CN110596263A - 一种辣木提取物指纹图谱的建立方法及其指纹图谱 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种辣木提取物指纹图谱的建立方法及其指纹图谱，涉及中药分析技术领域。本发明以辣木提取物样品制成供试品溶液，以溶解有没食子酸对照品和异槲皮苷对照品的溶液为对照品溶液，通过高效液相色谱仪测定液相色谱；将得到的液相色谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统分析，经分析得到辣木提取物指纹图谱。本发明提供的辣木指纹图谱的建立方法，针对辣木提取物的特性，建立的指纹图谱信息全面，图谱中各峰分离度佳，标定20个共有峰，基线平稳，检测方法可以客观、全面、准确的评价辣木提取物的质量，对控制辣木提取物质量和保证产品质量安全具有重要意义。

Description

一种辣木提取物指纹图谱的建立方法及其指纹图谱
【技术领域】
本发明涉及中药分析技术领域，具体涉及一种辣木提取物指纹图谱的建立方法及其指纹图谱。
【背景技术】
辣木，又称为鼓槌树，原产于印度，被世界誉为“生命之树”、“植物中的钻石”、“素食黄金”的神奇之树。印度传统医学认为辣木叶有护肝、利尿、消炎、止痛、降压、强心、催乳等功效，常用来预防和治疗糖尿病、高血压病、皮肤病、免疫力弱、贫血、坏血病、肥胖症、关节炎、消化器官肿瘤等疾病，是一种富含黄酮及多酚类成分的新资源食品原料，可应用于食品、保健品、化妆品等行业。
近年来，国内外学者对其化学成分、药理活性及安全性开展了一些研究工作，辣木叶的药用保健功能也日益受到人们的重视。而我公司生产的以辣木提取物为主要原料制备的辣木叶颗粒深受消费者欢迎，是我目前畅销产品之一，具有很好的降血糖、降脂、增强免疫力等保健功效。按照目前产品的国家及行业标准，其检测标准主要以营养成分和矿质元素含量的高低为指标，忽略了具有药效作用的活性成分变化，质量标准水平偏低，因此构建一种全面表征辣木叶颗粒整体成分的方法尤为重要。
迄今为止，辣木叶原材及相关产品的指纹图谱研究甚少，究其主要原因主要为：辣木叶提取效率低下，其提取物中药效成分含量低，各成分间在指纹图谱中分离难度高，对其化学成分基础研究弱等制约了其质量控制标准的研究，提取的成分中有效成分含量少，限制其质量标准的研究进程。因此，为辣木提取液建立一种特征峰数量多、高效、全面的指纹图谱方法及指纹图谱对辣木及其产品进行质量评价十分必要。
【发明内容】
本发明的发明目的在于：针对背景技术中的问题，提供一种辣木提取物指纹图谱的建立方法，该方法能够得到辣木提取物的指纹图谱，图谱中各峰分离度佳，标定20个共有峰，检测方法可以客观、全面、准确的评价辣木提取物的质量，对控制辣木提取物质量和保证用药安全具有重要意义。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种辣木提取物指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：
a.供试品溶液的制备：以辣木提取物样品制成供试品溶液，备用；
b.对照品溶液的制备：分别取没食子酸对照品和异槲皮苷对照品，分别制成没食子酸对照品溶液和异槲皮苷对照品溶液，备用；
c.高效液相色谱测定：采用高效液相色谱仪，以甲醇和无机酸的水溶液作为流动相分别将供试品溶液、没食子酸对照品溶液和异槲皮苷对照品溶液进行检测，色谱柱进行梯度洗脱，并且在所述梯度洗脱的过程中控制所述甲醇的体积占所述流动相总量的百分比由5％增加至98％；所述无机酸的体积占所述流动相总量的百分比由95％降低至0％，将得到高效液相色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统分析，得到辣木提取物的指纹图谱。
