CN115219623B - 一种银杏叶颗粒中总黄酮醇苷和萜类内酯含量的测定方法 - Google Patents
一种银杏叶颗粒中总黄酮醇苷和萜类内酯含量的测定方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及药物分析方法技术领域，尤其是涉及一种银杏叶颗粒中总黄酮醇苷和萜类内酯含量的测定方法，其中，所述银杏叶颗粒中总黄酮醇苷含量测定的方法包括：使用大孔吸附树脂柱对银杏叶颗粒进行前处理，得到待测成分；待测成分经酸化水解，得到黄酮苷元，使用HPLC法进行测定；所述银杏叶颗粒中萜类内酯含量测定的方法包括：使用硅藻土柱对银杏叶颗粒进行前处理，得到待测成分；以60‑90％甲醇溶液作为供试品和对照品的溶剂，使用HPLC‑ELSD法进行测定。本发明保证了测定结果的准确性，提高了产品质量的可控性，同时大大缩减了分析时间，简化了操作过程，提高了劳动效率且更利于人员的劳动保护和环境保护。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析方法技术领域，尤其是涉及一种银杏叶颗粒中总黄酮醇苷和萜类内酯含量的测定方法。
背景技术
银杏叶为银杏科植物银杏的干燥叶，具有活血化瘀，通络止痛，敛肺平喘，化浊降脂的作用，广泛用于瘀血阻络、胸痹心痛、中风偏瘫、肺虚咳喘、高脂血症。银杏叶中主要成分包括黄酮类、萜类内酯类、羧酸类、烷基酚类、聚戊烯醇类等，具有扩张血管、改善脑循环、抑制血小板活化因子作用。
其中，银杏叶颗粒是由银杏叶提取物，加辅料适量，混合均匀制成的颗粒，是治疗心脑血管类疾病的常用中药，具有活血化瘀通络之功能。临床用于瘀血阻络引起的胸痹心痛、中风、半身不遂、舌强语謇；冠心病稳定型心绞痛、脑梗死见上述证侯者。
银杏叶颗粒的质量控制，主要是总黄酮醇苷和萜类内酯二类成分的含量测定。经查阅《中国药典》及大量的文献，均公开了银杏叶提取物及制剂中总黄酮醇苷、萜类内酯的含量测定方法，但对于银杏叶颗粒中总黄酮醇苷及萜类内酯的含量测定尚无较为系统的方法。
目前，对于银杏叶颗粒中总黄酮醇苷含量的测定多采用以下方法：以混合对照品为标准品，供试品首先采用超声处理分离提取银杏叶提取物，再进行酸化水解为黄酮苷元后，测定其总黄酮醇苷含量。而方法学验证表明，该方法测得的结果回收率低，准确性差，含量偏低，稳定性差，不能客观正确的反映产品质量，不利于产品的质量保证。而对于银杏叶颗粒中萜类内酯的测定多采用以下方法：以混合对照品为标准品，供试品首先采用超声处理分离提取待测成份，再用乙酸乙酯、5％醋酸钠等溶液反复进行8次萃取，分离、纯化后测定萜类内酯含量。然而，该方法由于操作步骤繁琐、过程冗长，并且经方法学验证表明，该方法测定结果误差大、准确性及重现性差，不能正确的反映产品质量，导致产品质量可控性差。此外，该方法中因过多的使用有机溶剂，也不利于人员的劳动保护和环境保护。
有鉴于此，开发一种准确可靠的检测方法测定银杏叶颗粒中总黄酮醇苷和萜类内酯的含量，保证产品质量安全、有效、稳定可控，是本领域技术人员亟需解决的一项技术问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种银杏叶颗粒中总黄酮醇苷和萜类内酯含量的测定方法，该方法一方面减少了辅料对总黄酮醇苷含量测定的干扰，提高总黄酮醇苷含量测定方法的回收率和准确度；另一方面提高了对萜类内酯的分离纯化效果，保证了测定结果的准确性，提高了产品质量的可控性。
为实现上述发明的目的，本发明的技术方案为：
一种银杏叶颗粒中总黄酮醇苷和萜类内酯含量的测定方法，包括银杏叶颗粒中总黄酮醇苷含量测定的方法和银杏叶颗粒中萜类内酯含量测定的方法，
其中，所述银杏叶颗粒中总黄酮醇苷含量测定的方法包括：使用大孔吸附树脂柱对银杏叶颗粒进行前处理，得到待测成分；待测成分经酸化水解，得到黄酮苷元，使用HPLC法进行测定；
