CN107884483B

CN107884483B - 一种银杏叶及其制剂中黄酮类成分的含量测定方法及用途

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Publication number: CN107884483B
Application number: CN201710887699.1A
Authority: CN
Inventors: 方同华; 许照芹; 项彦华; 席桂才
Original assignee: Harbin Zhenbao Pharmaceutical Co ltd; HEILONGJIANG ZBD PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: Harbin Zhenbao Pharmaceutical Co ltd; HEILONGJIANG ZBD PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2017-09-27
Filing date: 2017-09-27
Publication date: 2020-12-29
Anticipated expiration: 2037-09-27
Also published as: CN107884483A

Abstract

本发明提供了一种银杏叶及其制剂中黄酮类成分的含量测定方法及用途，涉及药物分析领域。该方法包括：通过采用高效液相色谱法检测银杏叶或其制剂的供试品溶液，构建银杏叶指纹图谱；再从银杏叶指纹图谱的共有峰中选取12～16个黄酮类成分，以芦丁、烟花苷和水仙苷为标准品，采用外标法对每个黄酮类成分进行含量测定。通过该方法，可相对准确的得知样品中所含的黄酮类成分的总含量，以及每个具体的黄酮类成分的相对含量，该含量测定方法的灵敏度高、稳定性强，可用于银杏叶及其制剂的质量控制中。

Description

一种银杏叶及其制剂中黄酮类成分的含量测定方法及用途

技术领域

本发明涉及药物分析领域，具体而言，涉及一种银杏叶及其制剂中黄酮类成分的含量测定方法及用途。

背景技术

银杏叶，是舒血宁注射液的原料。银杏叶为银杏科植物银杏的干燥叶，味苦、甘涩、性平、小毒，具有活血化瘀、通络止痛的功效。银杏叶的化学成分很复杂，迄今已发现170多种化合物，主要为黄酮类、萜类、醇类、生物碱类、聚异戊二烯类、多糖等具有药理作用的活性成分，其有毒成分为银杏酸。银杏叶经过提取制备成注射液，用于肺虚咳喘、冠心病、高血脂、抑郁症、糖尿病、神经疾病、记忆障碍、外周血管疾病、间歇性跛行、脑转耳鸣等疾病的治疗。

目前，对银杏叶以及利用银杏叶为原料制成的制剂（例如舒血宁注射液）内黄酮类成分的质量控制研究，仅停留在采用酸水解，测定槲皮素、山柰素、异鼠李素这三个黄酮苷元的含量，然后再折算成总黄酮醇苷的含量的方法，这一方法只能大概知道样品中总黄酮的含量，却不能对样品中的每一个黄酮类成分进行检测，其所得到的检测结果比较含糊，不能准确的反应样品中的每一个黄酮类成分的相对含量，不利于对银杏叶及其制剂进行更为精准的质量控制。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种银杏叶及其制剂中黄酮类成分的含量测定方法，通过该方法，可相对准确的得知样品中所含的黄酮类成分的总含量，以及每个具体的黄酮类成分的相对含量，该含量测定方法的灵敏度高、稳定性强，可用于银杏叶及其制剂的质量控制中。

本发明的第二目的在于提供一种上述含量测定方法在银杏叶及其制剂的质量控制中的用途。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种银杏叶及其制剂中黄酮类成分的含量测定方法，其包括：

通过采用高效液相色谱法检测银杏叶或其制剂的供试品溶液，构建银杏叶指纹图谱；再从银杏叶指纹图谱的共有峰中选取12~16个黄酮类成分，以芦丁、烟花苷和水仙苷为标准品，采用外标法对每个黄酮类成分进行含量测定。

一种上述含量测定方法在银杏叶及其制剂的质量控制中的用途。

与现有技术相比，本发明的有益效果例如包括：

本发明提供的这种银杏叶及其制剂中黄酮类成分的含量测定方法，是基于银杏叶及其制剂的指纹图谱展开的，即选取银杏叶指纹图谱的共有峰中的12~16个黄酮类成分，作为检测对象，以芦丁、烟花苷和水仙苷这三个黄酮苷为标准品，由于银杏叶中所含的主要的黄酮类成分的苷元均与芦丁、烟花苷或水仙苷的苷元一致，因此，用这三个苷元可对银杏叶中所含的主要黄酮类成分进行相对准备的含量测定。因此，利用该方法，可相对准确的得知样品中所含的黄酮类成分的总含量，以及每个具体的黄酮类成分的相对含量，该含量测定方法的灵敏度高、稳定性强，可用于银杏叶及其制剂的质量控制中。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为实验例中银杏叶药材液相色谱图，其中，横坐标为检测时间；纵坐标为响应值。

