CN112666302B

CN112666302B - 一种大麦苗中活性黄酮成分群鉴定及其快速检测方法

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Publication number: CN112666302B
Application number: CN202110003155.0A
Authority: CN
Inventors: 李静; 刘成洪; 孙连娜; 陈万生; 张述伟; 陈志伟; 宗营杰; 陆瑞菊
Original assignee: Shanghai University of Traditional Chinese Medicine; Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shanghai University of Traditional Chinese Medicine; Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-01-04
Filing date: 2021-01-04
Publication date: 2023-02-24
Anticipated expiration: 2041-01-04
Also published as: CN112666302A

Abstract

本发明涉及农业与食品技术和药品研发领域，具体是一种大麦苗中活性黄酮成分群鉴定及其快速检测方法。本发明采用化学系统分离与活性部位追踪分离，首次明确了大麦苗中大麦黄苷、皂草苷、异荭草素‑7‑O‑[6‑阿魏酰基]‑葡萄糖苷、异牡荆素‑7‑O‑[6‑阿魏酰基]‑葡萄糖苷、异荭草素‑2”‑O‑(6‑阿魏酰基)‑葡萄糖苷这5种活性黄酮成分作为抗氧化功能性成分评价指标，并建立5种活性黄酮成分HPLC同步检测方法，弥补了现有评价体系和质控方法的不足，为大麦苗的进一步加工利用和质量控制提供科学依据。

Description

一种大麦苗中活性黄酮成分群鉴定及其快速检测方法

技术领域

本发明涉及植物功能性成分的品质评价和检测方法技术领域，具体地说，是一种大麦苗中的5种活性黄酮成分群的品质评价指标确立及其五合一混标的高效液相色谱(HPLC)快速检测方法。

背景技术

大麦苗是禾本科Gramineae大麦属Hordeum大麦Hordeum vulgare L.的嫩茎叶。大麦为我国的主要种植的农作物之一，也是传统的药食同源植物。麦苗的功效在《普济方》和《本草纲目》就有记载。大麦苗近年来被开发成为大麦苗粉、麦绿素片、大麦若叶青汁等多种功能性食品，发展迅速，有很好的市场前景。

近年来，在国内外学者对大麦苗的成分及生物活性研究越来越深入，研究表明大麦苗中含有多种化学成分，如黄酮类、多酚类、木脂素类、多糖及多种微量元素等。大麦苗的抗氧化、降血糖等功效受到了广泛的关注及认可，但对其活性成分的物质基础仍缺乏系统研究，目前针对大麦苗的功能性成分还未见有明确的评价指标，在很大程度上限制了麦绿素类专用大麦新品种选育及其相关制品的质量控制。黄酮类化合物是大麦苗中的一类功能性成分，已报道大麦黄苷和皂草苷是大麦苗中主要活性黄酮成分，但是目前仍旧缺少能够评价大麦苗中活性黄酮的评价指标和快速定量检测方法。

发明内容

本发明的目的在于针对目前缺少能够评价大麦苗中活性黄酮的评价指标和快速定量检测方法的问题，提供一种大麦苗中活性黄酮成分群鉴定及其快速检测方法。

本发明采用化学系统分离与活性部位追踪相结合，首次明确了大麦苗中5种活性黄酮成分作为抗氧化功能性成分评价指标，并建立5种活性黄酮成分的HPLC同步检测方法，弥补了现有评价体系和质控方法的不足，为大麦苗的进一步加工利用和质量控制提供科学依据。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

