CN109001316A - 一种马蹄蕨多糖中果糖和d-无水葡萄糖的含量测定 - Google Patents

一种马蹄蕨多糖中果糖和d-无水葡萄糖的含量测定 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种马蹄蕨多糖中果糖和D‑无水葡萄糖的含量测定，包括以下步骤：首先制备马蹄蕨多糖；其次，进行样品溶液的制备：取马蹄蕨多糖，置容量瓶中，加入水，于水浴中加热，取出，超声提取，放冷，流动相定容至刻度，摇匀，过滤，取续滤液用0.45μm微孔滤膜滤过，即得样品溶液；最后进行样品测定，色谱条件：采用ZORBAX NH2色谱柱，柱温为40℃，流动相：乙腈－水(72：28)，流速为0.8mL/min，进样量为10μL；蒸发光散射检测器的检测条件：漂移管温度为50℃，载气流速为2.0L/min，增益为1；本发明中的检测方法既能对马蹄蕨多糖中各单糖进行分离，又可对其中某些已知单糖成分进行定量分析，且方法简单，灵敏度、稳定性和准确度较高。

Description

一种马蹄蕨多糖中果糖和D-无水葡萄糖的含量测定
技术领域
本发明涉及药材检测技术领域，更具体的说是涉及一种马蹄蕨多糖中果糖和D-无水葡萄糖的含量测定。
背景技术
马蹄蕨，观音座莲科植物福建莲座蕨(Angiopteris fokiensis Hieron.),又名牛蹄劳(《中国植物志》)，马蹄树、地莲花(《湖南药物志》)，马蹄附子(《广西药植名录》)等。通常以带叶柄的根茎人药。作为极具广西民族特色区域习用中草药，具有消炎止痛、清热解毒、利湿、凉血止血等功效；主治肠炎、痢疾、胃痛、胃十二指肠溃疡、肺结核咯血、肾炎水肿、功能性子宫出血、风湿性关节炎、淋巴结结核、淋巴结炎、跌打损伤、痈疮肿毒、枪炮伤、毒蛇毒虫咬伤，在民间具有较为广泛的应用基础。
对马蹄蕨化学成分研究过程中发现，马蹄蕨中含有大量的多糖成分。众所周知，植物多糖是一种高活性的免疫调节剂，它的作用几乎涉及到机体免疫系统的各个方面。其作为一种低毒高效的天然药物，具有无可比拟的开发应用价值。
目前植物多糖的质量控制仍然是以显色后紫外测定为主要手段，这类方法测得的是以葡萄糖作为折算的总多糖含量，因其能反映一定的质量指标，操作简单，故应用较为广泛。但是，该方法选择性差，无法对总多糖中各种单糖进行定性定量分析。
因此，研究一种方法简单、灵敏度高的对马蹄蕨中果糖和D－无水葡萄糖的含量测定方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种马蹄蕨多糖中果糖和D-无水葡萄糖的含量测定。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种马蹄蕨多糖中果糖和D-无水葡萄糖的含量测定，包括以下步骤：
(1)马蹄蕨多糖制备
(1.1)提取：将马蹄蕨切片晒干，乙醇回流提取，过滤获得药渣，所述药渣晾干后加水浸提，过滤获得滤液，将滤液浓缩，浓缩液中缓慢加入乙醇，密封静置，收集沉淀，冷冻干燥，即得马蹄蕨粗多糖；
(1.2)纯化：取马蹄蕨粗多糖使用蒸馏水溶解，加入氯仿-正丁醇混合液，振荡，离心去除蛋白乳化层，得到上清液；将上清液纯化，洗脱，用蒽酮-硫酸法跟踪检测，合并所有正态峰的收集液，透析，减压浓缩，冷冻干燥，即得马蹄蕨多糖；
(2)对照品溶液和供试样品溶液的制备
(2.1)对照品溶液制备
取果糖、D－无水葡萄糖分别置于容量瓶中，以乙腈－水溶解并定容至刻度，配制成对照品储备液，备用，不同浓度的对照品溶液由储备液稀释得到；
(2.2)供试样品溶液制备
取步骤(2.2)纯化后的马蹄蕨多糖，置容量瓶中，加入水，于水浴中加
热，取出，超声提取、冷却，流动相定容至刻度，摇匀，过滤，取续滤液用0.45μm微孔滤膜滤过，即得样品溶液；
(3)样品测定
色谱条件：
采用ZORBAXNH2色谱柱，柱温为40℃，流动相：乙腈－水(72：28)，
流速为0.8mL/min，进样量为10μL；
蒸发光散射检测器的检测条件：
漂移管温度为50℃，载气流速为2.0L/min，增益为1。
本发明有益效果：本发明中建立同时测定马蹄蕨多糖中2种单糖的高效液相色谱方法，采用NH2色谱柱，以乙腈－水为流动相，蒸发光散射检测器进行含量测定，操作简单，结果准确度高。
优选地，步骤(1.1)中所述乙醇回流提取具体是：加入8倍量乙醇回流提取1-3h，过滤获得药渣；所述药渣晾干后加水浸提具体是：加入8倍量热水浸提3次，每次2h，过滤，合并水浸提后的滤液。