所述银杏叶颗粒中萜类内酯含量测定的方法包括：使用硅藻土柱对银杏叶颗粒进行前处理，得到待测成分；以60-90％甲醇溶液作为供试品和对照提取物的溶剂，使用HPLC-ELSD法进行测定。
本发明的银杏叶颗粒中总黄酮醇苷含量的测定方法中，使用大孔吸附树脂柱对样品进行前处理，从而对银杏叶颗粒中的银杏叶提取物和辅料进有效分离，减少辅料对总黄酮醇苷含量测定的干扰，提高总黄酮醇苷含量测定方法的回收率和准确度；本发明的银杏叶颗粒中萜类内酯含量的测定方法中，首先使用硅藻土柱对银杏叶颗粒进行前处理，对萜类内酯成分进行有效的分离纯化，选择和流动相匹配的溶剂制备对照品溶液及供试品溶液，从而提高了萜类内酯含量测定的准确度，同时大大缩减了分析时间，简化了操作过程，提高了劳动效率且更利于人员的劳动保护。
作为本技术方案优选地，所述银杏叶颗粒中总黄酮醇苷含量测定的方法具体包括：
S1、精确称取银杏叶颗粒的粉末，加溶剂水并配合超声溶散，过大孔吸附树脂柱，依次用水洗脱剂、乙醇洗脱剂洗脱，收集乙醇洗脱液，蒸干，得到待测成分；
S2、向待测成分中加入甲醇-25％盐酸溶液的混合溶液进行酸化水解，并使用甲醇定容，得到供试品溶液；
S3、以槲皮素的甲醇溶液作为对照品溶液，在相同的色谱条件下，分别测定对照品溶液和供试品溶液中黄酮苷元的峰面积，采用外标法以校正因子计算供试品溶液中总黄酮醇苷的含量；
其中，所述黄酮苷元包括槲皮素、山柰酚和异鼠李素；
总黄酮醇苷含量＝(槲皮素含量+山柰酚含量+异鼠李素含量)*2.51。
在本发明供试品溶液的制备中，取银杏叶颗粒适量，研细，取约相当于总黄酮醇苷9.6mg的粉末，精密称定，加水4-6ml，超声处理使溶散，通过已处理好的大孔吸附树脂柱，用水80-120ml洗脱，弃去洗脱液，再用乙醇80-120ml洗脱，收集乙醇洗脱液，蒸干；残渣加甲醇-25％盐酸溶液(4：1)的混合溶液25ml，摇匀，置水浴中加热回流30分钟，迅速冷却至室温，转移至50ml量瓶中，以控制酸化水解的时间的稳定性，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
而在相同的液相条件下，槲皮素、山柰酚和异鼠李素的相对保留时间及校正因子如下表A所示。
表A槲皮素、山柰酚和异鼠李素的相对保留时间及校正因子
| 待测成分(峰) | 相对保留时间 | 校正因子(F) |
| 槲皮素 | 1.00 | 1.0000 |
| 山柰酚 | 1.77 | 1.0020 |
| 异鼠李素 | 2.00 | 1.0890 |
作为本技术方案优选地，所述大孔吸附树脂柱包括型号为HPD-BJQH、AB-8、HPD450、HPD417、HPD500、K17和D101中的任意一种。
作为本技术方案优选地，相当于总黄酮醇苷9.6mg的银杏叶颗粒的粉末所对应溶剂水、水洗脱剂、乙醇洗脱剂、甲醇-25％盐酸溶液的混合溶液的量分别为4-6ml、80-120ml、80-120ml和23-27ml；
其中，所述甲醇-25％盐酸溶液的混合溶液中甲醇与25％盐酸溶液的体积比为4:1。
作为本技术方案优选地，所述酸化水解时，将溶解有待测成分的甲醇-25％盐酸溶液的混合溶液置于水浴中加热回流30min，迅速冷却至室温，转移至容量瓶使用甲醇稀释定容。
作为本技术方案优选地，所述色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相为体积比为1:1的甲醇-0.4％磷酸溶液的混合溶液；检测波长为360nm；流速为1.0ml/min；进样量为10μl。
作为本技术方案优选地，所述银杏叶颗粒中萜类内酯含量测定的方法具体包括：
S1、精确称取银杏叶颗粒的粉末，加磷酸盐缓冲液并配合超声溶散，过硅藻土柱，待磷酸盐缓冲液全部吸附于硅藻土后，静置10-20min，使用乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液，蒸干，得到待测成分；
