CN111665306A - 一种野山杏果肉黄酮类化合物的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种野山杏果肉黄酮类化合物的测定方法，建立同时分析测定新疆野山杏果肉中4种黄酮类化合物的高效液相色谱分析方法。采用Hubble C18色谱柱，流动相甲醇:0.5％磷酸水溶液＝45:55，在1.0ml/min流速下等度洗脱，分离新疆野山杏果肉中4种黄酮类化合物，通过仪器精密度、稳定性、重复性及添加回收率对该方法进行验证。芦丁、槲皮素、原花青素3种黄酮成分色谱峰在20min内分离度良好，线性范围为0.52～56μg/mL，加样回收率为92.13％～96.70％，RSD为0.89％～1.96％。该方法简便、快速、准确、稳定性及重复性好，适合推广应用。
Description
技术领域
本发明属于分析化学技术领域，具体地说，涉及一种野山杏果肉黄酮类化合物的测定方法。
背景技术
野山杏〔Armeniaca sibirica(L.)Lam.〕果肉中含有多种黄酮类化合物，黄酮类化合物具有多种生物活性及药理作用，也是许多中草药的有效成分，具有很高的药用价值。近年来国内外学者对黄酮及黄酮类化合物的不同分析检测方法进行了探究，其高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)具有灵敏度高、流动相和色谱柱选择范围广、分析速度快、流出组分易收集等特点，故选择该方法进行成分分析较普遍。如张元梅等研究利用高效液相法同时检测柑橘果实中18种黄酮类化合物的含量，具有良好的分离效果；左月明等等采用RP-HPLC法在40min内梯度洗脱同时检测出三白草药材中芦丁、槲皮素等黄酮类化合物的含量；WANG等在流速1.0ml/min下梯度洗脱25min内同时分离检测冷蒿地上部分7种黄酮类化合物含量。关于野山杏黄酮及黄酮化合物的提取及分离方面报道较少，故本发明拟通过高效液相色谱法建立一种简便、快速、准确的测定方法。
发明内容
本发明的目的在于提出了一种野山杏果肉黄酮类化合物的测定方法，该方法采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)法，通过考察检测波长、流动相、流速、柱温等因素确定色谱条件，通过系统适用性试验、精密度实验、稳定性实验、重复性实验、加样回收率实验等对野山杏果肉中4种黄酮类化合物的含量分析方法进行验证。本发明为进一步探讨新疆野山杏总黄酮的提取分离奠定实验基础，为开发利用新疆特色药食同源植物提供理论依据。
其技术方案如下：
一种野山杏果肉黄酮类化合物的测定方法，包括以下步骤：
步骤1、溶液的制备
1.1)对照品溶液的配制
称取原花青素、芦丁、柚皮苷二氢查尔酮、槲皮素4种对照品各10.00±0.20mg，用甲醇溶解并分别定容至25mL容量瓶中，摇匀，即得对照品溶液。
1.2)混标储备液
分别取上述步骤1.1)中溶液各2.50mL，混合均匀，制得含有原花青素106.00ug/ml、芦丁103.00ug/ml、柚皮苷二氢查尔酮112.00ug/mL、槲皮素104.00ug/ml的混标储备液。
1.3)混标中间液
准确量取5mL混标溶液甲醇定容至10mL，制得含有原花青素53.00ug/ml、芦丁51.50ug/ml、柚皮苷二氢查尔酮56.00ug/mL、槲皮素52.00ug/ml混标中间液。
1.4)混标标准工作液
分别取0.25、0.50、1.00、2.00mL中间液甲醇定容至10ml容量瓶，摇匀，配制标准工作液上机待测。
1.5)供试品溶液的配制
取1g野山杏干燥果肉，粉碎，过40目筛，加50％乙醇(料液比1:50)，70℃下超声1h，超声提取2次，抽滤，合并滤液旋蒸浓缩后，用甲醇定容至10mL，摇匀，制成供试品溶液，测定前用微孔滤膜(0.22μm)过滤，备用。
