CN111830150B - 一测多评法测定新塔花中黄酮类成分含量的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新塔花总黄酮有效部位一测多评方法，其特征在于，采用芦丁作为内参物进行一测多评，建立芦丁与新塔花中菜苷、木犀草苷、蒙花苷之间的相对校正因子，通过校正因子计算新塔花中菜苷、木犀草苷、蒙花苷的含量，采用液相色谱法进行测定。本发明检测方法高实用性、操作简单、节约成本，弥补仅测定单一组分芦丁含量的不足，可以有效检测出新塔花中芦丁、芹菜苷、木犀草苷、蒙花苷四种成分的含量的同时，进一步提高新塔花总黄酮有效部位的质量控制。

Description

一测多评法测定新塔花中黄酮类成分含量的方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种药物的分析检测方法，具体涉及一种采用一测多评法测定新塔花中黄酮类成分含量的方法。
背景技术
新塔花是维吾尔医常用药材，拉丁名(Ziziphorabungeana.Juz.)根据《新疆植物志》、《新疆药用植物志》记载，新塔花广泛生长于天山一带，新疆和中亚的哈萨克斯坦、吉尔吉斯坦等地都有生长。维吾尔族民间用其垒草煎汤内服，可缓解胸闷、头晕等症状，现临床用于治疗冠心病、高血压及调节心血管系统功能等疾病。其中的黄酮类化合物具有广泛的药理活性及营养保健作用，已有研究表明其黄酮类成分有治疗心肌缺血的作用，能提高超氧化物歧化酶、谷光甘肽酶的活性，降低丙二醛含量，消除引起细胞损伤衰老的氧自由基，使缺血缺氧、受损心肌细胞恢复，是一种有着良好开发潜力的民族药材。
由于植物化学成分的复杂性，多指标含量测定已经成为植物来源药物质量控制的共识。目前，越来越多的国内外植物药标准将多指标含量测定收录其中。然而，在多指标含量测定方法实施的过程中，对照品消耗量大，检测操作难度高，严重制约了该方法的推广应用，同时对药用植物的质控及其产业发展代理瓶颈。
现有的新塔花总黄酮测定方法中，CN101513448-一种新塔花总黄酮的制备方法及其应用、CN101623325-芳香新塔花总黄酮提取物及其生产方法和心血管药物的应用、及李国柱等在《维药新塔花中总黄酮纯化工艺研究》中提供的新塔花黄酮已提取方均为粗放式的总黄酮提取方法，并不能够用于对于新塔花总黄酮有效部位的质量控制，并且检测操作复杂、成本较高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种采用一测多评法测定新塔花黄酮类成分的方法及其应用，针对现有单一成分和多指标含量测定方法的不足，本发明提供一种高实用性、操作简单、节约成本的针对新塔花中芦丁、芹菜苷、木犀草苷和蒙花苷四种成分的检测方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
采用一测多评法测定新塔花成分的方法，采用廉价易得的芦丁作为内参物进行一测多评，建立芦丁与新塔花中芦丁、芹菜苷、木犀草苷和蒙花苷之间的相对校正因子，通过校正因子计算新塔花中芦丁、芹菜苷、木犀草苷和蒙花苷的含量，采用液相色谱法进行测定，具体方法如下：
(1)材料准备：将供试品新塔花磨成粉末，过2号筛备用；
(2)对照品溶液的制备：芦丁、木犀草苷、芹菜苷、蒙花苷均对照品精密称取，用甲醇溶解，制成浓度为1.0mg/ml的对照溶液；分别取上述标准对照品溶液10，30，70，500μL，用甲醇定容至1mL，混合摇匀，作为混合对照品溶液；
(3)供试品溶液的制备：
精密称取芳香新塔花总黄酮样品每0.04g，置于10mL量瓶中，加甲醇约9mL超声处理使溶解，功率200W，频率40kHz，放冷后加甲醇定容至刻度，浓度4.0mg/mL，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液，备用；
(4)色谱条件及系统适用性试验：