A、对大麦苗中化学成分系统分离，采用DDPH体外实验追踪抗氧化活性黄酮部位。

B、分离纯化活性部位主要黄酮类成分，并鉴定其结构。

C、分离黄酮单体成分的抗氧化活性评价。

D、5种活性黄酮成分的HPLC同步检测方法的建立。

采用常温渗漉法以80％乙醇对大麦苗干样进行提取，再用不同极性的萃取溶剂对总提物进行分步萃取，结合DPPH抗氧化活性实验，确定大麦苗正丁醇提取部位为抗氧化活性黄酮富集部位。再利用硅胶柱色谱、MCI凝胶柱色谱、ODS、C18反相硅胶柱色谱、葡聚糖凝胶柱色谱和高效液相色谱多种分离技术对正丁醇活性部位的活性黄酮单体成分进行分离和纯化。运用物理、化学方法及各种现代波谱分析技术(包括紫外、红外光谱、质谱、¹H-NMR、¹³C-NMR、DEPT、2D-NMR)对所分得化合物进行结构鉴定，确定了大麦苗中的5个活性黄酮成分，分别是：大麦黄苷、皂草苷、异荭草素-7-O-[6-阿魏酰基]-葡萄糖苷、异牡荆素-7-O-[6-阿魏酰基]-葡萄糖苷和异荭草素-2”-O-(6-阿魏酰基)-葡萄糖苷。以分离制备的5种活性黄酮成分为标准品，建立了一种5种成分同步检测的HPLC方法。

本发明的第一方面，提供一种大麦苗中活性黄酮成分群的品质评价方法，所述的品质评价方法是将以下5种活性黄酮单体成分作为大麦苗中具有抗氧化活性的黄酮类成分的品质评价指标：大麦黄苷、皂草苷、异荭草素-7-O-[6-阿魏酰基]-葡萄糖苷、异牡荆素-7-O-[6-阿魏酰基]-葡萄糖苷、异荭草素-2”-O-(6-阿魏酰基)-葡萄糖苷。

本发明的第二方面，提供一种大麦苗中活性黄酮成分混标同步检测的高效液相色谱方法，所述的活性黄酮成分为大麦黄苷、皂草苷、异荭草素-7-O-[6-阿魏酰基]-葡萄糖苷、异牡荆素-7-O-[6-阿魏酰基]-葡萄糖苷和异荭草素-2”-O-(6-阿魏酰基)-葡萄糖苷5种，所述的方法包括以下步骤：

a、对照品储备液的制备：取大麦黄苷、皂草苷、异荭草素-7-O-[6-阿魏酰基]-葡萄糖苷、异牡荆素-7-O-[6-阿魏酰基]-葡萄糖苷和异荭草素-2”-O-(6-阿魏酰基)-葡萄糖苷对照品，加入溶剂溶解配制成所需浓度的对照品溶液；

b、样品溶液的制备：取大麦苗粉过筛，精密称定，加入30％乙醇溶液，超声提取15min，过滤，取续滤液过0.45μm微孔滤膜，作为供试样品溶液；

c、大麦苗中5种活性黄酮成分的含量测定：分别将对照品溶液和样品溶液用高效液相色谱仪在同一色谱条件下的进行分析，以峰面积外标法计算5种黄酮成分的含量。

进一步的，所述的步骤b中，大麦苗粉与加入的30％乙醇溶液的料液比为1:100(g/mL)。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的步骤b，样品溶液制备方法为：取大麦苗粉过筛0.2g，精密加入20mL 30％乙醇溶液，称定重量，超声提取15min，取出放凉，用30％乙醇补重，摇匀，过滤，取续滤液过0.45μm微孔滤膜，作为供试样品溶液。

进一步的，所述的步骤c中，所用色谱柱型号为

(4.6×250mm,5μm)，检测波长为345nm，色谱柱的柱温设定为30℃，进样量为10μL。

进一步的，所述的步骤c中，液相色谱分析中的流动相为A％乙腈/B％0.2％甲酸水，梯度洗脱程序为0-25min，12％A，流速1.2mL/min；25-55min，12-20％A，流速1.2-1.5mL/min；55-60min，20-25％A，流速1.5-1.0mL/min。

本发明的第三方面，提供一种大麦苗中活性黄酮成分群鉴定及其快速检测方法，包括以下步骤：

A、对大麦苗80％醇提物采用正丁醇进行萃取，获得富集活性黄酮的正丁醇部位；

B、正丁醇部位用水完全溶解后，上D101大孔树脂柱层析，收集20-50％乙醇洗脱部位为活性部位；

C、采用葡聚糖凝胶、ODS、C18、MCI凝胶柱色谱和高效液相色谱多种分离方法，结合DPPH薄层生物自显影技术进行活性追踪，分离、鉴定到主要的抗氧化活性黄酮单体成分，确定为大麦苗中黄酮类功能成分群的品质评价指标；