图2为实验例中银杏叶药材指纹图谱，其中，横坐标为检测时间；纵坐标为响应值。

图3为图2中16种黄酮苷类成分含量分布箱线图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本实施方式提供一种银杏叶及其制剂中黄酮类成分的含量测定方法，其包括：

步骤S1: 通过采用高效液相色谱法检测银杏叶或其制剂的供试品溶液，构建银杏叶指纹图谱。

其中，用银杏叶制备供试品溶液的方法包括：精密称定银杏叶药材，以60~80Vol﹪的甲醇溶液为提取溶剂，水浴回流提取0.4~0.6 h，提取2~3次，合并提取液后定容。

更为优选的，制备供试品溶液的方法包括：精密称定银杏叶药材，以70Vol﹪的甲醇溶液为提取溶剂，水浴回流提取0.5 h，提取2次，合并提取液后定容。

进一步的，构建银杏叶指纹图谱的高效液相色谱条件包括：选择以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以乙腈为流动相A，以0.08~0.12 Vol%的乙酸-水溶液为流动相B，流速为 0.9~1.1mL/min，检测波长为355~365 nm，色谱柱的柱温为38~42℃。

可选的，流动相B为0.1 Vol%的乙酸-水溶液；流速为 1 mL/min；检测波长为360nm，色谱柱的柱温为40℃。

进一步的构建银杏叶指纹图谱的高效液相色谱条件还包括：液相色谱的洗脱程序包括：洗脱时间为0~25min，流动相A为10→25%，流动相B为90→75%；洗脱时间为25~40min，流动相A为25→35%，流动相B为75→65%；洗脱时间为40~45min，流动相A为35→80%，流动相B为65→20%；洗脱时间为45~60min，流动相A为80%，流动相B为20%。

银杏叶指纹图谱的构建方法还包括：精密吸取供试品溶液各10~20μL，采用高效液相色谱法进行检测，记录色谱图；随后将色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，与对照指纹图谱相比较，计算相似度，相似度应不低于0.90。

步骤S2:再从银杏叶指纹图谱的共有峰中选取12~16个黄酮类成分，以芦丁、烟花苷和水仙苷为标准品，采用外标法对每个黄酮类成分进行含量测定。

进一步的，银杏叶指纹图谱中的12~16个黄酮类成分包括：槲皮素-3-O-(2”,6”-α-L-二鼠李糖)-β-D-葡萄糖、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖-2” -(6-对香豆酰基) -β-D-葡萄糖-7-O-β-D-葡萄糖、山奈素-3-O-α-L-鼠李糖-2” -(6”-p-对香豆酰基) -β-D-葡萄糖苷、异鼠李素-3- O-[2,6-di-O-(α-L-二鼠李糖)]-β-D-葡萄糖、芦丁、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-(2”-β-D-葡萄糖)-α-L-鼠李糖苷、烟花苷、水仙苷、异鼠李素-3- O-β-D-葡萄糖苷和山奈素-3-O-葡萄糖鼠李糖苷。

可选的，用标准品中的烟花苷测定山奈素-3-O-α-L-鼠李糖-2” -(6”-p-对香豆酰基) -β-D-葡萄糖苷、烟花苷和山奈素-3-O-葡萄糖鼠李糖苷。由于这三个化合物的苷元均为山奈酚，三者的波谱行为比较类似，因此用烟花苷为标准品能够相对准确的测定银杏叶中上述三种成分的含量。

可选的，用标准品中的水仙苷测定异鼠李素-3-O-[2,6-di-O-(α-L-二鼠李糖)]-β-D-葡萄糖、水仙苷和异鼠李素-3- O-β-D-葡萄糖苷。由于这三个化合物的苷元均为异鼠李素，三者的波谱行为比较类似，因此用烟花苷为标准品能够相对准确的测定银杏叶中上述三种成分的含量。

可选的，用标准品中的芦丁测定槲皮素-3-O-(2”,6”-α-L-二鼠李糖)-β-D-葡萄糖、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖-2” -(6-对香豆酰基) -β-D-葡萄糖-7-O-β-D-葡萄糖、芦丁、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-(2”-β-D-葡萄糖)-α-L-鼠李糖苷。由于上述化合物的苷元均为槲皮素，其波谱行为比较类似，因此用芦丁为标准品能够相对准确的测定银杏叶中上述三种成分的含量。