流动相：水相为：0.1％磷酸-水，有机相为：35-45％甲醇；
梯度洗脱程序：0.01→40min，有机相：25％→30％，40.01→75min，39％。75.1min停止；
检测波长：359-361nm；流速：0.8-1.2mL/min；柱温：26℃；分离度大于1.5，理论塔板数按芦丁计算不低于5000；
(5)测定：将供试品溶液放于离心机中13000r/min离心10分钟，精密吸取上清液10μL，注入液相色谱仪，采用内标法计算，供试品溶液的特征图谱中呈现木犀草苷、芦丁、蒙花苷和芹菜苷的峰值，通过与芦丁的相对校正因子计算木犀草苷、芦丁、蒙花苷和芹菜苷的含量。
优选的，所述的检测波长为360nm。
优选的，所述检测流速为1mL/min。
优选的，所述有机相为35％的甲醇。
优选的，所述液相色谱仪可选用Agilent1220，岛津LC-20AT型，Waterse2695-2489型高效液相色谱系统。
优选的，所述液相色谱柱可选用Hypersil ODS-2(C18)(4.6mm×150mm，5μm，批号：12190)色谱柱，Hypersil ODS-2(C18)(4.6mm×250mm，5μm，批号：12190)色谱柱，HypersilODS-2(C18)(4.6mm×150mm，5μm批号：10765)。
取步骤(2)混合对照品溶液，分别进样1、2、4、6、8、10μL测定，以芦丁为内标，分别计算木犀草苷、蒙花苷、芹菜苷的相对校正因子fR，采用Agilent1220，岛津LC-20AT型，Waterse2695-2489型3种高效液相色谱系统，Hypersil ODS-2(C18)(4.6mm×150mm，5μm，批号：12190)色谱柱，Hypersil ODS-2(C18)(4.6mm×250mm，5μm，批号：12190)色谱柱，Hypersil ODS-2(C18)(4.6mm×150mm，5μm批号：10765)考察色谱柱对fR的影响，木犀草苷、芦丁、蒙花苷和芹菜苷四个成分的相对标准偏差RSD＜2％，从中确定芦丁、蒙花苷、芹菜苷的相对校正因子fR为各实验所得数据的平均值，分别是0.932、1.337、4.011。
本发明还提供一种一测多评法测定新塔花中黄酮类成分含量的方法在检测新塔花中木犀草苷、芦丁、蒙花苷和芹菜苷中的应用。
通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下有益效果：
1、本发明选用芦丁作为内参物进行一测多评法测定新塔花中黄酮类成分含量，芦丁价廉容易得到，从而可以节省时间成本、劳动成本，而且方法快速、准确，能更全面的知晓新塔花质量。
2、针对现有单一成分和多指标含量测定方法的不足，本发明检测方法高实用性、操作简单、节约成本，可以有效检测出新塔花中芦丁、芹菜苷、木犀草苷和蒙花苷四种成分的含量。
3、通过比较一测多评法和标准曲线法的结果差异，两种方法所得含量结果相近，明一测多评所得的含量计算结果与标准曲线法所得结果相似，在不同的实验条件下，各成分之间的校正因子重现性好(RSD＜2％)，能够有效进行新塔花中芦丁、芹菜苷、木犀草苷和蒙花苷四种成分的含量测定。
4、在对照缺乏的情况下，本发明的方法可以应用于新塔花的质量评价，同时测定新塔花中4个化合物的方法简便、快捷，为建立新塔花药材的质量评价提供依据。
5、构建了新塔花黄酮类成分的一测多评检测方法，由此可以更好更全面的控制新塔花的质量，同时规避由多成含量测定带来的成本和操作问题，方法简单便于操作，且测定结果准确，方法重复性，耐用性好。
附图说明
图1所示为流速0.9mL/min时的总黄酮样品HPLC色谱图。
图2所示为流速1mL/min时的总黄酮样品HPLC色谱图。
图3所示为45％有机相等度洗脱的总黄酮样品HPLC色谱图。
图4所示为40％有机相等度洗脱的总黄酮样品HPLC色谱图。
图5所示为35％有机相等度洗脱的总黄酮样品HPLC色谱图。
图6所示为梯度洗脱的总黄酮样品HPLC色谱图。