D、以上述鉴定到的活性黄酮单体成分为标准品，采用如上所述的大麦苗中活性黄酮成分混标同步检测的高效液相色谱方法检测黄酮成分的含量。

进一步的，所述的步骤C，采用DPPH抗氧化活性追踪的方法，确定活性部位；再采用MCI反相柱色谱、ODS柱色谱、葡聚糖凝胶柱色谱和高效液相色谱多种分离方法，结合DPPH薄层生物自显影技术，进行活性追筛、分离与纯化，得到单体化合物；对得到的单体化合物进行DPPH抗氧化活性评价，选取含量高、活性好的单体黄酮化合物作为大麦苗中黄酮类功能成分群的品质评价指标。

进一步的，所述的步骤C中确定了大麦黄苷、皂草苷、异荭草素-7-O-[6-阿魏酰基]-葡萄糖苷、异牡荆素-7-O-[6-阿魏酰基]-葡萄糖苷和异荭草素-2”-O-(6-阿魏酰基)-葡萄糖苷，为大麦苗中黄酮类功能成分群的品质评价指标。

本发明优点在于：

1、本发明针对大麦苗中化学成分，采用不同极性溶剂提取进行系统分离，选用DPPH体外实验进行抗氧化活性部位追踪，确定正丁醇提取部位为抗氧化活性黄酮富集部位，提供大麦苗中的活性黄酮的提取分离技术路线与品质评价参考指标；

2、本发明明确了大麦苗中含有5种主要抗氧化活性黄酮成分：大麦黄苷、皂草苷、异荭草素-7-O-[6-阿魏酰基]-葡萄糖苷、异牡荆素-7-O-[6-阿魏酰基]-葡萄糖苷和异荭草素-2”-O-(6-阿魏酰基)-葡萄糖苷，确定为大麦苗中具有抗氧化活性的黄酮类成分的品质评价指标；

3、本发明通过对5种黄酮化合物标准品分离制备和高效液相色谱条件的精确限定，建立了5种活性黄酮成分的HPLC混标同步检测方法，色谱分离效果良好，分离度均＞1.5，理论塔板数计算不低7000。

4、本发明首次实现了同时检测大麦苗中的5种黄酮成分，方法操作简单快捷，准确度高，精密度高，重复性好，可用于对不同大麦苗样品中的5种黄酮含量进行混标同步测定，为富含活性黄酮成分的大麦幼苗品种筛选和大麦苗产品开发及质量控制提供依据，为高活性黄酮含量大麦苗的品种选育及大麦苗相关产品的进一步开发和质量控制提供了科学依据，具有较高的应用价值。

附图说明

图1为“花30”大麦苗各个萃取部位的DPPH清除率。

图2为“花30”大麦苗正丁醇部位各洗脱组分DPPH清除率。

图3为5个混合黄酮标准品的色谱图。

图4为“花30”大麦苗样品溶液的色谱图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例：“花30”大麦苗中活性黄酮成分的鉴定及其快速检测

1测试材料

测试材料为“花30”品种的大麦苗，由上海市农业科学院生物技术研究所植物细胞工程研究室提供。2018年11月播种于上海市农业科学院实验田，条播种植，正常水肥管理，越冬麦苗长到20-25cm(6-7叶期)收割，80℃烘干杀青。

2方法

2.1大麦苗的提取和活性萃取部位的确定

大麦苗(7.86kg)，用25L 80％乙醇浸泡24h，75L 80％乙醇渗漉提取，获得麦苗醇提取液并进行浓缩得麦苗浓缩液1.629kg，将麦苗浓缩液分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，采用DPPH抗氧化活性追踪的方法，确定活性部位。

DPPH自由基清除实验方法如下：

DPPH溶液现配现用，以95％乙醇配制成浓度为0.2mM的标准试剂，避光保存。实验组取配置成浓度梯度的样品，1mL样品与4mL DPPH溶液充分混合，在室温下避光放置30min，然后于紫外分光光度计517nm处测量吸光度值，为A样品组。对照组为1mL 95％乙醇与4mLDPPH溶液充分混合，测量吸光度值，为A对照组。溶剂组取80％乙醇，在紫外分光光度计517nm处测量吸光度值，为A溶剂组，每个样品平行测定三组。清除率计算公式为，DPPH清除率(％)＝[A对照组-(A样品组-A溶剂组)]/A对照组*100％。

