CN105891355B - 一种同时测定银杏叶提取物及其制剂中黄酮类化合物和萜内酯类化合物含量的检测方法 - Google Patents

一种同时测定银杏叶提取物及其制剂中黄酮类化合物和萜内酯类化合物含量的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及药物检测领域，更具体地说，本发明涉及一种同时测定银杏叶(或其提取物)或其制剂中黄酮类化合物和萜内酯类化合物含量的高效液相色谱检测方法。本发明建立了HPLC‑DAD‑ELSD法可同时对银杏叶(或其提取物)及其制剂中8种黄酮类化合物以及3种萜内酯类化合物进行测定的方法，并对其测定结果进行了分析，为银杏叶提取物及其制剂的质量控制提供了新的分析方法并提供依据。

Description

一种同时测定银杏叶提取物及其制剂中黄酮类化合物和萜内 酯类化合物含量的检测方法
技术领域
本发明涉及药物检测领域，更具体地说，本发明涉及一种同时测定银杏叶(或其提取物)及其制剂中黄酮类化合物和萜内酯类化合物含量的高效液相色谱检测方法。
背景技术
银杏是地球上最古老的植物之一，为银杏科银杏属植物，该树种生命力极强，上千年的树龄并不罕见，堪称植物界的“老寿星”。《本草纲目》中记载，银杏叶可补心养气，益肾润肺，健脑醒神，延年益寿。现代药理学研究表明，银杏叶具有清除氧自由基、降血脂、增强中枢神经系统功能、调节神经递质和激素水平、改善血液流变状态、抗炎、抗过敏等作用。因而用银杏叶研制开发的制剂品种越来越多，临床应用越来越广泛。目前在临床上应用的有斯泰隆、金纳多、天保宁、银可络、舒血宁、络欣通，冠心酮等多种品牌的片剂、颗粒剂、注射剂，主要用于治疗各种心脑血管疾病、糖尿病、神经系统疾病和呼吸系统疾病等。随着对银杏叶制剂作用的研究，银杏叶的各种制剂不仅在心脑血管疾病治疗上得到了大家认可和应用，而且临床也在慢性阻塞性肺疾病等其他疾病中进行应用。随着研究的深入，银杏叶制剂将会在临床上得到更广泛的应用。
银杏叶提取物及其制剂中主要有效成分为黄酮苷类和萜类内酯活性物质，到目前为止，国内外关于银杏叶及其制剂的质量控制方法普遍是测定这两类成分的含量。关于银杏叶及其制剂中黄酮苷类和萜类内酯含量测定方法，已经有高效液相色谱法。例如，CN104034826提供了一种使用高效液相色谱-蒸发光散射检测器检测银杏叶萜类内酯的方法，采用该方法可以同时检测4种萜类内酯；刘会等公开了一种以HPLC-UV法测定银杏叶提取物中3个黄酮醇苷含量，并以HPLC-ELSD法测定4个萜类内酯含量的方法(中华中医药杂志(原中国医药学报)2015年2月第30卷第2期，第598～601页)。上述方法是采用不同的检测方法分别检测萜类内酯和黄酮醇苷，缺点是需要采用不同的仪器、不同的样品处理条件分别进样，从而导致操作步骤繁杂，工艺简便性不足。
崔大明等公开了一种采用RP-HPLC测定银杏叶提取物类脂质体中的3种银杏黄酮苷(槲皮素、山奈素、异鼠李素)以及4种萜类内酯(银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、白果内酯)含量的方法(吉林农业大学学报，2013，35(4):446～449，462)；任艳平等公开了一种采用HPLC－MS同时测定舒血宁注射液中银杏内酯A(GA)、银杏内酯B(GB)、银杏内酯C(GC)、白果内酯、(BB)以及槲皮素(QCT)、异鼠李素(ISR)和山柰酚(KAE)等7个成分含量的方法(药物分析杂志，2013，33(2)第220～224页)。上述方法能够同时检测黄酮苷和萜类内酯，大大简化了操作流程。
为了更好地控制银杏叶(或其提取物)及其制剂的质量，保证用药的安全性，更好的指导生产，使工艺控制更加严格合理，使消费者能全面认识产品质地，需要不断研究和摸索更有利于产品质量检测、明确具体有效成分种类和含量的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种采用双检测器的高效液相色谱法同时测定银杏叶(或其提取物)及其制剂中8种黄酮类化合物和3萜内酯类化合物含量的检测方法。该方法使用紫外检测器(DAD)及ELSD检测器串联的方式，使用这种方法，可以更好的控制银杏叶提取物及其制剂的质量，保证用药的安全性，能够更好地指导生产，使生产工艺控制更加严格合理，使消费者能够全面认识产品质地。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种采用双检测器的高效液相色谱法同时测定银杏叶、银杏叶提取物及其制剂中银杏内酯和黄酮苷的含量的方法，其中所述制剂不包括舒血宁注射液，其特征在于采用的色谱条件为：其特征在于采用的色谱条件为：固定相是以十八烷基键合硅胶为填料的色谱柱；洗脱流速为0.5～2.0mL/min；流动相A是0.05％四氢呋喃-0.1％甲酸-5％甲醇-水的混合溶剂，体积比是0.1～2：1～5：5～15：900～1000；流动相B是0.1％四氢呋喃-甲醇乙腈溶液的混合溶剂，体积比为0.5～3：1000～1200，其中所述甲醇乙腈溶液为甲醇和乙腈体积比1：1的溶液；进行梯度洗脱，梯度条件为：
时间(min) A(％) B(％)