图7所示为第一次优化梯度洗脱的总黄酮样品HPLC色谱图。
图8所示为第二次优化梯度洗脱的总黄酮样品HPLC色谱图。
图9所示为第三次优化梯度洗脱的总黄酮样品HPLC色谱图。
图10所示为优选色谱条件下的总黄酮HPLC色谱图。
图11所示为混合标准品的HPLC色谱图，图中1为木犀草苷；2为芦丁；3为芹菜苷；4为蒙花苷。
图12所示为总黄酮样品的HPLC色谱图，图中1为木犀草苷；2为芦丁；3为芹菜苷；4为蒙花苷。
具体实施方式
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。
本发明中采用设备有：Agilent 1220LC型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；岛津LC-20AT型(日本岛津公司)，ME204E型分析天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；DHG-9145A型电热恒温鼓风干燥箱(上海齐欣科学仪器有限公司)；KQ-5200DE型数控超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)，色谱柱为依利特Hypersil ODS-2(C18)(4.6mm×150mm，5μm，批号：12190)，依利特Hypersil ODS-2(C18)(4.6mm×250mm，5μm)，依利特HypersilODS-2(C18)(4.6mm×150mm，5μm，批号：10765)。
本发明中选用的所有试剂：新塔花药材(购自第四临床医学院药剂科)，总黄酮有效部位(新疆名医名方与特色方剂学重点实验室制备，含量76％。木犀草苷(批号：5373-11-5，成都瑞芬思生物科技有限公司，含量＞98％)；芦丁(中国药品生物制品检定所，批号：100080-200707，含量＞98％)；芹菜苷(批号：Q-077-150720，成都瑞芬思生物科技有限公司，含量＞98％)；甲醇(色谱纯)；磷酸(分析纯)。其他试剂均为分析纯。
本发明中选用的所有试剂和仪器、设备都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
实施例一：一测多评法测定新塔花中黄酮类成分含量的方法
采用一测多评法测定新塔花成分的方法，采用廉价易得的芦丁作为内参物进行一测多评，建立芦丁与新塔花中芦丁、芹菜苷、木犀草苷和蒙花苷之间的相对校正因子，通过校正因子计算新塔花中芦丁、芹菜苷、木犀草苷和蒙花苷的含量，采用液相色谱法进行测定，具体方法如下：
(1)材料准备：将供试品新塔花磨成粉末，过2号筛备用；
(2)对照品溶液的制备：芦丁、木犀草苷、芹菜苷、蒙花苷均对照品精密称取，用甲醇溶解，制成浓度为1.0mg/ml的对照溶液；分别取上述标准对照品溶液10，30，70，500μL，用甲醇定容至1mL，混合摇匀，作为混合对照品溶液；
(3)供试品溶液的制备：
精密称取芳香新塔花总黄酮样品每0.04g，置于10mL量瓶中，加甲醇约9mL超声处理(功率200W，频率40kHz)使溶解，放冷后加甲醇定容至刻度，浓度4.0mg/mL，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液，备用；
(4)色谱条件及系统适用性试验：
流动相：水相为0.1％磷酸-水，有机相为35-45％甲醇；
梯度洗脱程序：0.01→40min，有机相：25％→30％，40.01→75min，39％。75.1min停止；
检测波长：359-361nm；流速：0.8-1.2mL/min；柱温：26℃；分离度大于1.5，理论塔板数按芦丁计算不低于5000；
(5)测定：将供试品溶液放于离心机中13000r/min离心10分钟，精密吸取上清液10μL，注入液相色谱仪，采用内标法计算，供试品溶液的特征图谱中呈现木犀草苷、芦丁、蒙花苷和芹菜苷的峰值，通过与芦丁的相对校正因子计算木犀草苷、芦丁、蒙花苷和芹菜苷的含量。