优化的，辣木提取物的制备方法，至少包括以下步骤：(1)原材前处理：取辣木药材，使用粉碎机粉碎后过网筛，所述网筛的孔径为0.8-1.2mm，得辣木粉；(2)提取：采用高效高压差低温连续式提取设备，按照药材料液质量比为1：15-50的比例加入水进行提取，提取的温度为≤30℃、提取压力≥20Mpa，得辣木提取液；(3)离心：将辣木提取液采用离心机离心，离心机转速为3500-15000r/min，得到辣木离心液；(4)过滤：辣木离心液用孔径≤500nm的陶瓷膜进行微波，得到辣木微滤清液；(5)浓缩：辣木微滤清液经过反渗透膜进行膜进行浓缩，得到辣木膜浓缩液；(6)灭菌、干燥：辣木膜浓缩液进入10万级以上洁净区，添加辅料进行干燥，得到辣木叶干燥粉；(7)制粒：辣木叶干燥粉添加粘合剂进行制粒，制粒工序为湿法制粒/干法制粒。
优化的，步骤(6)辣木膜浓缩液进入洁净区后、干燥前，进行膜过滤除菌或瞬时高温灭菌；洁净区更优化的是1-10万级。
本发明方法提取的辣木提取物，提取率高、成分结构完整，耗时短，为辣木叶颗粒的开发提供一种高效全成分提取工艺。
进一步优化的，所述步骤a中供试品的制备方法具体为：取8-16批次的辣木提取物0.85-1.15g，加入10ml容量瓶中，用纯化水定容，摇匀后用水系微孔滤膜过滤，即得若干个批次供试品溶液。
进一步优化的，所述步骤b中对照品溶液的制备方法具体为：精密称取没食子酸5-20mg、异槲皮苷5-15mg于100mL容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得没食子酸对照品溶液、异槲皮苷对照品溶液。
进一步优化的，步骤c中高效液相色谱的检测条件为：色谱柱为Diamonsi C18色谱柱，流动相A为甲醇；流动相B为有机酸的水溶液；检测波长：230nm；柱温：30-35℃；流速：0.8-1.5mL·min－1；进样量5-20uL，洗脱程序为梯度洗脱。
进一步优化的，所述无机酸的水溶液选自体积百分比浓度为0.02～0.1％的磷酸水溶液。
进一步优化的，所述梯度洗脱具体如下：
t＝0～20min：5～10％甲醇、95％～90％无机酸水溶液；
t＝20～40min：10～28％甲醇、90％～72％无机酸水溶液；
t＝40～65min：28-50％甲醇、72％～50％无机酸水溶液；
t＝65～75min：50-98％甲醇、50％～2％无机酸水溶液。
一种按上述辣木提取物指纹图谱的建立方法得到的指纹图谱，所述指纹图谱中共有峰为20个，其中7号峰为没食子酸，18号峰为异槲皮苷。
进一步优化的，以7号峰作为参照峰，计算各共有峰与参照峰的相对保留时间和相对标准偏差，峰1-20的相对保留时间分别如下：1号峰平均相对保留时间为0.28±0.007；2号峰平均相对保留时间为0.31±0.004；3号峰平均相对保留时间为0.38±0.003；4号峰平均相对保留时间为0.46±0.009；5号峰平均相对保留时间为0.54±0.01；6号峰平均相对保留时间为0.6±0.008；7号峰平均相对保留时间为1.00±0.00；8号峰平均相对保留时间为1.06±0.002；9号峰平均相对保留时间为2.07±0.011；10号峰平均相对保留时间为2.73±0.024；11号峰平均相对保留时间为2.92±0.032；12号峰平均相对保留时间为3.13±0.049；13号峰平均相对保留时间为3.7±0.025；14号峰平均相对保留时间为3.81±0.036；15号峰平均相对保留时间为4.35±0.041；16号峰平均相对保留时间为5.24±0.061；17号峰平均相对保留时间为6.16±0.064；18号峰平均相对保留时间为6.48±0.076；19号峰平均相对保留时间为6.67±0.086；20号峰平均相对保留时间为7.35±0.202。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1.本发明提供的辣木指纹图谱的建立方法，针对辣木提取物的特性，建立的指纹图谱信息全面，图谱中各峰分离度佳，标定20个共有峰，基线平稳，检测方法可以客观、全面、准确的评价辣木提取物的质量，对控制辣木提取物质量和保证用药安全具有重要意义。
2.本发明提供的辣木药材提取方法，采用我公司的专利提取设备(ZL200920304058.x)，通过对提取方法进行优化，能够克服目前传统提取方法对辣木提取过程中存在的提取率低，有效成分含量少，有效成分种类少的技术问题，本发明方法进行提取，能够很好的将有效成分进行提取、表征辣木药材的成分组成，建立的指纹图谱信息丰富，能够有效标定20个共有峰，全面评价辣木药材的质量情况。