步骤2、色谱条件
2.1)检测波长
取上述对照品溶液，采用二极管阵列检测器对各成分吸收峰进行扫描，通过3D图谱对各对照品的吸收峰进行分析，确定对照品溶液的最大吸收波长为273nm。
2.2)流动相
采用甲醇-磷酸水溶液作为流动相。
2.3)流速
在固定相和流动相不变的情况下，流速为0.6-1.2mL/min；
2.4)柱温
在流动相和固定相不变的情况下，柱温为25-35℃；
步骤3数据处理
采用Excel 2010、SigmaPlot 12.0软件进行数据分析。
进一步，步骤2中，所述的色谱条件为：Hubble C18，4.6mm×250mm，5μm色谱柱，流动相A甲醇:B0.5％磷酸水溶液＝45:55，以1.0mL/min流速进行等度洗脱，柱温箱的温度为35℃，检测波长为273nm，进样量为10μL。
进一步，芦丁、槲皮素、原花青素3种黄酮成分色谱峰在20min内分离度良好，线性范围为0.52～56μg/mL，r＝0.999 8～1，加样回收率为92.13％～96.70％，RSD为0.89％～1.96％。
本发明的有益效果为：
本发明的测定方法简便、快速、准确、稳定性及重复性好，适用于新疆野山杏果肉中芦丁等3种黄酮类化合物的分离测定。
附图说明
图1为在二极管阵列检测器(DAD)中各对照品吸收峰3D图谱，其中，(a)原花青素，(b)芦丁，(c)柚皮苷二氢查尔酮，(d)槲皮素；
图2为不同流速对各黄酮成分保留时间的影响；
图3为不同温度对各黄酮成分保留时间的影响；
图4为溶剂空白色谱峰；
图5为四种黄酮对照品色谱峰，其中，1.原花青素；2.芦丁；3.柚皮苷二氢查尔酮；4槲皮素；
图6为新疆野山杏黄酮供试品色谱峰，其中，1.原花青素；2.芦丁；3.柚皮苷二氢查尔酮；4槲皮素。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
1仪器与材料
1.1仪器与设备
Hubble C18(1.6mm×250mm，5μm)色谱柱；高效液相色谱系统:岛津LC-20A型高效液相色谱仪、SPD-20A型检测器、SIL-20A型进样器、LC-20AT型输液泵、CTO-20A型柱温箱(日本岛津公司)。
1.2材料及试剂
野山杏果实采自新疆哈密伊吾县，经新疆农业大学食药学院药用植物实验室鉴定为野山杏〔Armeniaca sibirica(L.)Lam.〕的干燥果肉。芦丁(批号Y22S6S3719，纯度为98％)、原花青素(批号Y22F7Y17095，纯度为95％)、槲皮素(批号C20J6Y1722，纯度为98％)、柚皮苷二氢查尔酮(批号H05S6K3043，纯度为98％)均购自上海源叶生物科技有限公司；甲醇(色谱纯)、磷酸(分析纯)。
2方法与结果
2.1溶液的制备
2.1.1对照品溶液的配制
称取原花青素、芦丁、柚皮苷二氢查尔酮、槲皮素4种对照品各10.00±0.20mg，用甲醇溶解并分别定容至25mL容量瓶中，摇匀，即得对照品溶液。
2.1.2混标储备液
分别取上述2.1.1溶液各2.50mL，混合均匀，制得含有原花青素106.00ug/ml、芦丁103.00ug/ml、柚皮苷二氢查尔酮112.00ug/mL、槲皮素104.00ug/ml的混标储备液。
2.1.3混标中间液
准确量取5mL混标溶液甲醇定容至10mL，制得含有原花青素53.00ug/ml、芦丁51.50ug/ml、柚皮苷二氢查尔酮56.00ug/mL、槲皮素52.00ug/ml混标中间液。
2.1.4混标标准工作液
分别取0.25、0.50、1.00、2.00mL中间液甲醇定容至10ml容量瓶，摇匀，配制标准工作液上机待测。
2.1.5供试品溶液的配制