对每个黄酮类成分进行含量测定的计算方法为：

C=（A_x/A₀）×C₀

其中，C表示待测成分的含量；A_x表示待测成分的色谱峰峰面积；A₀表示标准品的色谱峰峰面积；C₀表示标准品的浓度。

本实施方式还提供一种上述含量测定方法在银杏叶及其制剂的质量控制中的用途。通过上述含量测定方法可相对准确的得知样品中所含的黄酮类成分的总含量，以及每个具体的黄酮类成分的相对含量，因此上述方法可用于银杏叶及其制剂的质量控制，灵敏度和准确度均较佳、稳定性强，操作简单，易于实施。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述：

实施例1

本实施例提供一种银杏叶中黄酮类成分的含量测定方法，其包括：

步骤a: 溶液制备：

供试品溶液制备: 精密称定银杏叶药材粉末，以70Vol﹪的甲醇溶液为提取溶剂，水浴回流提取0.5 h，提取2次，合并提取液后定容。

标准品溶液配制：紧密称取芦丁、烟花苷和水仙苷标准品，用70Vol﹪的甲醇溶液溶解并定容。

步骤b：色谱检测：利用下述色谱条件检测标准品溶液和供试品溶液。

色谱条件：选择以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以乙腈为流动相A，以0.1 Vol%的乙酸-水溶液为流动相B，流速为 1.0 mL/min，检测波长为360 nm，色谱柱的柱温为40℃。

洗脱程序：洗脱时间为0~25min，流动相A为10→25%，流动相B为90→75%；洗脱时间为25~40min，流动相A为25→35%，流动相B为75→65%；洗脱时间为40~45min，流动相A为35→80%，流动相B为65→20%；洗脱时间为45~60min，流动相A为80%，流动相B为20%。

步骤c. 黄酮类成分的测定：以不同浓度的标准品溶液为横坐标，以对应的色谱峰峰面积为纵坐标，绘制标准曲线；再根据供试品溶液的指纹图谱中各个黄酮类成分的峰面积，根据下式对每个所述黄酮类成分进行计算：

C=（A_x/A₀）×C₀

实施例2

步骤a: 溶液制备：

供试品溶液制备: 精密称定银杏叶药材粉末，以60Vol﹪的甲醇溶液为提取溶剂，水浴回流提取0.4 h，提取3次，合并提取液后定容。

标准品溶液配制：紧密称取芦丁、烟花苷和水仙苷标准品，用60Vol﹪的甲醇溶液溶解并定容。

色谱条件：选择以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以乙腈为流动相A，以0.08 Vol%的乙酸-水溶液为流动相B，流速为 1.1mL/min，检测波长为365 nm，色谱柱的柱温为38℃。

本实施例的洗脱程序以及步骤c与实施例1一致。

实施例3

步骤a: 溶液制备：

供试品溶液制备: 精密称定银杏叶药材粉末，以80Vol﹪的甲醇溶液为提取溶剂，水浴回流提取0.6 h，提取2次，合并提取液后定容。

标准品溶液配制：紧密称取芦丁、烟花苷和水仙苷标准品，用80Vol﹪的甲醇溶液溶解并定容。

色谱条件：选择以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以乙腈为流动相A，以0.12 Vol%的乙酸-水溶液为流动相B，流速为 0.9mL/min，检测波长为355 nm，色谱柱的柱温为42℃。

本实施例的洗脱程序以及步骤c与实施例1一致。

实验例

下面结合试验数据对本发明实施例提供的银杏叶中黄酮类成分的含量测定方法进行评价。

1.色谱条件：Agilent l 200型高效液相色谱仪；色谱柱Phenomenex C18(250mm×4.6mm 5μm)；以乙腈为流动相A，以0.1 Vol%的乙酸-水溶液为流动相B，流速为 1.0 mL/min，检测波长为360 nm，色谱柱的柱温为40℃，梯度洗脱程序如表1所示：

表1. 梯度洗脱程序

2.标准曲线的绘制

精密称取芦丁、烟花苷、水仙苷对照品 6.80mg、5.62mg、5.93mg，用70%的甲醇溶液定容至 25mL。依次稀释不同倍数，精密吸取 20μL 注入高效液相色谱仪，记录峰面积。以浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，绘得标准曲线，采用信噪比法测定其定量限、检测限，结果见表2：

表2. 三个对照品溶液的线性关系及定量限、检测限

3.供试品溶液制备：

银杏叶指纹图谱供试品溶液制备方法为：精密称取银杏叶药材粉末（过4号筛）1.000g，置于圆底烧瓶中，精密加入20 mL 70%甲醇，水浴回流（100℃）提取两次提取液，转移到50mL容量瓶中，冷却至室温后，以70%甲醇定容，摇匀，过0.45 μm滤膜，取续滤液即得供试品溶液。