优选地，步骤(1.1)中所述浓缩液加入乙醇使乙醇含量达到75％以上。
优选地，步骤(1.1)中所述密封静置时间为23-25h，所述密封静置温度为23-26℃。
优选地，步骤(1.2)中所述氯仿-正丁醇混合液中氯仿与正丁醇的体积比为(3-4):(1-2)。
优选地，步骤(1.2)中所述离心速率为3800-4200r/min。
优选地，步骤(1.2)中所述洗脱依次采用蒸馏水、NaCl溶液、NaOH溶液作为洗脱液洗脱，所述NaCl溶液的浓度为0.18-0.20mol/L，所述NaOH溶液的浓度为0.18-0.20mol/L。
优选地，步骤(1.2)中所述透析时间为22-24h。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种采用高效液相色谱-蒸发光散射法检测马蹄蕨多糖，既能对马蹄蕨多糖中各单糖进行分离，又可对其中某些已知单糖成分进行定量分析，且方法简单，灵敏度、稳定性和准确度较高。
附图说明
图1附图为对照品测定果糖的高效液相色谱图；
图2附图为对照品测定D-无水葡萄糖的高效液相色谱图；
附图3为样品高效液相色谱图。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
马蹄蕨多糖中果糖和D-无水葡萄糖的含量测定，包括以下步骤：
(1)马蹄蕨多糖制备
(1.1)提取：将马蹄蕨切片晒干，加入8倍量的乙醇回流提取2h，过滤，药渣晾干；药渣采用8倍量45℃热水浸提3次，每次浸提2h，过滤，合并滤液，浓缩滤液后加入乙醇，使乙醇含量达到75％，密封静置24h，收集沉淀，冷冻干燥，即得马蹄蕨粗多糖；
(1.2)纯化：取马蹄蕨粗多糖使用蒸馏水溶解，加入氯仿-正丁醇混合液，振荡，使蛋白质析出，以4000r/min离心，除去蛋白乳化层得到上清液，离心3次获得上清液；将上清液采用DEAE-52纤维素柱进行纯化，洗脱，用蒽酮-硫酸法跟踪检测，合并所有正态峰的收集液，采用透析膜透析24h，减压浓缩，冷冻干燥，即得马蹄蕨多糖；
(2)对照品溶液和供试样品溶液的制备
(2.1)对照品溶液制备
取果糖、D－无水葡萄糖分别置于容量瓶中，以乙腈－水溶解并定容至刻度，配制成对照品储备液，备用，不同浓度的对照品溶液由储备液稀释得到；
(2.2)供试样品溶液制备
取步骤(2.2)纯化后的马蹄蕨多糖0.5g，置于20mL容量瓶中，加入10mL 水，于60℃水浴中加热5min，取出，超声提取10min，放冷，流动相定容至刻度，摇匀，过滤，取续滤液用0.45μm微孔滤膜滤过，即得样品溶液；
(4)样品测定
色谱条件：
采用ZORBAXNH2(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱，柱温为40℃，流动相：乙腈－水(72：28)，流速为0.8mL/min，进样量为10μL；
蒸发光散射检测器的检测条件：
漂移管温度为50℃，载气流速为2.0L/min，增益为1。
实验结果如图1-3，附图1-2分别为对照品测定果糖及D-无水葡萄糖的高效液相色谱图；附图3为样品高效液相色谱图。
结果分析
1、分别精密吸取对照品溶液各0.5mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、5.0mL、10.0mL，置10mL量瓶中，用乙腈－水(50：50)定容至刻度，配制成曲线 L1-L6，见表1。按照实施例1中的色谱条件及蒸发光散射检测器的检测条件进行测定，以峰面积比值(Y)为纵坐标，以各待测物质量浓度(X)为横坐标，分别绘制标准曲线，线性方程见表2。结果表明，各成分在各自的线性范围内呈良好的线性关系。
表1 2种对照品溶液的质量浓度(μg/mL)
化合物名称 1 2 3 4 5 6
果糖 54.47 108.94 217.88 326.83 544.71 1089.42
D－无水葡萄糖 62.15 124.30 248.59 372.89 621.48 1242.96
表2回归方程及线性范围
化合物名称 回归方程 相关系数(R) 线性范围/(μg/mL)
果糖 y＝6332.5*x-743.8 0.9997 54.47～1089.42
D－无水葡萄糖 y＝8056.7*x+3907.2 0.9996 62.15～1242.96
2、精密度试验
取样品溶液，按照实施例1中的色谱条件及蒸发光散射检测器的检测条件连续进样6次，结果显示，果糖和D－无水葡萄糖峰面积的RSD(n＝6)分别为0.53％和1.18％，表明仪器精密度良好。