S2、向待测成分中加入60-90％甲醇溶液并配合超声溶解，使用60-90％甲醇溶液定容，得到供试品溶液；
S3、以银杏叶总内酯对照提取物的60-90％甲醇溶液作为对照提取物溶液，在相同的色谱条件下，分别测定对照提取物溶液和供试品溶液中各内酯的峰面积，采用外标两点法对数方程分别计算各内酯的含量，内酯含量的总和即为萜类内酯的含量；
其中，所述内酯包括白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C。
在本发明供试品溶液的制备中，取银杏叶颗粒适量，研细，取约相当于萜类内酯7.2mg的粉末，精密称定，加磷酸盐缓冲液(pH值5.8)10-15ml分次超声处理使溶散，移至硅藻土柱上(硅藻土的用量为14-18g)，待缓冲液全部吸附于硅藻土后，静置10-20min，用80-120ml乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加60-90％甲醇超声使溶解，转移至5ml量瓶中，加60-90％甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
作为本技术方案优选地，相当于萜类内酯7.2mg的银杏叶颗粒的粉末所对应磷酸盐缓冲液、硅藻土、乙酸乙酯的量分别为10-15ml、14-18g和80-120ml。
作为本技术方案优选地，所述色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相为体积为1：15：84的正丙醇-四氢呋喃-水的混合溶液；检测器为蒸发光检测器；进样量为5-20μl。
作为本技术方案优选地，所述银杏叶颗粒中总黄酮醇苷含量测定时，对照品溶液中每1ml甲醇中含30μg对照品；
所述银杏叶颗粒中萜类内酯含量测定时，银杏叶总内酯对照提取物溶液中每1ml60-90％甲醇溶液中含2.5mg对照提取物。
本发明的银杏叶颗粒中总黄酮醇苷和萜类内酯含量的测定方法，至少具有以下技术效果：
1、在本发明的银杏叶颗粒中总黄酮醇苷含量的测定方法中，在对样品进行酸化水解之前，使用大孔吸附树脂柱进行前处理，对银杏叶颗粒中的银杏叶提取物和辅料进行了有效的分离，减少辅料对总黄酮醇苷含量测定的干扰，提高总黄酮醇苷含量测定方法的回收率和准确度；
2、在本发明的银杏叶颗粒中萜类内酯含量的测定方法中，使用硅藻土柱对银杏叶颗粒中萜类内酯成分进行有效的分离纯化，不仅简化了操作过程，节约了分离提纯的时间，而且提高了分离纯化的效果，进而提高了萜类内酯含量测定的准确度；与此同时，选择与流动相匹配的60-90％甲醇溶液作为溶剂制备对照提取物溶液和供试品溶液，解决了现有检测方法中色谱峰前沿及峰顶分叉的现象，提高了检测方法的准确度和重现性；
3、本发明保证了测定结果的准确性，提高了产品质量的可控性，同时大大缩减了分析时间，简化了操作过程，提高了劳动效率且更利于人员的劳动保护和环境保护；
4、本发明经过方法学验证及稳定性试验研究表明，该方法先进合理、重现性好、测定结果准确可靠，由此保证了银杏叶颗粒的质量可控。因此，本发明的实施，可促使银杏叶提取物的颗粒剂真正的实现商业化规模生产，为临床提供安全、稳定的产品，并且丰富了银杏叶提取物在临床应用的剂型和选择，彻底解决了银杏叶颗粒上市近20年来无法正常批量生产的缺陷具有重大的现实意义和临床意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为现有技术制备的总黄酮醇苷含量测定供试品溶液的HPLC图；
图2为本发明方法制备的总黄酮醇苷含量测定供试品溶液的HPLC图；
图3为现有技术制备的萜类内酯供试品溶液的HPLC图；