3.本发明指纹图谱的建立方法，还可以克服一些辅料的影响，得到的谱图准确、可靠。
4.通过大量实验筛选出最佳的流动相组成、梯度洗脱程序、流速、检测波长、色谱柱、柱温等分析条件，经多次实验验证表明，本发明提供的辣木提取物指纹图谱检测方法可以全面、客观、准确的检测和评价法辣木的质量，为保证其临床疗效具有重要意义。
5.本发明对12批次样品的图谱数据进行分析，以样品编号1为参考图谱，以平均数法生成共有模式作为对照图谱，时间窗宽度为0.1s，得到12批样品的图谱均有20个共有峰，经对照品及紫外光谱对照，确认出7号峰为没食子酸，18号峰为异槲皮苷。其中7号峰峰型和分离度较好，故选择作为参照峰，共有峰的相对保留时间的RSD≤2.6％，共有峰相对峰面积的RSD≤3.0％，且各色谱图相似度均在0.91以上，可以做为辣木提取物质量评价和质量控制标准。本发明提供的辣木提取物指纹图谱的检测方法，具有方法简便、稳定性好、精密度高、重现性好等优点。
【附图说明】
图1不同波长下辣木提取物HPLC色谱图；
图2不同梯度洗脱程序下辣木提取物LPLC色谱图；
图3辣木提取物精密度试验HPLC色谱图；
图4辣木提取物重复性试验HPLC色谱图；
图5辣木提取物稳定性试验HPLC色谱图；
图6没食子酸对照品与辣木提取物样品的HPLC色谱图；
图7异槲皮苷对照品与辣木提取物样品的HPLC色谱图；
图8 12批次辣木提取物LPLC指纹图谱
图9辣木提取物标准指纹图谱。
【具体实施方式】
下面结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1辣木提取物的制备
辣木提取物的制备，至少包括以下步骤：
(1)原材前处理：取辣木药材，使用粉碎机粉碎后过网筛，所述网筛的孔径为0.8-1.2mm，得辣木粉；
(2)提取：采用高效高压差低温连续式提取设备，按照药材料液质量比为1：15-50的比例加入水进行提取，提取的温度为≤30℃、提取压力≥20Mpa
得辣木提取液；
(3)离心：将辣木提取液采用离心机离心，离心机转速为3500-15000r/min，得到辣木离心液；
(4)过滤：辣木离心液用孔径≤500nm的陶瓷膜进行微波，得到辣木微滤清液；
(5)浓缩：辣木微滤清液经过反渗透膜进行膜进行浓缩，得到辣木膜浓缩液；
(6)灭菌、干燥：辣木膜浓缩液进入10万级以上洁净区，添加辅料、灭菌、进行干燥，得到辣木叶干燥粉；
(7)制粒：辣木叶干燥粉添加粘合剂进行制粒，制粒工序为湿法制粒/干法制粒。
步骤(2)中提取温度最优为20-30℃，本实施例采用20-30℃进行提取。
本实施例中，步骤(4)的陶瓷膜孔径为500nm。
步骤(6)中的干燥可以选自喷雾干燥或真空干燥，都可以实现本发明目的，本实施例中选择喷雾干燥法进行干燥。辅料可以选自麦芽糊精和/或低聚果糖粉，都可以实施本发明目的，其中可以单独选择麦芽糊精或低聚果糖粉，也可以将上述辅料进行任意比较混合后做为辅料添加，辅料添加量为总重量的30-50％。灭菌的方法可选用膜过滤灭菌或瞬时高温灭菌，本实施例采用膜过滤灭菌。在1万级的洁净区内进行操作。
步骤(7)中制粒工序可采用湿法制粒，也可以采用干法制粒，本实施例中采用干法制粒。
本发明中所述的高效高压差低温连续式提取设备为我公司专利设备，公开号为CN201505465U。本发明实施例中，辣木药材的药用部位为辣木叶，购自药材市场。
实施例2辣木提取物的指纹图谱的建立方法
一、实验器材与试剂
器材：Agilengt1100系列高效液相色谱仪(包括DAD阵列检测器，美国Agilent公司)、Diamonsil C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)、DV215CD型电子天平(美国奥豪斯公司)
试剂：乙腈、甲醇(色谱纯，美国Fisher公司)、磷酸(分析纯，成都市科龙化工试剂厂)、对照品异槲皮苷(中国食品药品检定研究院，批号100080-200707)、没食子酸(成都普思生物科技有限公司，批号P80380030)、超级纯水。
二、供试品溶液和对照品溶液的制备