实施例二：一测多评法测定新塔花中黄酮类成分含量的方法
基于实施例一，取步骤(2)混合对照品溶液，分别进样1、2、4、6、8、10μL测定，以芦丁为内标，分别计算木犀草苷、蒙花苷、芹菜苷的相对校正因子fR，采用Agilent1220，岛津LC-20AT型，Waterse2695-2489型3种高效液相色谱系统，Hypersil ODS-2(C18)(4.6mm×150mm，5μm，批号：12190)色谱柱，Hypersil ODS-2(C18)(4.6mm×250mm，5μm，批号：12190)色谱柱，Hypersil ODS-2(C18)(4.6mm×150mm，5μm批号：10765)考察色谱柱对fR的影响，木犀草苷、芦丁、蒙花苷和芹菜苷四个成分的相对标准偏差RSD＜2％，从中确定芦丁、蒙花苷、芹菜苷的相对校正因子fR为各实验所得数据的平均值，分别是0.932、1.337、4.011。
实施例三：芳香新塔花总黄酮有效部位化学成分的定性分析
(1)HPLC分析方法的建立
①流速的考察
色谱系统一：依利特Hypersil ODS2(4.6mm×150mm)，流动相A为水相：0.1％磷酸-水，流动相B为有机相：甲醇，波长360nm，梯度洗脱：0.01→55min，有机相：25％→28％，55.01→70min，28％→35％，70.01→85min，38％，85.1min停止，柱温26℃。流速0.9mL/min。结果如附图1所示。结果显示，由附图1可知，采用梯度洗脱系统，流速0.9mL/min，部分色谱峰未有效分离，分离度较差，需进一步调节色谱条件。
色谱系统二：依利特Hypersil ODS2(4.6mm×150mm)，流动相A为水相：0.1％磷酸-水，流动相B为有机相：甲醇，波长360nm，梯度洗脱：0.01→55min，有机相：25％→28％，55.01→70min，28％→35％，70.01→85min，38％，85.1min停止，柱温26℃。流速1.0mL/min。结果见附图2。结果显示，由附图2可知，采用梯度洗脱系统，流速1mL/min，峰形有改善，但部分色谱峰未有效分离，需进一步调节色谱条件。
②等度洗脱系统
色谱系统一：依利特Hypersil ODS2(4.6mm×150mm)，流动相A为水相：0.1％磷酸-水，流动相B为有机相：甲醇，流速1mL/min，波长360nm，柱温：26℃。45％有机相等度洗脱，30min停止，结果见附图3。结果显示，如附图3所述，采用45％甲醇进行等度洗脱，各色谱峰分离度未达到相关的要求，均未有效分离，需进一步调节色谱条件。
色谱系统二：依利特Hypersil ODS2(4.6mm×150mm)，流动相A为水相：0.1％磷酸-水，流动相B为有机相：甲醇，流速1mL/min，波长360nm，柱温：26℃。40％有机相等度洗脱，40min停止，结果见附图4。结果显示，如附图4所示，采用40％甲醇进行等度洗脱，各色谱峰分离情况较45％甲醇要好，大部分色谱峰均未有效分离，需进一步调节色谱条件。
色谱系统三：依利特Hypersil ODS2(4.6mm×150mm)，流动相A为水相：0.1％磷酸-水，流动相B为有机相：甲醇，流速1mL/min，波长360nm，柱温：26℃。35％有机相等度洗脱，70min停止，结果见附图5。结果显示，如附图5所示，采用35％的甲醇进行等度洗脱系统，各色谱峰分离情况较45％的较甲醇要好，大部分色谱峰均未有效分离，需进一步调节色谱条件。
研究表明，等度洗脱不能完全将色谱峰有效分离，故考虑梯度洗脱系统进一步分离。
③梯度洗脱系统