图4为本发明方法制备的萜类内酯供试品溶液的HPLC图；
图5为总黄酮醇苷含量测定阴性对照溶液的HPLC图；
图6为槲皮素对照品的HPLC图；
图7为山柰酚对照品的HPLC图；
图8为异鼠李素对照品的HPLC图；
图9为HPD-BJQH型树脂制备供试品溶液的HPLC图；
图10为AB-8型树脂制备供试品溶液的HPLC图；
图11为HPD450型树脂制备供试品溶液的HPLC图；
图12为HPD417型树脂制备供试品溶液的HPLC图；
图13为HPD500型树脂制备供试品溶液的HPLC图；
图14为K17型树脂制备供试品溶液的HPLC图；
图15为D101型树脂制备供试品溶液的HPLC图；
图16为萜类内酯含量测定阴性对照溶液的HPLC图；
图17为白果内酯对照品的HPLC图；
图18为银杏内酯A对照品的HPIC图；
图19为银杏内酯B对照品的HPLC图；
图20为银杏内酯C对照品的HPLC图；
图21为银杏总内酯对照提取物HPLC图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
关于银杏叶颗粒中的总黄酮醇苷含量的测定，分别采用现有技术和本发明的技术进行了回收率试验，具体过程及研究结果如下：
取已知含量的银杏叶提取物，精密称取6份，加入处方量的辅料混匀，分别按现有技术(参见国家药品标准YBZ08112004-2011Z)和本发明方法的规定，制备6份供试品溶液，注入高效液相色谱仪，通过测定峰面积，计算总黄酮醇苷的含量及回收率。结果如表1-2所示。
表1现有技术总黄酮醇苷回收率(n＝6)
表2本发明方法总黄酮醇苷回收率(n＝6)
由表1-2可知，采用现有技术测定总黄酮醇苷含量时，回收率仅为91.7％，回收率低、准确性差；而利用本发明方法测定总黄酮醇苷含量时，回收率可达97.6％，回收率高，测定结果更加准确可靠。
与此同时，采用现有技术和本发明方法对03210603批样品进行了总黄醇苷含量的测定，结果见表3及图1-2。
表3现有技术和本发明方法测定总黄酮醇苷含量的结果
由表3可知，本发明方法所测得的总黄酮醇苷含量更接近于03210603批样品的实际投料量(约相当于总黄酮醇苷22.4mg/袋)。这可能是由于现有技术采取超声、过滤的方法从样品中提取银杏叶提取物，因总黄酮醇苷和辅料之间的吸附作用，提取不够完全，导致含量偏低。而采用本发明方法后，大孔吸附树脂能有效的改善分离提取效果，提高回收率。因此，本发明的银杏叶颗粒中的总黄酮醇苷含量的测定方法测定结果更加准确、可靠，有利于保证产品的质量可控。
实施例2
关于银杏叶颗粒中的萜类内酯含量的测定，分别采用现有技术和本发明的技术进行了重复性试验，具体过程及研究结果如下：
取03210603批银杏叶颗粒，分别按现有技术国家药品标准YBZ08112004-2011Z和本发明方法的规定，制备6份供试品溶液，注入高效液相色谱仪，测定峰面积，分别计算6份样品萜类内酯的含量，以研究方法的重复性。结果如表4-5所示。
表4现有技术萜类内酯重复性试验结果(n＝6)
表5本发明方法萜类内酯重复性试验结果(n＝6)
结合表4-5可知，采用现有技术测定萜类内酯含量，重复性(n＝6)的RSD为9.2％，其重复性差会影响测定结果的准确性；而采用本发明方法测定萜类内酯含量时，重复性(n＝6)的RSD为2.0％，可见，其相对于现有技术，测量结果的重复性得到了显著提高。
与此同时，还采用了现有技术和本发明方法制备了03210603批样品的供试品溶液，并使用HPLC-ELSD进行了检测，色谱图如图3-4所示。