a.供试品溶液的制备：辣木提取物样品来自广州泽力医药科技有限公司生产的12批次辣木提取物样品，辣木提取物样品的制备方法按实施例1的制备方法制备。辣木叶提取物的生产批号分别为：20190401、20190402、20190403、20190404、201904015、20190406、20190407、20190408、20190409、201904010、2019040111、201904012。
供试品浓度的选择：取生产批号为20190403的辣木叶提取物，以纯化水为溶剂，分别配制成辣木叶提取物与水的料液比1:5、1:10、1:15、1:20、1:25溶液，上述溶液分别用0.45um水系滤膜中过滤至液相进样瓶中，采用高效液相采集各样品图谱，进样量为10微升，根据高效液相图谱显示各成分峰的数量及含量，确定供试品浓度较佳的料液比为1：5～1：15。
指纹图谱供试品制备：分别称取12批次辣木提取物样品1.0g，置于具塞容量瓶中，加入10mL纯化水定容，振荡摇匀，采用0.45um水系滤膜中过滤至液相进样瓶中，得到编号分别为1-12的供试口溶液，如下表所示。
表1辣木供试品溶液
b.对照品溶液的制备：
分别取没食子酸对照品和异槲皮苷对照品对照品异槲皮苷购于中国食品药品检定研究院，批号100080-200707；没食子酸对照品购于成都普思生物科技有限公司，批号P80380030。称取没食子酸8mg、异槲皮苷10mg分别置入100mL容量瓶中，加甲醇定容，得到浓度为0.08mg/mL没食子酸对照品溶液、0.1mg/mL异槲皮苷对照品溶液。
三、色谱条件的选择
1.液相色谱图检测波长的选择：
采用DAD阵列检测器对供试品溶液1、对照品溶液进行全波长扫描，扫描波长范围200-600nm，后根据各图谱在不同波长下的图谱形状，初步筛选了检测波长为230、254、280、320、360nm的谱图，如图1所示。通过谱图的综合分析，在230nm检测波长下的谱图分离度良好、基线平稳，且成分种类丰富、含量高，因此本发明最优的波长为230nm，并以此为后续试验的色谱检测波长。
2.色谱柱的选择
分别采用以下两种色谱柱：DiKMA Diamonsi C18(4.6mm×250mm，5μm)、岛津Inertsil ODS-3(4.6mm×250mm，5μm))，于同一液相条件进样分析。得到的HPLC色谱图分析后，用Diamonsi C18(4.6mm×250mm，5μm)所得色谱图信息量丰富、基线平稳，因此本发明最优的色谱柱为Diamonsi C18色谱柱，并以此型号色谱柱进行后续实验。
3.流动相及梯度洗脱程度的选择：
取供试品1分别以甲醇-水、乙腈-水为流动相系统，其他条件不变，于同一液相条件进样分析，结果显示甲醇-水所得供试品溶液色谱图信息量丰富，峰型佳，故选择有机相为甲醇。
在选择有机相为甲醇的基础上，进一步筛选具体的流动相组成及梯度选择程序，选择有机相为A相，水相为B相，其中梯度洗脱程序编号为NO.1-NO.4的B相为纯化水，梯度洗脱编号为NO.5-NO.7的B相为的体积百分比为0.05％磷酸的缓冲盐水溶液，具体见下表：
表2洗脱程度及流动组成A
表3洗脱程度及流动组成B
经过梯度洗脱程序编号NO.1-NO.7的液相谱图见图2，经分析，在编号NO.6条件下所得供试品溶液谱图成分种类及其含量最多，且基线平稳，分离度良好，因此本发明选择梯度洗脱程序NO.6的条件为最优洗脱程度。
4.柱温的选择
洗脱程序固定为洗脱程序VI，色谱柱固定为Diamonsi C18色谱柱，分别对柱温20℃、25℃、30℃、32℃、35℃进行考察，结果显示档当柱温为30℃-35℃时所得的供试品溶液指纹图谱各色谱峰分离效果较好。
5.流速的选择
洗脱程序固定为洗脱程序VI，色谱柱固定为Diamonsi C18色谱柱，柱温固定为35℃，分别对流速0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min、1.5ml/min所得图谱进行比较，发现在上述流速均能实现本发明分离目的，流速为1.0ml/min时所得供试品溶液指纹图谱各色谱峰分离效果较好。
6.进样量的选择