2.2大麦苗提取物的分离纯化

取正丁醇部分，用水溶解完全，用不同浓度的乙醇溶液进行D101大孔树脂柱层析洗脱。洗脱完毕后经TLC薄层色谱检测，收集并合并相似流份，共4部分。采用DPPH抗氧化活性追踪的方法，确定活性部位。再采用MCI反相柱色谱、ODS柱色谱、葡聚糖凝胶柱色谱和高效液相色谱多种分离方法，结合DPPH薄层生物自显影技术，进行活性追筛、分离与纯化，得到单体化合物。

2.3黄酮标准品的确定

对得到的单体化合物进行DPPH抗氧化活性评价，选取含量高、活性好的单体黄酮化合物作为标准品。

2.4标准品储备液的制备

取标准品适量，精密称定，加30％乙醇配置成质量浓度一定的混合对照品储备液。

2.5供试样品溶液的制备

取大麦苗粉，对提取方法进行考察，并在此基础上对提取时间、溶剂体积分数、料液比进行单因素考察。通过比较各成分峰面积大小，确定供试样品溶液的最佳制备方法。

2.6活性黄酮成分的含量测定

分别将对照品溶液和供试样品溶液用高效液相色谱仪在同一色谱条件下的进行分析。液相色谱条件如下，

色谱柱：

(4.6×250mm 5μm)；

检测波长：345nm；

流动相：乙腈(A)/0.2％甲酸水(B)；

柱温30℃，进样量10μL。

梯度洗脱程序为：0-25min，12％A，流速1.2mL/min；25-55min，12-20％A，流速1.2-1.5mL/min；55-60min，20-25％A，流速1.5-1.0mL/min。

3结果

3.1大麦苗的提取和活性萃取部位的确定

大麦苗醇提物的不同溶剂萃取部位采用DPPH自由基清除实验评价其抗氧化活性，由结果(图1)可知正丁醇部位为活性萃取部位。

3.2大麦苗提取物的分离纯化

正丁醇部分，用不同浓度的乙醇溶液进行大孔树脂柱层析洗脱后得到4部分。采用DPPH抗氧化活性追踪的方法，确定20-50％乙醇部分为活性部位(图2)。再采用多种色谱分离方法对活性部位进行分离纯化，得到单体黄酮化合物。

3.3黄酮标准品的确定

单体黄酮化合物中大麦黄苷、皂草苷、异荭草素-7-O-[6-阿魏酰基]-葡萄糖苷、异牡荆素-7-O-[6-阿魏酰基]-葡萄糖苷和异荭草素-2”-O-(6-阿魏酰基)-葡萄糖苷，大麦黄苷和皂草苷的活性高，另外三个成分的含量高且对DPPH都有一定的清除作用，为了能够综合考虑麦苗的品质，从活性和成分两方面对其进行质控研究，确定这5个活性黄酮成分为标准品，建立5种活性黄酮成分的HPLC混标同步检测方法。

3.4标准品储备液的制备

取大麦黄苷、皂草苷、异荭草素-7-O-[6-阿魏酰基]-葡萄糖苷、异牡荆素-7-O-[6-阿魏酰基]-葡萄糖苷和异荭草素-2”-O-(6-阿魏酰基)-葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加30％乙醇制成质量浓度分别为0.5000mg/mL、0.2500mg/mL、0.2500mg/mL、0.5000mg/mL和0.5000mg/mL的混合对照品储备液。

3.5供试样品溶液的制备

3.5.1提取方式考察

取大麦苗粉0.2g 3份，精密称定，精密加入30％乙醇溶液20mL，称定重量，分别采用超声提取15min，80℃回流提取15min，浸渍24h，提取完成后放凉，用30％乙醇补重，摇匀后取样，过滤，取续滤液过0.45μm微孔滤膜，作为供试样品溶液。各样品平行制备3份。按照2.6的色谱条件测定，记录5种成分峰面积，并计算平均值。如表1所示，超声提取法含量最高，结合实际操作简便性，超声提取最合适，故选用超声提取法。