由图3-4可知，采用现有技术，所得的色谱图存在色谱峰前沿的问题，而本发明的色谱图色谱峰对称。这可能是因为现有技术采取超声、多次萃取的方法从样品中分离纯化萜类内酯，多达8次的萃取，人为因素影响极大，极易引入操作误差，同时，使用甲醇制备对照提取物及供试品溶液进行含量测定，可能存在溶剂与流动相不匹配的问题，导致色谱峰前沿，进而影响色谱峰面积的准确积分，从而影响含量测定结果的准确性。而在本发明的方法中，硅藻土柱不仅能改善分离纯化效果，而且操作简便，降低了人为因素的影响；同时，改用80％甲醇制备的对照品及供试品溶液，色谱峰对称，面积积分准确，重复性良好，保证了测定结果的准确性。
实施例3
关于银杏叶颗粒中总黄酮醇苷含量测定方法中供试液制备方法的耐用性研究。
取03210601批银杏叶颗粒，按照本发明方法，分别考察在不同大孔树脂用量、不同洗脱溶剂用量条件下，测得的总黄酮醇苷含量，结果见表6。
表6总黄酮醇苷含量测定供试液制备方法耐用性试验结果
由表6可知，大孔吸附树脂柱、水洗脱液、乙醇洗脱液用量在规定量的±20％时，均不会影响总黄酮醇苷含量测定结果。可见，本发明银杏叶颗粒中总黄酮醇苷含量测定方法中供试液制备方法的耐用性良好。
实施例4
关于银杏叶颗粒中总黄酮醇苷含量测定方法的方法学研究
(一)专属性
取阴性对照溶液、槲皮素、山柰酚、异鼠李素对照品溶液，注入高效液相色谱仪，依本发明方法进行测定。结果如表7及图5-8所示。
表7总黄酮醇苷专属性试验验证结果
| 供试液 | 色谱图 |
| 阴性对照溶液 | 呈一条平稳的直线 |
| 槲皮素对照品 | 主峰保留时间为18.660min，其他保留时间均无色谱峰 |
| 山柰酚对照品 | 主峰保留时间为34.577min，其他保留时间均无色谱峰 |
| 异鼠李素对照品 | 主峰保留时间为39.783min，其他保留时间均无色谱峰 |
结合表7及图5-8可知，溶剂不干扰槲皮素、山柰酚、异鼠李素的含量测定，并且三种成分之间能够实现良好分离。可见，本发明的方法专属性良好。
(二)线性
精密称取槲皮素对照品适量，加甲醇制成每1ml中约含100μg的对照品储备液；精密量取上述对照品储备液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml，分别置编号1-5#的10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为线性试验的供试品溶液。分别精密吸取上述5份供试品溶液，注入高效液相色谱仪，使用本发明方法进行测定，记录色谱图。并以槲皮素对照品的浓度(C)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标绘制标准曲线，并进行线性回归，结果如表8。
表8槲皮素线性试验结果
由表8可知，槲皮素浓度在10.44-52.20μg/ml范围内，与峰面积呈良好的线性关系。可见，本发明的方法线性良好。
(三)精密度
取上述线性关系试验项下的3#溶液，采用本发明方法连续进样6次，结果如表9所示。
表9总黄酮醇苷含量测定精密度试验结果
由表9可知，本发明的方法RSD仅为1.1％，精密度良好。
(四)准确度
取03210601批样品，采用本发明中供试品溶液制备方法制备样品溶液。取槲皮素、山柰酚、异鼠李素三种对照品适量加入上述样品溶液中，制成同浓度的供试品溶液6份。分别精密吸取样品溶液和上述6份供试品溶液，注入液相色谱仪，采用本发明方法测定总黄酮醇苷的含量，并计算回收率，结果如表10-12所示。
表10槲皮素含量测定准确度试验结果
表11山柰酚含量测定准确度试验结果
表12异鼠李素含量测定准确度试验结果
结合表10-12可知，采用本方法，槲皮素、山柰酚、异鼠李素三种成份含量测定回收率均良好，准确度高。
(五)重复性
取03210601批样品，按本发明方法制备6份供试品溶液，测定总黄酮醇苷含量，结果如表13所示。
表13总黄酮醇苷含量测定重复性试验结果
结合表13可知，本方法重复性良好，RSD值仅为1.1％。
(六)溶液稳定性
取03210601批样品，采用本发明方法制备供试品溶液，室温放置，在仪器连续运行状态下，每隔一定时间进样测定，考察溶液的稳定性，结果如表14所示。