色谱系统一：依利特Hypersil ODS2(4.6mm×150mm)，流动相A为水相：0.1％磷酸-水，流动相B为有机相：甲醇，流速1mL/min，波长360nm，柱温：26℃。梯度洗脱：梯度：0.01→20min，有机相：27％→25％，20.01→35min，25％→30％，35.01→75min，38％，75.1min停止，结果见附图6。结果显示，如附图6所示，采用梯度洗脱系统，峰形虽有改善，部分色谱峰仍未有效分离，需进一步调节色谱条件。
色谱系统二：依利特Hypersil ODS2(4.6mm×150mm)，流动相A为水相：0.1％磷酸-水，流动相B为有机相：甲梯度醇，流速1mL/min，波长360nm，柱温：26℃。梯度洗脱：梯度：0.01→25min，有机相：27％→25％，25.01→35min，25％→30％，35.01→75min，38％，75.1min停止，结果见附图7。结果显示，如附图7所示，采用梯度洗脱系统，峰形虽有改善，部分色谱峰仍未有效分离，需进一步调节色谱条件。
色谱系统三：依利特Hypersil ODS2(4.6mm×150mm)，流动相A为水相：0.1％磷酸-水，流动相B为有机相：甲醇，流速1mL/min，波长360nm，柱温：26℃。梯度洗脱：梯度：0.01→20min，有机相：26％→25％，20.01→35min，25％→30％，35.01→75min，38％，75.1min停止，结果见附图8。结果显示，如附图8所示，采用梯度洗脱系统，峰形虽有改善，部分色谱峰仍未有效分离，需进一步调节色谱条件。
色谱系统四：依利特Hypersil ODS2(4.6mm×150mm)，流动相A为水相：0.1％磷酸-水，流动相B为有机相：甲醇，流速1mL/min，波长360nm，柱温：26℃。梯度洗脱：梯度：0.01→25min，有机相：26％→25％，25.01→35min，25％→30％，35.01→75min，38％，75.1min停止，结果见附图9。结果显示，如附图9所示，采用梯度洗脱系统，峰形虽有改善，部分色谱峰仍未有效分离，需进一步调节色谱条件。
以上研究结果说明，梯度洗脱系统相对于等度洗脱系统分离效果要好，峰形有较大改善，分离度提高，而部分色谱峰分离度仍未达到要求，需要进一步调节色谱条件。
④优选的色谱条件
依利特Hypersil ODS2(4.6mm×150mm)，流动相A为水相：0.1％磷酸-水，流动相B为有机相：甲醇，流速1mL/min；梯度洗脱。柱温26℃；梯度：0.01→40min，有机相：25％→30％，40.01→75min，39％。75.1min停止；流速1mL/min，波长360nm，结果见附图10。由附图10可见，各色谱峰得到了有效分离，故优选色谱条件为：依利特Hypersil ODS2(4.6mm×150mm)，流动相A为水相：0.1％磷酸-水，流动相B为有机相：甲醇，流速1mL/min；梯度洗脱。柱温26℃；梯度：0.01→40min，有机相：25％→30％，40.01→75min，39％。75.1min停止；流速1mL/min，检测波长360nm。
实施例四：HPLC定性分析
(1)对照品溶液的配置
精密称取木犀草苷、芦丁、芹菜苷、蒙花苷对照品适量，加甲醇分别制成每1mL含木犀草苷1.0mg，芦丁1.0mg，芹菜苷1.0mg，蒙花苷1.0mg的对照品溶液作为储备液，备用。
(2)混合对照品溶液的配置
分别取上述标准对照品溶液10，30，70，500μL，用甲醇定容至1mL，制成混合对照品溶液，备用。
(3)总黄酮供试品溶液的配置
精密称取芳香新塔花总黄酮提取物干膏粉约1.0mg，置于10mL量瓶中，加甲醇约0.9mL超声处理(功率200W，频率40kHz)使溶解，放冷后加甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液，备用。
(4)色谱条件
依利特Hypersil ODS2(4.6mm×150mm)，流动相A为水相：0.1％磷酸-水，流动相B为有机相：甲醇，流速1mL/min；梯度洗脱。柱温26℃；梯度：0.01→40min，有机相：25％→30％，40.01→75min，39％。75.1min停止；流速1mL/min，检测波长360nm。