表1不同提取方法两种成分峰面积测定结果(n＝3,

)

3.5.2提取时间考察

取大麦苗粉0.2g 3份，精密称定，精密加入30％乙醇溶液20mL，称定重量。分别超声提取15min、30min、45min。取出放凉，用30％乙醇补重，摇匀后取样，过滤，取续滤液过0.45μm微孔滤膜，作为供试样品溶液。各样品平行制备3份。按照2.6的色谱条件测定，记录5种成分峰面积，并计算平均值。如表2所示15min超声时间已经有较高的提取率，故选用超声15min。

表2不同提取时间两种成分峰面积测定结果(n＝3,

)

3.5.3乙醇体积分数

取大麦苗粉0.2g 5份，精密称定，精密加入30％、60％、90％乙醇溶液20mL，称定重量，超声提取15min取出放凉，补重，摇匀后取样，过滤，过滤，取续滤液过0.45μm微孔滤膜，作为供试样品溶液。各样品平行制备3份。按2.6的色谱条件测定，记录5种成分峰面积，并计算平均值。如表3所示，30％乙醇体积分数有较高的提取率，故选用30％乙醇体积分数。

表3不同乙醇体积分数两种成分峰面积测定结果(n＝3,

)

3.5.4料液比考察

取大麦苗粉0.2g 3份，精密称定，分别精密加入30％乙醇溶液5mL、10mL、20mL，超声提取15min，取出放凉，过滤，置于100mL容量瓶，用30％乙醇定容至刻度线，取样，过0.45μm微孔滤膜，作为供试样品溶液。各样品平行制备3份。按2.6的色谱条件测定，记录5种成分峰面积，并计算平均值。如表4所示，根据结果确定提取料液比1：100。

表4不同料液比两种成分峰面积测定结果(n＝3,

)

根据上述考察结果，最终确定测定供试样品溶液制备方法为取大麦苗粉过筛0.2g，精密加入20mL 30％乙醇溶液，称定重量，超声提取15min，取出放凉，用30％乙醇补重，摇匀，过滤，取续滤液过0.45μm微孔滤膜，作为供试样品溶液。

3.6方法学考察

3.6.1专属性考察

取标准品溶液、样品溶液，按2.6项下的液相色谱条件测定，记录色图谱。标准品和大麦苗样品溶液的色谱图见图3和4。所得的图谱中，周围无干扰峰，与其它峰完全分离，分离度均＞1.5，5种对照品纯度都在98％以上，理论塔板数计算不低7000。

3.6.2线性关系考察

精密量取对照品混合贮备液适量，依次逐级稀释，定容，制得6个浓度梯度的对照品混合溶液，按照2.6的色谱条件测定，以混合对照品溶液X(mg/mL)为横坐标，以其相应的峰面积Y为纵坐标绘制回归曲线。结果见表5，各对照品在相应的浓度范围内线性关系良好。

表5回归方程、相关系数及线性范围

3.6.3精密度试验

精密吸取供试样品溶液10μL，按照2.6的色谱条件测定，连续进样6次，结果见表6，大麦黄苷、皂草苷、异荭草素-7-O-[6-阿魏酰基]-葡萄糖苷、异牡荆素-7-O-[6-阿魏酰基]-葡萄糖苷、异荭草素-2”-O-(6-阿魏酰基)-葡萄糖苷面积RSD值为0.17％、0.47％、0.65％、1.99％、0.79％，说明仪器精密度良好。

表6精密度考察结果(n＝6)

3.6.4重复性试验

取同一批花30大麦苗样品，制备供试液样品，按照2.6的色谱条件测定，计算每份样品的5种成分进样峰面积的RSD值。结果见表7，大麦黄苷、皂草苷、异荭草素-7-O-[6-阿魏酰基]-葡萄糖苷、异牡荆素-7-O-[6-阿魏酰基]-葡萄糖苷、异荭草素-2”-O-(6-阿魏酰基)-葡萄糖苷面积RSD值为0.77％、0.84％、1.52％、0.99％、2.10％，说明实验建立的高效液相法同时测定5种成分的重复性良好。