表14总黄酮醇苷含量测定供试液稳定性试验结果
由表14可知，供试品溶液在室温放置24小时依旧很稳定，可见本发明对于银杏叶颗粒的前处理方法稳定有效。
(七)分析方法耐用性
取03210601批样品分别在不同流速、不同柱温、不同流动相比例、不同品牌色谱柱下依本发明方法进行测定，结果如表15所示。
表15总黄酮醇苷含量测定方法耐用性试验结果
由表14可知，本发明的方法在流速、柱温、流动相比例、色谱柱品牌等参数有微小变动时，依旧能满足系统适用性要求，不影响总黄酮醇苷含量测定结果，确保了方法的可靠性，耐用性良好。
实施例5
大孔吸附树脂柱型号为HPD-BJQH，其余同实施例4。
实施例6
大孔吸附树脂柱型号为AB-8，其余同实施例4
实施例7
大孔吸附树脂柱型号为HPD450，其余同实施例4
实施例8
大孔吸附树脂柱型号为HPD417，其余同实施例4
实施例9
大孔吸附树脂柱型号为HPD500，其余同实施例4
实施例10
大孔吸附树脂柱型号为K17，其余同实施例4
实施例11
大孔吸附树脂柱型号为D101，其余同实施例4
结合图9-15可知，在同等的条件下，更换上述不同型号的大孔吸附树脂柱，测定结果无明显差别，均符合质量标准规定。
综上，结合实施例4-11的结果可知，本发明的银杏叶颗粒中总黄酮醇苷含量的测定方法，克服了现有技术中的测定方法无法消除辅料对总黄酮醇苷吸附、准确度差的重大缺陷，减小了辅料和总黄酮醇苷的相互干扰，提高了总黄酮醇苷的提取率，保证了测定结果的准确可靠。
实施例12
关于银杏叶颗粒中萜类内酯含量测定方法中供试液制备方法的耐用性研究。
取03210601批银杏叶颗粒，按照本发明方法分别考察了在不同硅藻土柱(545型)用量、不同吸附时间、不同洗脱溶剂用量条件下，测得的萜类内酯含量，结果见表16。
表16萜类内酯含量测定供试液制备方法耐用性试验结果
由表16可知，当乙酸乙酯用量在100ml±20％、吸附时间在规定量的15±5min、硅藻土用量在16±2g变化时，均不影响萜类内酯含量的测定结果，因此，本发明的制备方法耐用性良好。
实施例13
关于银杏叶颗粒中萜类内酯含量测定方法的方法学研究
(一)专属性
取阴性对照溶液、银杏叶总内酯对照提取物溶液、银杏内酯C、白果内酯、银杏内酯A及银杏内酯B对照品溶液，注入液相色谱仪，依本发明方法进行测定，结果如表17及图16-21所示。
表17萜类内酯专属性试验验证结果
由表17及图16-21可知，空白溶剂、辅料均不会干扰银杏内酯C、白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B的含量测定，而且四种成分之间能够实现良好分离，因此，本发明的方法专属性良好。
(二)线性
取银杏叶总内酯对照提取物适量，精密称定，加80％甲醇制成每1ml含2.5mg的溶液。
精密吸取上述对照提取物溶液各3、5、10、20、30μl，分别注入高效液相色谱仪，依本发明方法进行测定，并记录银杏内酯C、白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B峰面积。分别以四种成分的进样量(C)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标绘制标准曲线，并进行线性回归，结果如表18所示。
表18萜类内酯线性试验结果
由表18可知，白果内酯进样量在2.531-25.308μg范围内、银杏内酯A进样量在2.134-21.336μg范围内、银杏内酯B进样量在1.217-12.168μg范围内、银杏内酯C进样量在1.030-10.302μg范围内均与峰面积呈良好的线性关系。
(三)精密度
取上述线性试验项下的对照提取物溶液5μl，依本发明方法连续进样6次，结果如表19所示。