0～33 90→79 10→21
33～47 79→79 21→21
47～74 79→45 21→55
74～75 45→90 55→10
；紫外检测器与ELSD检测器串联，其中紫外检测波长355～365nm，ELSD条件为：漂移管温度115～105℃，载气流速为2～3L/min，增益值为1。
在一些实施方案中，梯度条件优选：
时间(min) A(％) B(％)
0～30 90→80 10→20
30～33 80→79 20→21
33～47 79→79 21→21
47～74 79→45 21→55
74～75 45→90 55→10
在一些实施方案中，梯度条件优选：
时间(min) A(％) B(％)
0～30 90→80 10→20
30～33 80→79 20→21
33～47 79→79 21→21
47～63 79→67 21→33
63～74 67→45 33→55
74～75 45→90 55→10
在一些实施方案中，梯度条件优选为：
时间(min) A(％) B(％)
0～10 90→84 10→16
10～30 84→80 16→20
30～33 80→79 20→21
33～47 79→79 21→21
47～48 79→76 21→24
48～63 76→67 24→33
63～64 67→60 33→40
64～74 60→45 40→55
74～75 45→90 55→10
在一些实施方案中，本发明所述流动相A，0.05％四氢呋喃-0.1％甲酸-5％甲醇-水的体积比是1：2：10：950。
在一些实施方案中，本发明所述的流动相B，0.1％四氢呋喃-甲醇乙腈溶液体积比为1：1000，其中所述甲醇乙腈溶液为甲醇和乙腈体积比1：1的溶液。
在一些实施方案中，本发明所述紫外检测波长为360nm。
在一些实施方案中，本发明所述洗脱流速为1mL/min。
在一些实施方案中，本发明所述漂移管温度为110℃。
在一些实施方案中，本发明所述载气流速为2.5L/min。
本发明提到的测定方法，其洗脱流速设定为一般技术人员公知的常识，常见的范围一般为0.5ml/min至2ml/min，本发明优选0.9～1.1ml/min，更优选1.0ml/min。
本发明所述的8种黄酮苷分别为芦丁、异槲皮苷、水仙苷、3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-(1-2)鼠李糖基}山奈酚、槲皮素-3-O-葡萄糖基(1→2)鼠李糖苷、3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素、山奈酚-7-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷，3种内酯分别为银杏内酯A(GA)、银杏内酯B(GB)、银杏内酯C(GC)。
本发明的方法与现有技术相比具有以下优点和积极效果：
(1)本发明的方法能在同一个高效液相色谱条件下同时测定银杏叶提取物及其制剂中8种黄酮类化合物和3萜内酯类化合物含量，避免了在检测中频繁更换液相条件，提高了工作效率，适合工业大生产的要求。
(2)本发明的方法耐用性好，容易实现，所用仪器设备及试剂均是常规用品，试验参数也是常规参数，无苛刻条件，成本低，大多数实验室的条件均能满足。
附图
附图1：8种黄酮类化合物对照品色谱图，其中1为芦丁、2为异槲皮苷、3为水仙苷、4为3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-(1-2)鼠李糖基}山奈酚、5为槲皮素-3-O-葡萄糖基(1→2)鼠李糖苷、6为3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素、7为山奈酚-7-O-β-D-葡萄糖、8为山奈酚-3-O-芸香糖苷；
附图2：3种萜内酯类化合物对照品色谱图，其中9为银杏内酯GC、10为银杏内酯GA、11为银杏内酯GB；
附图3：银杏叶提取物紫外检测色谱图，其中1为芦丁、2为异槲皮苷、3为水仙苷、4为3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-(1-2)鼠李糖基}山奈酚、5为槲皮素-3-O-葡萄糖基(1→2)鼠李糖苷、6为3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素、7为山奈酚-7-O-β-D-葡萄糖、8为山奈酚-3-O-芸香糖苷；
附图4：银杏叶提取物ELSD检测色谱图，其中9为银杏内酯GC、10为银杏内酯GA、11为银杏内酯GB；
附图5：银杏叶样品粉末紫外检测色谱图，其中1为芦丁、2为异槲皮苷、3为水仙苷、4为3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-(1-2)鼠李糖基}山奈酚、5为槲皮素-3-O-葡萄糖基(1→2)鼠李糖苷、6为3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素、7为山奈酚-7-O-β-D-葡萄糖、8为山奈酚-3-O-芸香糖苷；