(5)结果
在上述色谱条件下，混合对照品溶液中木犀草苷、芦丁、芹菜苷和蒙花苷的保留时间分别为28.883，32.337，40.967和59.590min，通过比对芳香新塔花总黄酮供试品溶液色谱图，发现在相同保留时间下有对应色谱峰，其保留时间分别为29.030，32.370，41.160和59.843min，说明总黄酮含有木犀草苷、芦丁、芹菜苷和蒙花苷4种黄酮成分。该色谱条件下供试品溶液与混合对照品溶液中五种成分的色谱峰峰形均良好，分离度均大于1.5，理论塔板数均大于5000。对照品溶液、混合对照品溶液与芳香新塔花总黄酮供试品溶液的色谱图见附图11、附图12。
实施例五：“一测多评”方法的建立
(1)混合对照品溶液的配制
分别精密称取木犀草苷对照品0.15mg、芦丁对照品0.30mg，芹菜苷对照品0.70mg，蒙花苷对照品5.0mg，置10mL的棕色量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，配制木犀草苷0.015mg/mL、芦丁0.03mg/mL、芹菜苷0.07mg/mL、蒙花苷0.5mg/mL的对照品储备液，4℃保存备用，单一成分对照品和混合对照品的HPLC色谱图见附图11、附图12。
(2)供试品溶液的配制
精密称取芳香新塔花总黄酮样品0.04g(二号筛)，置于10mL量瓶中，加甲醇约9mL超声处理(功率200W，频率40kHz)使溶解，放冷后加甲醇定容至刻度，浓度4.0mg/mL，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液，备用。
(3)相对校正因子RCF的确定及重复性试验
木犀草苷、芦丁、芹菜苷、蒙花苷0.5mg/mL质量浓度分别为0.015mg/mL、0.03mg/mL、0.07mg/mL、0.5mg/mL的混合对照品溶液，分别进样1、2、4、6、8、10μL进样(平行3次)，测定木犀草苷、芹菜苷、蒙花苷及芦丁的峰面积，根据木犀草苷、芹菜苷、蒙花苷和芦丁的回归方程及相关线性范围，以芦丁为内参物，根据相对校正因子公式RCF＝fsi＝fs/fi＝(AS/CS)/(Ai/Ci)＝(As×Ci)/(Cs×Ai)，式中AS为内参物峰面积，CS为内参物浓度；Ai为待测成分峰面积，Ci为待测成分浓度。分别计算木犀草苷、芹菜苷、蒙花苷对芦丁的相对校正因子(Relativecorrection factor，RCF)。试验结果见表1。
表1：芳香新塔花总黄酮中3种黄酮类成分的相对校正因子(n＝3)
Figure BDA0002559967450000141
Figure BDA0002559967450000151
(4)相对校正因子RCF的耐用性考察
①不同高效液相色谱仪和色谱柱对fs/i的影响
分别采用Agilent 1220，岛津LC-20AT型，Waters e2695-2489型3种高效液相色谱系统，Hypersil ODS-2(C18)(4.6mm×150mm，5μm，批号：12190)色谱柱，Hypersil ODS-2(C18)(4.6mm×250mm，5μm，批号：12190)色谱柱，Hypersil ODS-2(C18)(4.6mm×150mm，5μm，批号：10765)色谱柱，分别考察不同色谱系统和色谱柱对RCF的影响。具体结果见表2。试验结果表明，不同色谱仪和色谱柱，对木犀草苷、芹菜苷和蒙花苷的相对校正因子RCF值影响较小，RSD分别为0.68％，1.87％，0.67％，各成分在不同色谱仪和色谱柱的fs/i的RSD均小于2.0％，表明建立木犀草苷、芹菜苷及蒙花苷对芦丁的相对校正因子耐用性良好。
表2：不同高效液相色谱仪和色谱柱对RCF的影响
Figure BDA0002559967450000152
Figure BDA0002559967450000161