表19萜类内酯含量测定精密度试验结果
由表19可知，本发明的方法在精密度试验中RSD均在3.6％以下，精密度良好。
(四)重复性
取03210601批样品，同法制备6份供试品，依本发明方法进行测定，结果如表20所示。
表20萜类内酯含量测定重复性试验结果
由表20可知，本发明的方法在重复性试验中RSD为2.2％，重复性良好。
(五)准确度
取03210601批样品照本发明方法制备样品溶液。取银杏叶总内酯对照提取物适量加入上述样品溶液中，制成同浓度的供试品溶液6份。取样品溶液和上述6份供试液，注入高效液相色谱仪，依本发明方法测定萜类内酯含量，并计算回收率，结果如表21所示。
表21萜类内酯含量测定准确度试验结果
由表21可知，本发明的方法萜类内酯的回收率良好，准确度高。
(六)溶液稳定性
取03210601批萜类内酯含量测定的供试品溶液，室温放置，在仪器连续运行状态下，每隔一定时间进样测定，考察溶液的稳定性，结果如表22所示。
表22萜类内酯含量测定供试液稳定性试验结果
由表22可知，本发明的萜类内酯含量测定所用供试液液在室温放置12小时依旧很稳定。
(七)耐用性
取03210601批样品使用不同流速、不同流动相比例、不同柱温、不同品牌色谱柱照本发明方法进行测定，结果如表23所示。
表23萜类内酯含量测定方法耐用性试验结果
由表23可知，本发明的方法在流速、流动相比例、柱温、色谱柱品牌等参数有微小变动时，依旧能满足系统适用性要求，不影响萜类内酯含量测定结果，能够确保方法的可靠性，耐用性良好。
由实施例13的数据可知，本发明的银杏叶颗粒中萜类内酯含量的测定方法，克服了现有测定方法提取率低、重复性差、过程冗长、操作繁琐、制备样品用溶剂选择不当等重大缺陷；减小了辅料对萜类内酯含量测定的干扰，提高了萜类内酯的提取率，简化了操作过程、降低了引入误差的机率，提高了重复性，优化了制备样品用溶剂，保证了测定结果的准确可靠。
综上，本发明的银杏叶颗粒中总黄酮醇苷和萜类内酯含量的测定方法，重现性好、测定结果准确可靠，由此保证了银杏叶颗粒的质量可控。因此，本发明的实施，可促使银杏叶提取物的颗粒剂真正的实现商业化规模生产，为临床提供安全、稳定的产品，对生产企业和临床应用均具有重要的现实意义。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (7)
1.一种银杏叶颗粒中总黄酮醇苷和萜类内酯含量的测定方法，其特征在于，包括银杏叶颗粒中总黄酮醇苷含量测定的方法和银杏叶颗粒中萜类内酯含量测定的方法，
其中，所述银杏叶颗粒中总黄酮醇苷含量测定的方法包括：使用大孔吸附树脂柱对银杏叶颗粒进行前处理，得到待测成分；待测成分经酸化水解，得到黄酮苷元，使用HPLC法进行测定；
所述银杏叶颗粒中萜类内酯含量测定的方法包括：使用硅藻土柱对银杏叶颗粒进行前处理，得到待测成分；以60-90％甲醇溶液作为供试品和对照提取物的溶剂，使用HPLC-ELSD法进行测定；
所述银杏叶颗粒中总黄酮醇苷含量测定的方法具体包括：
S1、精确称取银杏叶颗粒的粉末，加溶剂水并配合超声溶散，过大孔吸附树脂柱，依次用水洗脱剂、乙醇洗脱剂洗脱，收集乙醇洗脱液，蒸干，得到待测成分；
S2、向待测成分中加入甲醇-25％盐酸溶液的混合溶液进行酸化水解，并使用甲醇定容，得到供试品溶液；
S3、以槲皮素的甲醇溶液作为对照品溶液，在相同的色谱条件下，分别测定对照品溶液和供试品溶液中黄酮苷元的峰面积，采用外标法以校正因子计算供试品溶液中总黄酮醇苷的含量；
其中，所述黄酮苷元包括槲皮素、山柰酚和异鼠李素；
总黄酮醇苷含量＝(槲皮素含量+山柰酚含量+异鼠李素含量)*2.51；
所述大孔吸附树脂柱包括型号为HPD-BJQH、AB-8、HPD450、HPD417、HPD500、K17和D101中的任意一种；
所述银杏叶颗粒中萜类内酯含量测定的方法具体包括：