洗脱程序固定为洗脱程序VI，色谱柱固定为Diamonsi C18色谱柱，柱温固定为35℃，流速1.0ml/min，分别对进样5、10、15、20uL，根据所得图谱进行比较，上述进样量均能实现本发明分离目的，进样量为10uL时所得供试品溶液指纹图谱各色谱峰分离效果较好。
综上所述，辣木提取物指纹图谱检测方法最佳色谱条件为：以Diamonsi C18为色谱柱；柱温箱温度为35℃；进样液体积：10μL；检测波长：230nm；流动相总流速：1.0mL/min；最佳梯度洗脱具体如下：
t＝0～20min：5～10％甲醇、95％～90％无机酸水溶液；
t＝20～40min：10～28％甲醇、90％～72％无机酸水溶液；
t＝40～65min：28-50％甲醇、72％～50％无机酸水溶液；
t＝65～75min：50-98％甲醇、50％～2％无机酸水溶液。
在该最优的色谱条件下，没食子酸对照品溶液、异槲皮苷对照品溶液同样拥有很好的峰形、基线平稳。
四、指纹图谱方法学考察
1.精密度试验
取供试品溶液1，按供供试品溶液的制备方法制备供试液，按照辣木提取物指纹图谱检测方法最佳色谱条件的方法连续进样6次，记录各色谱图，考察20个共有峰相对保留时间和相对峰面积。实验数据结果见下表4-5，实验谱图见附图3。
表4.精密度试验相似度评价结果(共有峰相对保留时间)
表5.精密度试验相似度评价结果(共有峰相对峰面积)
从上述结果可以看出，共有峰相对保留时间的RSD≤2.0％，共有峰相对峰面积的RSD≤4.0％，且各色谱图相似度均在0.93以上，表明仪器精密度良好，符合指纹图谱的技术要求。
2.重复性试验
取6个批次辣木提取物样品，6个批次生产批号分别为：20190401(S1)、20190402(S2)、20190403(S3)、20190404(S4)、20190405(S5)、20190406(S6)，按供试品溶液的制备方法制备供试液，按照辣木提取物指纹图谱检测方法最佳色谱条件的方法依次进样，记录各供试品溶液的色谱图，考察20个共有峰相对保留时间和相对峰面积。实验数据结果见表6-7，实验谱图见附图4。在表6-7和附图4中，S1、S2、S3、S4、S5、S6分别表示的生产批号为：20190401、20190402、20190403、20190404、20190405、20190406的样品色谱图。
表6.重复性试验相似度评价结果(共有峰相对保留时间)
表7.重复性试验相似度评价结果(共有峰相对峰面积)
从上述结果可以看出，共有峰相对保留时间的RSD≤1.9％，共有峰相对峰面积的RSD≤3.9％，且各色谱图相似度均在0.94以上，表明此法的重复性良好，符合指纹图谱的技术要求。
3.稳定性试验
取新制备的同一供试品溶液，供试品溶液编号为1，生产批号为20190401；按供试品溶液的制备方法制备供试液，按照辣木提取物指纹图谱检测方法最佳色谱条件，分别于供试品溶液的制备后的0、2、4、6、8、24h时进样，记录各色谱图，考察20个共有峰相对保留时间和相对峰面积，实验数据结果见表8-9，实验谱图见附图5。
表8.稳定性试验相似度评价结果(共有峰相对保留时间)
表9.稳定性试验相似度评价结果(共有峰相对峰面积)
从上述结果可以看出，共有峰相对保留时间的RSD≤1.9％，共有峰相对峰面积的RSD≤4.0％，且各色谱图相似度均在0.94以上，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。
综上所述，根据以上指纹图谱方法学考察方法学考察结果，表明该方法测定辣木提取物的指纹图谱，精密度、重复性、稳定性均较好，能够准确测定该提取物的指纹图谱。
五、辣木提取物指纹图谱的建议、共有峰的指认及相似度评价
采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版)对表1中12个批次辣木供试品溶液按“二、供试品溶液和对照品溶液的制备”供试品溶液的制备方法制备供试液，按照“三、色谱条件的选择”中辣木提取物指纹图谱检测方法最佳色谱条件的方法进行液相分析，收集12批次样品的图谱数据进行分析，以样品编号1为参考图谱，以平均数法生成共有模式作为对照图谱，时间窗宽度为0.1s，得到12批样品的图谱均有20个共有峰，经对照品及紫外光谱对照，确认出7号峰为没食子酸、见附图6，18号峰为异槲皮苷、见附图7。其中7号峰峰型和分离度较好，故选择作为参照峰，计算各共有峰与参照峰的相对保留时间和相对峰面积，得到12批次辣木提取物指图图谱，见附图8所示；辣木提取物标准指纹图谱见附图9。