②不同流速对fs/i的影响
采用依利特Hypersil ODS-2(C18)柱子，分别考察不同流速(0.8，1.0，1.2mL·min-1)对RCF的影响，精密吸取混合对照品溶液5μL注入液相色谱仪中，记录峰面积。各待测成分RCF值所对应的RSD％均小于2.5％，表明流动相流速对RCF值无显著影响，结果见表3。
表3：不同流速考察RCF值的耐用性(n＝3)
流速(mL/min) f<sub>木犀草苷/芦丁</sub> f<sub>芹菜苷/芦丁</sub> f<sub>蒙花苷/芦丁</sub>
0.8 0.929 1.326 4.053
1 0.939 1.340 3.948
1.2 0.930 1.347 4.084
均值 0.934 1.338 4.016
RSD％ 0.74 0.81 2.40
③不同检测波长对fs/i的影响
采用依利特Hypersil ODS-2(C18)柱子安捷伦1220，分别考察不同检测波长(359，360，361nm)对RCF的影响，精密吸取混合对照品溶液5μL注入液相色谱仪中，记录峰面积。各待测成分RCF值所对应的RSD％均小于2％，表明检测波长对RCF值无显著影响，结果见表4。
表4：不同检测波长考察RCF值的耐用性(n＝3)
波长(nm) f<sub>木犀草苷/芦丁</sub> f<sub>芹菜苷/芦丁</sub> f<sub>蒙花苷/芦丁</sub>
359 0.931 1.355 4.001
360 0.942 1.334 3.978
361 0.931 1.339 4.029
均值 0.935 1.342 4.002
RSD％ 0.66 0.81 0.64
④待测组分色谱峰的定位
色谱峰的准确定位是保证QAMS法应用的前提，一般可以采用保留时间差(Δts/i)或相对保留值(ts/i)等参数定位。以芦丁为参照，分别考察木犀草苷、芹菜苷、蒙花苷与内参物芦丁相对保留时间的比值(retention time ratio，RTR)在不同仪器和色谱柱上的重现性。各待测组分相对保留时间无明显差异，RSD值均小于5％，可以用来进行色谱峰的定位。结果见表5。
表5：不同仪器和色谱柱测得的各组分相对保留值(RTR)
Figure BDA0002559967450000171
Figure BDA0002559967450000181
实施例六：一测多评方法准确性验证
1、样品含量测定
(1)试验药品
购置第四临床医学院制备天香丹所用新塔花共计15批，批号见表6。
表6：芳香新塔化采集情况表
Figure BDA0002559967450000182
Figure BDA0002559967450000191
(2)一测多评法与标准曲线法测定样品含量的比较
取分别从15批芳香新塔花制备的总黄酮粉末，按实施例五中提供的方法制备供试品溶液，按实施例四中提供的最优色谱条件进样分析，采用标准曲线法测定样品中木犀草苷、芦丁、芹菜苷、蒙花苷的含量，再用建立的一测多评法对其进行计算。结果如表7所示。
表7：一测多评法与标准曲线法测定芳香新塔花黄酮类成分含量比较
Figure BDA0002559967450000192
Figure BDA0002559967450000201
如表7所示，检测结果表明两种方法测得的芳香新塔花总黄酮中木犀草苷、芹菜苷和蒙花苷的含量没有显著性差异，提示一测多评法用于芳香新塔花总黄酮多成分质量评价是可行的。
通过上述检测结果显示，本发明检测方法高实用性、操作简单、节约成本，弥补仅测定单一组分芦丁含量的不足，可以有效检测出新塔花中芦丁、芹菜苷、木犀草苷、蒙花苷四种成分的含量的同时，进一步提高新塔花总黄酮有效部位的质量控制，填补了新塔花黄酮类成分定量控制的空白，使得对新塔花黄酮类成分能够进行更有效的质量分析，更全面反映产品的质量状况，保证新塔花黄酮类成分的质量稳定性，同时节省检测成本。
如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。