取1g野山杏干燥果肉，粉碎，过40目筛，加50％乙醇(料液比1:50)，70℃下超声1h，超声提取2次，抽滤，合并滤液旋蒸浓缩后，用甲醇定容至10mL，摇匀，制成供试品溶液，测定前用微孔滤膜(0.22μm)过滤，备用。
2.2色谱条件的优化
2.2.1检测波长的选择
取上述对照品溶液，采用二极管阵列检测器对各成分吸收峰进行扫描，通过3D图谱对各对照品的吸收峰进行分析，确定对照品溶液的最大吸收波长。由图1经分析可知，原花青素、芦丁、柚皮苷二氢查尔酮、槲皮素4种黄酮类化合物均在270nm左右有共同的吸收峰带，经分析比照后得到对照品混合溶液最大吸收波长为273nm。
2.2.2流动相的选择
黄酮类化合物都微溶于水，同时溶于有机溶剂，在C18色谱柱应用中，选用甲醇-水溶液作流动相时分离黄酮类化合物效果最佳。根据待测物的理化性质及文献报道，采用甲醇-磷酸水溶液作为流动相。
2.2.3流速的选择
流动相流速的改变会严重影响组分的分离。所以本实验设定，在固定相和流动相不变的情况下，考察0.6、0.8、1.0、1.2mL/min四种不同流速下色谱峰分离情况进行考察，具体如图2所示。
2.2.4柱温的选择
温度会加剧分子间的热运动对流体粘度及压力差产生影响，所以柱温的选择应该作为考虑的因素之一。为选择合适的柱温，本实验在流动相和固定相不变的情况下，分别在25℃、30℃、35℃下，以出峰时间为测定依据，考察不同柱温对色谱峰的影响，具体如图3所示。
2.2.5色谱条件
通过预实验可知，Hubble C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱，流动相A(甲醇):B(0.5％磷酸水溶液)＝45:55，以1.0mL/min流速进行等度洗脱，柱温箱的温度为35℃，检测波长为273nm，进样量为10μL。图5为该优化条件下测定的黄酮对照品色谱图，图6为该优化条件下测定的样品黄酮色谱图，可见在此条件下，4种黄酮分离度较好。
2.3数据处理
采用Excel 2010、SigmaPlot 12.0软件进行数据分析。
2.4方法学考察
2.4.1系统适用性试验
在2.2.5色谱条件下，取各对照品溶液、供试品溶液、溶剂空白依次进样，图4、图5、图6结果表明溶剂空白和对照品、样品溶液无干扰作用，则检测条件符合要求。
2.4.2标准曲线的制备
精密移取2.1.3项、2.1.4项的溶液，得到不同浓度的混合对照品溶液，采用优化的色谱条件，测定新疆野山杏果肉中4种黄酮类化合物成分的峰面积，以各对照品溶液中黄酮成分浓度为横坐标(x)、峰面积值为纵坐标(y)，制作标准曲线图并计算线性回归方程。由表1可知，本方法测定野山杏果实中原花青素、芦丁、柚皮苷二氢查尔酮、槲皮素在各自浓度范围内具有良好的线性关系。
表1标准曲线方程(n＝6)
Table 1 Quation of standard curve line(n＝6)
2.4.3精密度实验
精密移取2.1.4项黄酮混合对照品，并连续6次进样，测定峰面积并计算RSD值。由表2可知，原花青素、芦丁、柚皮苷二氢查尔酮、槲皮素峰面积分别为0.88％、0.14％、0.14％、0.44％(n＝6)，精密度良好，符合实验要求。
表2精密度实验结果(n＝6)
Table 2 Result of Precision experiment(n＝6)
2.4.4稳定性实验
取2.1.5项供试品溶液，供试品溶液6份，按优化的色谱条件，分别于0、1、2、4、6、8h测定峰面积。结果表明，供试品溶液的色谱峰面积没有明显改变。分别计算原花青素、芦丁、柚皮苷二氢查尔酮、槲皮素峰面积的RSD值分别为1.82％、0.77％、未检出、1.93％(n＝6)，由表3可知原花青素、芦丁和槲皮素稳定性良好。
表3稳定性实验结果(n＝6)
Table 3 Result of stability experiment(n＝6)
注:—表示未检出