12批辣木提取物20个共有峰相对保留时间和相对峰面积实验数据结果见表10-11。得到12批次辣木提取物指图图谱，见附图8所示。在表10-11以及附图8中，S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11、S12分别代表生产批次为20190401、20190402、20190403、20190404、201904015、20190406、20190407、20190408、20190409、201904010、2019040111、201904012的辣木提取物样品。
表10. 12批产品指纹图谱共有峰相对保留时间
根据上述数据，以7号峰作为参照峰，计算各共有峰与参照峰的相对保留时间和相对标准偏差，峰1-20的相对保留时间分别如下：1号峰平均相对保留时间为0.28±0.007；2号峰平均相对保留时间为0.31±0.004；3号峰平均相对保留时间为0.38±0.003；4号峰平均相对保留时间为0.46±0.009；5号峰平均相对保留时间为0.54±0.01；6号峰平均相对保留时间为0.6±0.008；7号峰平均相对保留时间为1.00±0.00；8号峰平均相对保留时间为1.06±0.002；9号峰平均相对保留时间为2.07±0.011；10号峰平均相对保留时间为2.73±0.024；11号峰平均相对保留时间为2.92±0.032；12号峰平均相对保留时间为3.13±0.049；13号峰平均相对保留时间为3.7±0.025；14号峰平均相对保留时间为3.81±0.036；15号峰平均相对保留时间为4.35±0.041；16号峰平均相对保留时间为5.24±0.061；17号峰平均相对保留时间为6.16±0.064；18号峰平均相对保留时间为6.48±0.076；19号峰平均相对保留时间为6.67±0.086；20号峰平均相对保留时间为7.35±0.202。
表11. 12批产品指纹图谱共有峰相对峰面积
从结果中可以看出，共有峰的相对保留时间的RSD≤2.6％，共有峰相对峰面积的RSD≤3.0％，且各色谱图相似度均在0.91以上，这说明本产品在生产过程中工艺稳定、产品质量控制良好，也说明使用指纹图谱技术可以对本产品的质量控制提供一种快捷、准确的质量标准。可以做为辣木提取物质量评价和质量控制标准。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。

Claims (9)

1.一种辣木提取物指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.供试品溶液的制备：以辣木提取物样品制成供试品溶液，备用；
b.对照品溶液的制备：分别取没食子酸对照品和异槲皮苷对照品，分别制成没食子酸对照品溶液和异槲皮苷对照品溶液，备用；
c.高效液相色谱测定：采用高效液相色谱仪，以甲醇和无机酸的水溶液作为流动相分别将供试品溶液、没食子酸对照品溶液和异槲皮苷对照品溶液进行检测，色谱柱进行梯度洗脱，并且在所述梯度洗脱的过程中控制所述甲醇的体积占所述流动相总量的百分比由5％增加至98％；所述无机酸的体积占所述流动相总量的百分比由95％降低至2％，将得到高效液相色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统分析，得到辣木提取物的指纹图谱。
2.根据权利要求1所述的一种辣木提取物指纹图谱的建立方法，其特征在于，辣木提取物的制备方法，至少包括以下步骤：
(1)原材前处理：取辣木药材，使用粉碎机粉碎后过网筛，所述网筛的孔径为0.8-1.2mm，得辣木粉；
(2)提取：采用高效高压差低温连续式提取设备，按照药材料液质量比为1：15-50的比例加入水进行提取，提取的温度为≤30℃、提取压力≥20Mpa，得辣木提取液；