表7重复性考察结果(n＝6)

3.6.5稳定性试验

取同一批大麦苗样品，制备供试样品溶液，分别于放置0、2、4、8、16、24h时，按照2.6的色谱条件测定，计算每份样品的5种成分进样峰面积的RSD值。结果见表8，RSD值为0.95％、1.20％、1.04％、0.86％、1.09％，说明供试样品溶液在24h内稳定。

表8稳定性考察结果(n＝6)

3.6.6加样回收率试验

取同一批大麦苗样品，按照样品含有量的100％加入对照品，平行制备供试样品溶液6份。按照2.6的色谱条件测定，记录峰面积，计算回收率，结果见表9-13。五个标准品的平均回收率分别为100.69％、99.78％、99.06％、102.40％和98.12％，结果说明该检测方法准确度高。

表9大麦黄苷加样回收率考察

表10皂草苷加样回收率考察

表11异荭草素-7-O-[6-阿魏酰基]-葡萄糖苷加样回收率考察

表12异牡荆素-7-O-[6-阿魏酰基]-葡萄糖苷加样回收率考察

表13异荭草素-2”-O-(6-阿魏酰基)-葡萄糖苷加样回收率考察

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims

1.一种大麦苗中活性黄酮成分群鉴定及其快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

C、采用葡聚糖凝胶、ODS、C18、MCI凝胶柱色谱和高效液相色谱多种分离方法，结合DPPH薄层生物自显影技术进行活性追踪，分离、鉴定到主要的抗氧化活性黄酮单体成分，确定大麦黄苷、皂草苷、异荭草素-7-O-[6-阿魏酰基]-葡萄糖苷、异牡荆素-7-O-[6-阿魏酰基]-葡萄糖苷和异荭草素-2”-O-(6-阿魏酰基)-葡萄糖苷为大麦苗中黄酮类功能成分群的品质评价指标；

D、以上述鉴定到的活性黄酮单体成分为标准品，采用大麦苗中活性黄酮成分混标同步检测的高效液相色谱方法检测黄酮成分的含量；

所述的大麦苗中活性黄酮成分混标同步检测的高效液相色谱方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的大麦苗中活性黄酮成分群鉴定及其快速检测方法，其特征在于，所述的步骤C，采用DPPH抗氧化活性追踪的方法，确定活性部位；再采用MCI反相柱色谱、ODS柱色谱、葡聚糖凝胶柱色谱和高效液相色谱多种分离方法，结合DPPH薄层生物自显影技术，进行活性追筛、分离与纯化，得到单体化合物；对得到的单体化合物进行DPPH抗氧化活性评价，选取含量高、活性好的单体黄酮化合物作为大麦苗中黄酮类功能成分群的品质评价指标。

3.根据权利要求1所述的大麦苗中活性黄酮成分群鉴定及其快速检测方法，其特征在于，所述的步骤b中，大麦苗粉与加入的30％乙醇溶液的料液比为1:100(g/mL)。

4.根据权利要求1所述的大麦苗中活性黄酮成分群鉴定及其快速检测方法，其特征在于，所述的步骤b，样品溶液制备方法为：取大麦苗粉过筛0.2g，精密加入20mL 30％乙醇溶液，称定重量，超声提取15min，取出放凉，用30％乙醇补重，摇匀，过滤，取续滤液过0.45μm微孔滤膜，作为供试样品溶液。

5.根据权利要求1所述的大麦苗中活性黄酮成分群鉴定及其快速检测方法，其特征在于，所述的步骤c中，所用色谱柱型号为

T3，4.6×250mm，5μm，检测波长为345nm，色谱柱的柱温设定为30℃，进样量为10μL。

6.根据权利要求1所述的大麦苗中活性黄酮成分群鉴定及其快速检测方法，其特征在于，所述的步骤c中，液相色谱分析中的流动相为A％乙腈/B％0.2％甲酸水，梯度洗脱程序为0-25min，12％A，流速1.2mL/min；25-55min，12-20％A，流速1.2-1.5mL/min；55-60min，20-25％A，流速1.5-1.0mL/min。