Claims (6)

1.一种一测多评法测定新塔花中黄酮类成分含量的方法，其特征在于，采用芦丁作为内参物进行一测多评，建立芦丁与新塔花中黄酮类中木犀草苷、蒙花苷和芹菜苷之间的相对校正因子，通过校正因子计算新塔花中黄酮类成分中木犀草苷、芦丁、蒙花苷和芹菜苷的含量，采用液相色谱法进行测定，具体方法如下：
(1)材料准备：将供试品新塔花磨成粉末，过2号筛备用；
(2)对照品溶液的制备：芦丁、木犀草苷、芹菜苷、蒙花苷对照品均精密称取，用甲醇溶解，制成浓度为1.0mg/mL的对照溶液；分别取上述标准对照品溶液10，30，70，500μL，用甲醇定容至1mL，混合摇匀，作为混合对照品溶液；
(3)供试品溶液的制备：
精密称取芳香新塔花总黄酮样品0.04g，置于10mL量瓶中，加甲醇约9mL超声处理使溶解，功率200W，频率40kHz，放冷后加甲醇定容至刻度，浓度4.0mg/mL，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液，备用；
(4)色谱条件及系统适用性试验：
流动相：水相：0.1％磷酸-水，有机相：甲醇；
梯度洗脱程序：0.01→40min，有机相：25％→30％，40.01→75min，39％，75.1min停止；
检测波长：359-361nm；流速：0.8-1.2mL/min；柱温：26℃；分离度大于1.5，理论塔板数按芦丁计算不低于5000；
液相色谱柱选用Hypersil ODS-2(C18)，4.6mm×150mm，5μm，批号：12190 色谱柱；Hypersil ODS-2(C18)，4.6mm×250mm，5μm，批号：12190色谱柱；Hypersil ODS-2(C18)，4.6mm×150mm，5μm批号：10765色谱柱中的一种；
(5)测定：将供试品溶液放于离心机中13000r/min离心10分钟，精密吸取上清液10μL，注入液相色谱仪，采用内标法计算，供试品溶液的特征图谱中呈现木犀草苷、芦丁、蒙花苷和芹菜苷的峰值，通过与芦丁的相对校正因子计算木犀草苷、芦丁、蒙花苷和芹菜苷的含量。
2.根据权利要求1所述的一种一测多评法测定新塔花中黄酮类成分的方法，其特征在于，所述检测波长为360nm。
3.根据权利要求1所述的一种一测多评法测定新塔花中黄酮类成分的方法，其特征在于，所述检测流速为1mL/min。
4.根据权利要求1所述的一种一测多评法测定新塔花中黄酮类成分的方法，其特征在于，所述液相色谱仪选用Agilent1220，岛津LC-20AT型，Waterse2695-2489型高效液相色谱系统中的一种。
5.根据权利要求1所述的一种一测多评法测定新塔花中黄酮类成分的方法，其特征在于，取步骤(2)混合对照品溶液，分别进样1、2、4、6、8、10μL测定，以芦丁为内标，分别计算木犀草苷、蒙花苷、芹菜苷的相对校正因子fR，采用Agilent1220，岛津LC-20AT型，Waterse2695-2489型3种高效液相色谱系统，Hypersil ODS-2(C18)，4.6mm×150mm，5μm，批号：12190 色谱柱；Hypersil ODS-2(C18)，4.6mm×250mm，5μm，批号：12190 色谱柱；Hypersil ODS-2(C18)，4.6mm×150mm，5μm批号：10765 三种色谱柱，考察不同高效液相色谱系统和色谱柱对fR的影响，木犀草苷、芦丁、蒙花苷和芹菜苷四个成分的相对标准偏差RSD＜2％，从中确定芦丁、蒙花苷、芹菜苷的相对校正因子fR为各实验所得数据的平均值，分别是0.932、1.337、4.011。
6.如权利要求1所述的一种一测多评法测定新塔花中黄酮类成分含量的方法在检测新塔花中木犀草苷、芦丁、蒙花苷和芹菜苷中的应用。
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