Note:—indicates not detected
2.4.5重复性实验
取2.1.5项同一供试品溶液，在色谱条件下，连续进样6次，测定得到峰面积。以各待测成分峰面积为指标，计算原花青素、芦丁、柚皮苷二氢查尔酮、槲皮素峰面积的RSD值分别为1.88％、2.69％、未检出、3.31％(n＝6)，表明本方法检测原花青素、芦丁和槲皮素重复性较好。
表4重复性实验结果(n＝6)
Table 4 Result of reproducibility experiment(n＝6)
注:—表示未检出
Note:—indicates not detected
2.4.6加样回收率实验
称取野山杏果肉粉末1.0g，按照2.1.5项制备供试品溶液，进样量10μL。按高、中、低3个浓度水平进行加样回收实验，且每个浓度平行3次。由表5结果可知，除柚皮苷未检出，槲皮素低、中组未检出，各黄酮类化合物成分的加样回收率在92.13％～96.70％之间，说明黄酮类化合物成分原花青素和芦丁的回收率良好。
表5样品加标回收率实验结果(n＝3)
Table 5 Result of recovery experiment(n＝3)
2.4.7样品含量测定
称取6份同一野山杏果肉干燥粉末，按2.1.5项制备供试品溶液。用微孔滤膜(0.22μm)过滤并根据色谱条件进样测定。由表6可知新疆野山杏果肉中4种黄酮类化合物成分的含量，其中柚皮苷未检出，槲皮素、原花青素、芦丁含量不等，其中原花青素含量最高。
表6野山杏果肉黄酮成分含量测定结果(n＝6)
Table 6 Result of component content determination of flavonoids inTFWA(n＝6)
注:—表示未检出
Note:—indicates not detected
3分析
从实验方法选择上考虑，紫外可见分光光度法设备简单，但是成分复杂多样时容易受到杂质的影响；毛细管电泳-电化学检测法灵敏度高，准确性好，但实验条件要求高，操作比价繁琐；高效液相色谱法具有高速、高效、高灵敏度等优点，是常用的一种定性定量的分析手段。本实验采用了RP-HPLC法优化了波长、流动相、柱温、流速四个色谱条件，使野山杏果肉中的4种黄酮成分在20min内均得到分离，出峰时间短且分离度良好。分析过程中采用二极管阵列检测器对待测成分吸收峰进行扫描，发现在芦丁、槲皮素在270nm和350nm左右均有两个吸收峰带，原花青素和柚皮苷二氢查尔酮仅在270nm左右有一个吸收峰带，因此，通过对波长3D图谱分析，择273nm作为对照品混合溶液的最佳吸收波长。
野山杏果肉中含有丰富的黄酮类化合物，但不同地区以及不同部位黄酮的含量和种类有一定差异，用RP-HPLC法分析野山杏黄酮类成分的报道较少。通过文献查阅发现，使用相同方法和相同研究对象的是课题组成员使用RP-HPLC法对野山杏果肉中10种有机酸成分进行了考察分析；通过和现有技术对比发现本实验测定的芦丁含量是远远高于文献报道的，故进一步说明不同部位黄酮的含量和种类有一定差异。综上所述，可以建立一种快速的高效液相色谱法来同时检测野山杏果肉中的黄酮类化合物。
在对流动相进行选择时，本实验初步选择水-甲醇系统作为流动相，混合对照品溶液中各成分色谱峰分离效果不佳，后加入磷酸进行调节，直到调节到流动相V甲醇:V 0.5％磷酸溶液＝45:55时，4种黄酮类化合物成分色谱峰在20min内完全分离，峰形对称且分离度良好。
实验中测定的4种成分为三种不同类型的黄酮类化合物，即黄酮醇类、查尔酮类、花色素类，如若要测定野山杏更多类型的黄酮类化合物可在本实验流动相为V甲醇:V0.5％磷酸溶液＝45:55的基础上，调节流动相配比，必要时进行梯度洗脱，就可进一步建立测定分析野山杏多种黄酮化合物成分及含量的方法。