(3)离心：将辣木提取液采用离心机离心，离心机转速为3500-15000r/min，得到辣木离心液；
(4)过滤：辣木离心液用孔径≤500nm的陶瓷膜进行微滤，得到辣木微滤清液；
(5)浓缩：辣木微滤清液经过反渗透膜进行膜进行浓缩，得到辣木膜浓缩液；
(6)灭菌、干燥：辣木膜浓缩液进入10万级以上洁净区，添加辅料、灭菌、进行干燥，得到辣木叶干燥粉；
(7)制粒：辣木叶干燥粉添加粘合剂进行制粒，制粒工序为湿法制粒/干法制粒。
3.根据权利要求1所述的一种辣木提取物指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述步骤a中供试品的制备方法具体为：取8-16批次的辣木提取物0.85-1.15g，加入10ml容量瓶中，用纯化水定容，摇匀后用水系微孔滤膜过滤，即得若干个批次供试品溶液。
4.根据权利要求1所述的一种辣木提取物指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述步骤b中对照品溶液的制备方法具体为：精密称取没食子酸5-20mg、异槲皮苷5-15mg于100mL容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得没食子酸对照品溶液、异槲皮苷对照品溶液。
5.根据权利要求1所述的一种辣木提取物指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤c中高效液相色谱的检测条件为：色谱柱为DiamonsiC18色谱柱，流动相A为甲醇；流动相B为有机酸的水溶液；检测波长：230nm；柱温：30-35℃；流速：0.8-1.5mL·min－1；进样量5-20uL，洗脱程序为梯度洗脱。
6.根据权利要求1所述的一种辣木提取物指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述无机酸的水溶液选自体积百分比浓度为0.02～0.1％的磷酸水溶液。
7.根据权利要求1或5所述的一种辣木提取物指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述梯度洗脱具体如下：
t＝0～20min：5～10％甲醇、95％～90％无机酸水溶液；
t＝20～40min：10～28％甲醇、90％～72％无机酸水溶液；
t＝40～65min：28-50％甲醇、72％～50％无机酸水溶液；
t＝65～75min：50-100％甲醇、50％～2％无机酸水溶液。
8.一种按如权利要求1-6任一所述辣木提取物指纹图谱的建立方法得到的指纹图谱，其特征在于，所述指纹图谱中共有峰为20个，其中7号峰为没食子酸，18号峰为异槲皮苷。
9.一种如权利要求7所述指纹图谱，其特征在于，以7号峰作为参照峰，计算各共有峰与参照峰的相对保留时间和相对标准偏差，峰1-20的相对保留时间分别如下：1号峰平均相对保留时间为0.28±0.007；2号峰平均相对保留时间为0.31±0.004；3号峰平均相对保留时间为0.38±0.003；4号峰平均相对保留时间为0.46±0.009；5号峰平均相对保留时间为0.54±0.01；6号峰平均相对保留时间为0.6±0.008；7号峰平均相对保留时间为1.00±0.00；8号峰平均相对保留时间为1.06±0.002；9号峰平均相对保留时间为2.07±0.011；10号峰平均相对保留时间为2.73±0.024；11号峰平均相对保留时间为2.92±0.032；12号峰平均相对保留时间为3.13±0.049；13号峰平均相对保留时间为3.7±0.025；14号峰平均相对保留时间为3.81±0.036；15号峰平均相对保留时间为4.35±0.041；16号峰平均相对保留时间为5.24±0.061；17号峰平均相对保留时间为6.16±0.064；18号峰平均相对保留时间为6.48±0.076；19号峰平均相对保留时间为6.67±0.086；20号峰平均相对保留时间为7.35±0.202。
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