4.银杏叶药材指纹图谱：

利用上述色谱条件检测供试品溶液，得到银杏叶药材指纹图谱，如图1所示。从图1中可见各个色谱峰基本都能保持基线分离，且经发明人研究，归属了10个色谱峰，分别为：

1号峰：槲皮素-3-O-(2",6"-α-L-二鼠李糖)-β-D-葡萄糖；

2号峰：槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖-2"-(6-对香豆酰基)-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-葡萄糖；山柰素

3号峰：山柰素-3-O-α-L-鼠李糖-2"-(6"-p-对香豆酰基)-β-D-葡萄糖苷；

4号峰：异鼠李素-3-O- [2,6-di-O-(α-L-二鼠李糖)]-β-D-葡萄糖；

5号峰：芦丁(槲皮素-3-O-β-D-芸香糖苷)；

7号峰：槲皮素-3-O-葡萄糖苷；

8号峰：槲皮素-3-O-(2"-β-D 葡萄糖)-α-L-鼠李糖苷；

9号峰：烟花苷(山柰素-3-O-芸香糖苷)；

10号峰：水仙苷(异鼠李素-3-O-芸香糖苷)；

11号峰：异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷；

12号峰：山柰素-3-O-葡萄糖鼠李糖苷

5.方法学考察：

（1）精密度考察：按上述确定的提取方法及色谱条件，制备供试品溶液1份，连续进样6次，记录14个较大的共有色谱峰的保留时间和峰面积，考察色谱峰峰面积的一致性，结果见表3：

结果表明，精密度试验各色谱峰的峰面积RSD%小于5%，故方法采用的HPLC仪器及整体系统精密度良好，分析结果稳定、可靠。

表3. 银杏叶药材指纹图谱精密度考察峰面积计算结果（n=6）

（2）稳定性考察：

按上述确定的提取方法及色谱条件，制备供试品溶液1份，考察样品0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h的稳定性，记录14个较大的共有色谱峰的保留时间和峰面积，考察色谱峰峰面积的一致性。

结果表明，稳定性试验各色谱峰的峰面积RSD%小于5%，供试品溶液在室温下放置24小时稳定性良好。

（3）重复性考察：

按上述确定的提取方法及色谱条件，取同一批次银杏叶药材粉末，平行制备6份供试品溶液进行测定，记录各共有色谱峰峰面积，考察色谱峰峰面积的一致性。

结果表明，重复性试验各色谱峰的峰面积RSD%小于5%，故方法重复性良好，分析结果稳定、可信。

综上所述，该银杏叶药材指纹图谱含量测定方法具有较好的精密度、重现性，在24h内样品稳定，可获得稳定、可靠的定量指纹图谱。

6.含量测定及计算方法

从如图2所示的银杏叶指纹图谱共有峰中选取除双黄酮外16个含量较大的黄酮类成分进行定量研究。

图2中，3号峰为槲皮素-3-O-(2",6"-α-L-二鼠李糖)-β-D-葡萄糖; 5号峰为槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖-2"-(6-对香豆酰基)-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-葡萄糖;5号峰为山柰素-3-O-α-L-鼠李糖-2"-(6"-p-对香豆酰基)-β-D-葡萄糖苷; 6号峰为异鼠李素-3-O- [2,6-di-O-(α-L-二鼠李糖)]-β-D-葡萄糖; 7号峰为芦丁(槲皮素-3-O-β-D-芸香糖苷); 9号峰为槲皮素-3-O-葡萄糖苷; 10号峰为槲皮素-3-O-(2"-β-D 葡萄糖)-α-L-鼠李糖苷; 11号峰为烟花苷(山柰素-3-O-芸香糖苷); 12号峰为水仙苷(异鼠李素-3-O-芸香糖苷); 13号峰为异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷; 14号峰为山柰素-3-O-葡萄糖鼠李糖苷。

通过定性研究结果可知，1、2、3、4、7、8、9、10、15、16 号峰的苷元与芦丁（7 号峰）同为槲皮素，5、11、14 号峰的苷元均与烟花苷（11号峰）同为山奈酚，而 6、12、13 号峰的苷元均与水仙苷（12 号峰）同为异鼠李素，因此分别用芦丁、烟花苷和水仙苷对其余13个黄酮类成分采用外标法按下式进行相对定量：