在各黄酮类化合物成分的含量检测中，由于柚皮苷二氢查尔酮在野山杏中含量极低，低于检测限，故在含量检测时未检出，在今后的研究过程中可以进一步探讨同时测定柚皮苷二氢查尔酮含量的最优条件。
4结论
采用RP-HPLC法分析了新疆野山杏果肉中的原花青素、芦丁、柚皮苷二氢查尔酮、槲皮素等4种黄酮类化合物，其中原花青素、芦丁、槲皮素3种黄酮成分色谱峰在20min内分离度良好，线性范围为0.52～56μg/mL(r＝0.999 8～1)，加样回收率为92.13％～96.70％，RSD为0.89％～1.96％，三种黄酮类化合物中原花青素含量最高；一种黄酮类化合物即柚皮苷二氢查尔酮在该条件下未检出。故经系统适用性试验、精密度实验、稳定性实验重复性实验、加样回收率实验、样品含量测定等方法学考察验证，用RP-HPLC法可对新疆野山杏果肉中3种黄酮类化合物成分进行分析，该法简便、准确、快速、稳定性及重复性好，可为野山杏中黄酮类化合物的快速检测提供实验依据。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
Claims (3)
1.一种野山杏果肉黄酮类化合物的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、溶液的制备
1.1)对照品溶液的配制
称取原花青素、芦丁、柚皮苷二氢查尔酮、槲皮素4种对照品各10.00±0.20mg，用甲醇溶解并分别定容至25mL容量瓶中，摇匀，即得对照品溶液；
1.2)混标储备液
分别取上述步骤1.1)中溶液各2.50mL，混合均匀，制得含有原花青素106.00ug/ml、芦丁103.00ug/ml、柚皮苷二氢查尔酮112.00ug/mL、槲皮素104.00ug/ml的混标储备液；
1.3)混标中间液
准确量取5mL混标溶液甲醇定容至10mL，制得含有原花青素53.00ug/ml、芦丁51.50ug/ml、柚皮苷二氢查尔酮56.00ug/mL、槲皮素52.00ug/ml混标中间液；
1.4)混标标准工作液
分别取0.25、0.50、1.00、2.00mL中间液甲醇定容至10ml容量瓶，摇匀，配制标准工作液上机待测；
1.5)供试品溶液的配制
取1g野山杏干燥果肉，粉碎，过40目筛，加50％乙醇(料液比1:50)，70℃下超声1h，超声提取2次，抽滤，合并滤液旋蒸浓缩后，用甲醇定容至10mL，摇匀，制成供试品溶液，测定前用微孔滤膜(0.22μm)过滤，备用；
步骤2、色谱条件
2.1)检测波长
取上述对照品溶液，采用二极管阵列检测器对各成分吸收峰进行扫描，通过3D图谱对各对照品的吸收峰进行分析，确定对照品溶液的最大吸收波长为273nm；
2.2)流动相
采用甲醇-磷酸水溶液作为流动相；
2.3)流速
在固定相和流动相不变的情况下，流速为0.6-1.2mL/min；
2.4)柱温
在流动相和固定相不变的情况下，柱温为25-35℃；
步骤3数据处理
采用Excel 2010、SigmaPlot 12.0软件进行数据分析。
2.根据权利要求1所述的野山杏果肉黄酮类化合物的测定方法，其特征在于，步骤2中，所述的色谱条件为：Hubble C18，4.6mm×250mm，5μm色谱柱，流动相A甲醇:B0.5％磷酸水溶液＝45:55，以1.0mL/min流速进行等度洗脱，柱温箱的温度为35℃，检测波长为273nm，进样量为10μL。
3.根据权利要求1所述的野山杏果肉黄酮类化合物的测定方法，其特征在于，芦丁、槲皮素、原花青素3种黄酮成分色谱峰在20min内，线性范围为0.52～56μg/mL，r＝0.9998～1，加样回收率为92.13％～96.70％，RSD为0.89％～1.96％。
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