液5μl、10μl，供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程分别计算含量，即得。

实施例2

照高效液相色谱法(中国药典2010版一部附录VID)测定。

色谱条件和系统适用性试验

采用PrevailTMCarbohydrateES色谱柱，以乙腈为流动相A，0.1％甲酸水为流动相B，，流速0.8ml/min，柱温30℃；以WATERS2420ELSD检测器进行检测，参数设置为增益10，气压25psi，漂移管65℃，Nebheater：60％。理论板数按蔗糖色谱峰计算应不低于4000，果糖与葡萄糖的色谱分离度大于2.0。

时间(分钟)	乙腈	0.1％甲酸水
			0	75	25
10	70	30
			15	60	40
20	75	25

实施例3

照高效液相色谱法(中国药典2010版一部附录VID)测定。

色谱条件和系统适用性试验采用PrevailTMCarbohydrateES色谱柱，以乙腈为流动相A，0.2％甲酸水为流动相B，，流速0.85ml/min，柱温30℃；以WATERS2420ELSD检测器进行检测，参数设置为增益10，气压30psi，漂移管60℃，Nebheater：60％。理论板数按蔗糖色谱峰计算应不低于4000，果糖与葡萄糖的色谱分离度大于2.0。

时间(分钟)	乙腈	0.1％甲酸水
			0	75	25
10	70	30
			15	60	40
20	75	25

供试品溶液的制备取复方丹参提取物约0.5g，精密称定，加水约20ml，超声溶解，上至已处理好的固相萃取柱(WatersOasisWAX-SPE，500mg)，流速约1ml/min，再用水分次洗涤，收集上样液和洗涤流出液约45ml，转移至50ml量瓶中，加水至刻度，混匀，即得。

实施例4

复方丹参浸膏的制备方法如下：取丹参、三七饮片，用原料药10倍重量的纯化水煎煮两次，第一次1.5小时，第二次1小时，提取液合并、滤过，滤液浓缩，加入乙醇使乙醇浓度达到70％，静置使沉淀，过滤得到上清液，回收乙醇，浓缩成稠膏，干燥后即为复方丹参浸膏。

实施例5

不同批次的样品的测定结果如下：

样品测定结果(％，n＝5)

Claims

1.一种复方丹参浸膏中低聚糖的含量测定方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)对照品溶液的制备

(2)供试品溶液的制备

(3)测定法：

其中，所述蒸发光散射高效液相色谱仪的色谱条件如下：

ELSD检测器漂移管温度为55‐65℃,气压20‐40psi。

2.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于，其中，步骤(2)中的固相萃取柱选自ProElutPLS，WatersOasisWAX‐SPE，或者采用D101大孔树脂柱。

3.根据权利要求2所述的含量测定方法，其特征在于，其中，步骤(2)中的固相萃取柱为ProElutPLS，0.5g.6mL‐1。

4.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于，其中，步骤(3)中流动相为乙腈和0‐0.5％的甲酸水。

5.根据权利要求4所述的含量测定方法，其特征在于，流动相为乙腈和0.1％的甲酸水，梯度程序如下：

6.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于，其中，步骤(3)中色谱柱为PrevailTMCarbohydrateES色谱柱。

7.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于，其中，步骤(3)中流动相的流速为0.8mL/min，柱温30℃。

8.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于，其中，ELSD检测器漂移管温度为60℃,气压30psi。

9.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于，其中，步骤(1)中混合对照品溶液中果糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖和Gal‐Gal‐Glu‐Fru四糖的浓度分别为每毫升含上述物质0.5、0.5、0.5、0.3和2.5mg。

10.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)对照品溶液的制备

精密称取经五氧化二磷干燥过的果糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖和Gal‐Gal‐Glu‐Fru四糖对照品适量，加水制得每毫升含上述物质分别为0.5、0.5、0.5、0.3和2.5mg的混合对照品溶液，

(2)供试品溶液的制备

取复方丹参浸膏0.5g，精密称定，加水20ml，超声溶解，上至ProElutPLS，0.5g.6mL‐1固相萃取柱，再用水洗涤固相萃取柱，收集上样液和洗涤流出液，合并，转移至50ml量瓶中，加水至刻度，混匀，取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定即得，

(3)测定法：

分别精密吸取混合对照品溶液5μl、10μl，供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程分别计算果糖、葡萄糖、蔗糖、Glu‐Fru‐Gal三糖和Gal‐Gal‐Glu‐Fru四糖的含量，即得，

其中，色谱条件如下：

PrevailTMCarbohydrateES色谱柱，

乙腈和0.1％甲酸水为流动相梯度洗脱，梯度程序如下：

流速为0.8mL/min,柱温30℃。

ELSD检测器漂移管温度为60℃,气压30psi。