3、重复性试验
制备供试品溶液6份，按照实施例1中的色谱条件及蒸发光散射检测器的检测条件测定。结果显示果糖和D－无水葡萄糖含量的RSD(n＝6)分别为1.30％和2.52％，表明本方法重复性良好。
4、稳定性试验
取一份供试品溶液，分别于0，1，2，5，8，15h进行测定，结果显示果糖和D－无水葡萄糖峰面积的RSD(n＝6)分别为0.99％和1.67％，表明供试液在15h内稳定。
5、加样回收试验
称取马蹄蕨多糖0.25g，精密称定，平行6份，精密加入对照品储备液各 1.5mL。将样品溶液溶液，进样测定，以(测得量－基础量)/加入量×100％计算回收率。马蹄蕨多糖中果糖和D－无水葡萄糖的平均加样回收率(n＝6)分别为97.4％(RSD＝1.7％)和99.5％(RSD＝2.2％)。结果见表3。
表3加样回收率试验结果
6、样品测定
取样品溶液，按实施例1中的色谱条件进行测定，测得马蹄蕨多糖中果糖和D－无水葡萄糖的含量分别为6.86mg/g和6.83mg/g。
上述结果分析中可得本发明中的检测方法既能对马蹄蕨多糖中各单糖进行分离，又可对其中某些已知单糖成分进行定量分析，且方法简单，灵敏度、稳定性和准确度较高。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (8)

1.一种马蹄蕨多糖中果糖和D-无水葡萄糖的含量测定，其特征在于，包括以下步骤：
(1)马蹄蕨多糖制备
(1.1)提取：将马蹄蕨切片晒干，乙醇回流提取，过滤获得药渣，所述药渣晾干后加水浸提，过滤获得滤液，将滤液浓缩，浓缩液中缓慢加入乙醇，密封静置，收集沉淀，冷冻干燥，即得马蹄蕨粗多糖；
(1.2)纯化：取马蹄蕨粗多糖使用蒸馏水溶解，加入氯仿-正丁醇混合液，振荡，离心去除蛋白乳化层，得到上清液；将上清液纯化，洗脱，用蒽酮-硫酸法跟踪检测，合并所有正态峰的收集液，透析，减压浓缩，冷冻干燥，即得马蹄蕨多糖；
(2)对照品溶液和供试样品溶液的制备
(2.1)对照品溶液制备
取果糖、D－无水葡萄糖分别置于容量瓶中，以乙腈－水溶解并定容至刻度，配制成对照品储备液，备用，不同浓度的对照品溶液由储备液稀释得到；
(2.2)供试样品溶液制备
取步骤(2.2)纯化后的马蹄蕨多糖，置容量瓶中，加入水，于水浴中加热，取出，超声提取、冷却，流动相定容至刻度，摇匀，过滤，取续滤液用0.45μm微孔滤膜滤过，即得样品溶液；
(3)样品测定
色谱条件：
采用ZORBAX NH2色谱柱，柱温为40℃，流动相：乙腈－水(72：28)，流速为0.8mL/min，进样量为10μL；
蒸发光散射检测器的检测条件：
漂移管温度为50℃，载气流速为2.0L/min，增益为1。
2.根据权利要求1所述的一种马蹄蕨多糖中果糖和D-无水葡萄糖的含量测定，其特征在于，步骤(1.1)中所述乙醇回流提取具体是：加入8倍量乙醇回流提取1-3h，过滤获得药渣；所述药渣晾干后加水浸提具体是：加入8倍量热水浸提3次，每次2h，过滤，合并水浸提后的滤液。
3.根据权利要求1所述的一种马蹄蕨多糖中果糖和D-无水葡萄糖的含量测定，其特征在于，步骤(1.1)中所述浓缩液加入乙醇使乙醇含量达到75％以上。
4.根据权利要求1所述的一种马蹄蕨多糖中果糖和D-无水葡萄糖的含量测定，其特征在于，步骤(1.1)中所述密封静置时间为23-25h，所述密封静置温度为23-26℃。
5.根据权利要求1所述的一种马蹄蕨多糖中果糖和D-无水葡萄糖的含量测定，其特征在于，步骤(1.2)中所述氯仿-正丁醇混合液中氯仿与正丁醇的体积比为(3-4):(1-2)。
6.根据权利要求1所述的一种马蹄蕨多糖中果糖和D-无水葡萄糖的含量测定，其特征在于，步骤(1.2)中所述离心速率为3800-4200r/min。
7.根据权利要求1至6任一项所述的一种马蹄蕨多糖中果糖和D-无水葡萄糖的含量测定，其特征在于，步骤(1.2)中所述洗脱依次采用蒸馏水、NaCl溶液、NaOH溶液作为洗脱液洗脱，所述NaCl溶液的浓度为0.18-0.20mol/L，所述NaOH溶液的浓度为0.18-0.20mol/L。
8.根据权利要求1至6任一项所述的一种马蹄蕨多糖中果糖和D-无水葡萄糖的含量测定，其特征在于，步骤(1.2)中所述透析时间为22-24h。
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