附图6：银杏叶样品粉末ELSD检测色谱图，其中9为银杏内酯GC、10为银杏内酯GA、11为银杏内酯GB。
具体实施方案
下述是结合具体实施例进一步阐述本发明。但这些实施例仅限于说明本发明而不是用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件。
实施例1：
(1)色谱条件：固定相是以十八烷基键合硅胶为填料的色谱柱；紫外检测器与ELSD检测器串联；紫外检测波长360nm；流速为1mL/min；流动相A是0.05％四氢呋喃-0.1％甲酸-5％甲醇-水的混合溶剂，体积比是1：2：10：950；流动相B是0.1％四氢呋喃-甲醇乙腈溶液的混合溶剂，体积比为1：1000，其中所述甲醇乙腈溶液为甲醇和乙腈体积比1：1的溶液；进行梯度洗脱，梯度条件为：
时间(min) A(％) B(％)
0～10 90→84 10→16
10～30 84→80 16→20
30～33 80→79 20→21
33～47 79→79 21→21
47～48 79→76 21→24
48～63 76→67 24→33
63～64 67→60 33→40
64～74 60→45 40→55
74～75 45→90 55→10
；ELSD条件为：漂移管温度110℃，载气流速为2.5L/min，增益值为1。
(2)对照品储备液：精密称取芦丁、异槲皮苷、水仙苷、3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-(1-2)鼠李糖基}山奈酚、槲皮素-3-O-葡萄糖基(1→2)鼠李糖苷、3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素、山奈酚-7-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、银杏内酯A(GA)、银杏内酯B(GB)、银杏内酯C(GC)对照品5mg，分别加甲醇配成浓度为1mg/mL的单一对照品储备液，置4℃冰箱中保存备用。
(3)样品制备：精密称取银杏叶提取物样品0.05g，至10ml容量瓶中。加100％甲醇溶液至容量瓶刻度线，超声提取30min。将提取液以14000r/min的速度离心10min，取上清液，再以14000r/min的速度离心10min，取上清液，作为银杏叶提取物样品储备液置4℃冰箱中保存备用。
(4)标准曲线：将上述芦丁对照品配制成浓度为250ug/ml，水仙苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷对照品配制成浓度为200μg/ml，3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-(1-2)鼠李糖基}山奈酚、槲皮素-3-O-葡萄糖基(1→2)鼠李糖苷、3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素对照品浓度为100μg/ml，异槲皮苷、山奈酚-7-O-β-D-葡萄糖苷对照品浓度为50μg/ml的混合母液，并以0.6倍逐级稀释成8个点。将GA、GB、GC配制成浓度分别为250ug/ml的混合母液，并以0.7倍逐级稀释成8个点。将上述两混合母液按照上述色谱条件进样15μl，记录峰面积。ELSD条件下以进样浓度的对数值为横坐标，以峰面积的对数值为纵坐标。求得11种化合物标准曲线的回归方程，线性范围及r值，线性关系结果如表1所示。8种黄酮类化合物的对照品色谱图如图1所示；3种萜内酯类化合物的对照品色谱图如图2所示。
表1线性关系结果
(5)精密度实验：精密取适量银杏叶提取物供试品溶液，按谱条件进样15μL，按照上述色谱条件，连续进样6次。峰面积的RSD在1.12％～2.83％，均小于5％。试验结果表明：所建立的方法精密度良好。
(6)重复性实验：精密取6份银杏叶提取物供试品溶液，按“上述色谱条件进样15μL，连续进样6次。计算各化合物峰面积，RSD在1.36％～2.97％，均小于5％。试验结果表明：测定方法重现性良好。
(7)稳定性实验：取同一批供试品溶液，分别在0，2，4，8，12，24h后按照上述色谱条件，进样15μL，测定化合物峰面积。结果峰面积RSD在0.87～3.64％，均小于5％，可见样品在24h内稳定性良好。
(8)加样回收率试验：将芦丁、异槲皮苷、槲皮素-3-O-葡萄糖基(1→2)鼠李糖苷、山奈酚-7-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、水仙苷、3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素、3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-(1-2)鼠李糖基}山奈酚、GA、GB、GC配制成浓度分别为650ug/ml、51μg/ml、173μg/ml、25μg/ml、475μg/ml、413μg/ml、346μg/ml、273μg/ml、810μg/ml、760μg/ml、330μg/ml的混合母液，取100μl的混合溶液加入500μl的银杏叶提取物供试品溶液中，再加入400ul甲醇，涡旋，以14000r/min的速度离心10min，取上清液，再以14000r/min的速度离心10min，取上清液，标为样品1，平行6次，按色进样15μL。另取样品加甲醇稀释一倍，涡旋，以14000r/min的速度离心10min，取上清液，再以14000r/min的速度离心10min，取上清液标为样品2，平行3次，按色谱条件进样15μL。计算加样回收率。结果显示回收率RSD值在1.02％～3.54％范围以内，均小于5％，平均回收率在95.0％～105.0％范围内，表明本方法的准确度良好。