S1、精确称取银杏叶颗粒的粉末，加磷酸盐缓冲液并配合超声溶散，过硅藻土柱，待磷酸盐缓冲液全部吸附于硅藻土后，静置10-20min，使用乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液，蒸干，得到待测成分；
S2、向待测成分中加入60-90％甲醇溶液并配合超声溶解，使用60-90％甲醇溶液定容，得到供试品溶液；
S3、以银杏叶总内酯提取物的60-90％甲醇溶液作为对照提取物溶液，在相同的色谱条件下，分别测定对照提取物溶液和供试品溶液中各内酯的峰面积，采用外标两点法对数方程分别计算各内酯的含量，内酯含量的总和即为萜类内酯的含量；
其中，所述内酯包括白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C。
2.根据权利要求1所述的银杏叶颗粒中总黄酮醇苷和萜类内酯含量的测定方法，其特征在于，相当于总黄酮醇苷9.6mg的银杏叶颗粒的粉末所对应溶剂水、水洗脱剂、乙醇洗脱剂、甲醇-25％盐酸溶液的混合溶液的量分别为4-6ml、80-120ml、80-120ml和23-27ml；
其中，所述甲醇-25％盐酸溶液的混合溶液中甲醇与25％盐酸溶液的体积比为4:1。
3.根据权利要求1所述的银杏叶颗粒中总黄酮醇苷和萜类内酯含量的测定方法，其特征在于，所述酸化水解时，将溶解有待测成分的甲醇-25％盐酸溶液的混合溶液置于水浴中加热回流30min，迅速冷却至室温，转移至容量瓶使用甲醇稀释定容。
4.根据权利要求1所述的银杏叶颗粒中总黄酮醇苷和萜类内酯含量的测定方法，其特征在于，所述色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相为体积比为1:1的甲醇-0.4％磷酸溶液的混合溶液；检测波长为360nm；流速为1.0ml/min；进样量为10μl。
5.根据权利要求1所述的银杏叶颗粒中总黄酮醇苷和萜类内酯含量的测定方法，其特征在于，相当于萜类内酯7.2mg的银杏叶颗粒的粉末所对应磷酸盐缓冲液、硅藻土、乙酸乙酯的量分别为10-15ml、14-18g和80-120ml。
6.根据权利要求1所述的银杏叶颗粒中总黄酮醇苷和萜类内酯含量的测定方法，其特征在于，所述色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相为体积为1：15：84的正丙醇-四氢呋喃-水的混合溶液；检测器为蒸发光检测器；进样量为5-20μl。
7.根据权利要求1所述的银杏叶颗粒中总黄酮醇苷和萜类内酯含量的测定方法，其特征在于，所述银杏叶颗粒中总黄酮醇苷含量测定时，对照品溶液中每1ml甲醇中含30μg对照品；
所述银杏叶颗粒中萜类内酯含量测定时，对照提取物溶液中每1ml60-90％甲醇溶液含2.5mg对照提取物。
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Denomination of invention: A method for determining the content of total flavonol glycosides and terpene lactones in ginkgo biloba leaf granules Effective date of registration: 20231123 Granted publication date: 20230620 Pledgee: Dezhou Lingcheng Rural Commercial Bank Co.,Ltd. Pledgor: Shandong yidaokang Pharmaceutical Co.,Ltd. Registration number: Y2023980067072 |