C=（A_x/A₀）×C₀

其中，C表示待测成分的含量；A_x表示待测成分的色谱峰峰面积；A0表示标准品的色谱峰峰面积；C0表示标准品的浓度。

结果如图3所示，银杏叶总黄酮类成分平均值为5.047mg/g，其百分含量在0.21%~0.72%之间，其平均含量为0.50%，大于药典银杏叶中银杏总黄酮醇苷含量不低于0.4%的要求。

本发明所建立的银杏叶药材黄酮类成分指纹图谱记录了 60min 内的色谱峰，选定其中22个色谱峰为共有峰，并测定了其中16个黄酮苷类成分的含量，据文献报道，结合已有的研究基础初步判定19~22号峰为双黄酮类成分，此类成分虽然不是制剂中主要的有效活性成分，但从指纹图谱中可看出其在银杏叶中含量也较高，因此本实验所建立的方法不但在样品处理中保留了双黄酮类成分，而且实现了一张指纹图谱同时反映黄酮苷和双黄酮两类成分信息。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims

1.一种银杏叶及其制剂中黄酮类成分的含量测定方法，其特征在于，其包括：

通过采用高效液相色谱法检测银杏叶或其制剂的供试品溶液，构建银杏叶指纹图谱；再从所述银杏叶指纹图谱的共有峰中选取12~16个黄酮类成分，以芦丁、烟花苷和水仙苷为标准品，采用外标法对每个所述黄酮类成分进行含量测定；用标准品中的烟花苷测定山奈素-3-O-α-L-鼠李糖-2” -(6”-p-对香豆酰基) -β-D-葡萄糖苷、烟花苷和山奈素-3-O-葡萄糖鼠李糖苷；用标准品中的水仙苷测定异鼠李素-3-O-[2,6-di-O-(α-L-二鼠李糖)]-β-D-葡萄糖、水仙苷和异鼠李素-3- O-β-D-葡萄糖苷；芦丁测定槲皮素-3-O-(2”,6”-α-L-二鼠李糖)-β-D-葡萄糖、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖-2” -(6-对香豆酰基) -β-D-葡萄糖-7-O-β-D-葡萄糖、芦丁、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-(2”-β-D-葡萄糖)-α-L-鼠李糖苷;所述银杏叶指纹图谱中的12~16个所述黄酮类成分包括：槲皮素-3-O-(2”,6”-α-L-二鼠李糖)-β-D-葡萄糖、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖-2” -(6-对香豆酰基) -β-D-葡萄糖-7-O-β-D-葡萄糖、山奈素-3-O-α-L-鼠李糖-2” -(6”-p-对香豆酰基) -β-D-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-[2,6-di-O-(α-L-二鼠李糖)]-β-D-葡萄糖、芦丁、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-(2”-β-D-葡萄糖)-α-L-鼠李糖苷、烟花苷、水仙苷、异鼠李素-3- O-β-D-葡萄糖苷和山奈素-3-O-葡萄糖鼠李糖苷;对每个所述黄酮类成分进行含量测定的计算方法为：

C=（A_x/A₀）×C₀

其中，C表示待测成分的含量；A_x表示待测成分的色谱峰峰面积；A₀表示标准品的色谱峰峰面积；C₀表示标准品的浓度;构建所述银杏叶指纹图谱的高效液相色谱条件包括：选择以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以乙腈为流动相A，以0.08~0.12 Vol%的乙酸-水溶液为流动相B，流速为 0.9~1.1mL/min，检测波长为355~365 nm，所述色谱柱的柱温为38~42℃;构建所述银杏叶指纹图谱的高效液相色谱条件还包括：

洗脱时间为0~25min，所述流动相A为10→25%，所述流动相B为90→75%；洗脱时间为25~40min，所述流动相A为25→35%，所述流动相B为75→65%；洗脱时间为40~45min，所述流动相A为35→80%，所述流动相B为65→20%；洗脱时间为45~60min，所述流动相A为80%，所述流动相B为20%;所述银杏叶指纹图谱的构建方法还包括：精密吸取供试品溶液各10~20μL，采用高效液相色谱法进行检测，记录色谱图；随后将所述色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，与对照指纹图谱相比较，计算相似度，相似度应不低于0.90。

2.根据权利要求1所述的银杏叶及其制剂中黄酮类成分的含量测定方法，其特征在于，用银杏叶制备所述供试品溶液的方法包括：精密称定银杏叶药材，以60~80Vol﹪的甲醇溶液为提取溶剂，水浴回流提取0.4~0.6 h，提取2~3次，合并提取液后定容。

3.如权利要求1或2所述的含量测定方法在银杏叶及其制剂的质量控制中的用途。