(9)银杏叶提取物含量检测
按照上述(3)所述条件处理样品，按上述(1)所述色谱条件进样，测得峰面积，代入相应的标准线，分别计算银杏叶提取物样品中11种化合物的含量。样品测定结果见表2。图3为银杏叶提取物紫外检测色谱图；图4为银杏叶提取物ELSD检测色谱图。
表2银杏叶提取物样品含量测定结果
实施例2：银杏叶样品含量检测方法
(1)样品制备：取8批银杏叶样品粉末，精密称取1g，置于10ml容量瓶中，加70％甲醇溶液置刻度线，超声提取30min。将提取液以14000r/min的速度离心10min，取上清液，再以14000r/min的速度离心10min，取上清液。取1ml上清液氮吹复溶至250ul，使样品浓度扩大4倍，作为银杏叶样品储备液置4℃冰箱中保存备用。
(2)含量检测
按照实施例1所述色谱条件，进样，测得峰面积，代入相应的标准线，分别计算银杏叶样品中11种化合物的含量。样品测定结果见表3。图5为银杏叶样品紫外检测色谱图；图6为银杏叶样品ELSD检测色谱图。
表3银杏叶样品含量测定结果
实施例3：舒血宁注射液含量检测方法
(1)样品制备：将舒血宁注射液以14000r.min-1的速度离心10min，取上清液，将上清液再以14000r.min-1的速度离心10min，取上清液，作为舒血宁注射液样品储备液置4℃冰箱中保存备用。
(2)含量检测
按照实施例1所述色谱条件，进样，测得峰面积，代入相应的标准线，分别计算银杏叶样品中11种化合物的含量。样品测定结果见表4。
表4舒血宁注射液含量测定结果
实施例4
(1)色谱条件：固定相是以十八烷基键合硅胶为填料的色谱柱；紫外检测器与ELSD检测器串联；紫外检测波长360nm；流速为1mL/min；流动相A是0.05％四氢呋喃-0.1％甲酸-5％甲醇-水的混合溶剂，体积比是1：2：10：950；流动相B是0.1％四氢呋喃-甲醇乙腈溶液的混合溶剂，体积比为1：1000，其中所述甲醇乙腈溶液为甲醇和乙腈体积比1：1的溶液；进行梯度洗脱，梯度条件为：
时间(min) A(％) B(％)
0～30 90→80 10→20
30～33 80→79 20→21
33～47 79→79 21→21
47～63 79→67 21→33
63～74 67→45 33→55
74～75 45→90 55→10
；ELSD条件为：漂移管温度110℃，载气流速为2.5L/min，增益值为1。
(2)对照品储备液：精密称取芦丁、异槲皮苷、水仙苷、3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-(1-2)鼠李糖基}山奈酚、槲皮素-3-O-葡萄糖基(1→2)鼠李糖苷、3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素、山奈酚-7-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、银杏内酯A(GA)、银杏内酯B(GB)、银杏内酯C(GC)对照品5mg，分别加甲醇配成浓度为1mg/mL的单一对照品储备液，置4℃冰箱中保存备用。
(3)样品制备：精密称取银杏叶提取物样品0.05g，至10ml容量瓶中。加100％甲醇溶液至容量瓶刻度线，超声提取30min。将提取液以14000r/min的速度离心10min，取上清液，再以14000r/min的速度离心10min，取上清液，作为银杏叶提取物样品储备液置4℃冰箱中保存备用。
(4)标准曲线：将上述芦丁对照品配制成浓度为250ug/ml，水仙苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷对照品配制成浓度为200μg/ml，3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-(1-2)鼠李糖基}山奈酚、槲皮素-3-O-葡萄糖基(1→2)鼠李糖苷、3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素对照品浓度为100μg/ml，异槲皮苷、山奈酚-7-O-β-D-葡萄糖苷对照品浓度为50μg/ml的混合母液，并以0.6倍逐级稀释成8个点。将GA、GB、GC配制成浓度分别为250ug/ml的混合母液，并以0.7倍逐级稀释成8个点。将上述两混合母液按照上述色谱条件进样15μl，记录峰面积。ELSD条件下以进样浓度的对数值为横坐标，以峰面积的对数值为纵坐标。求得11种化合物标准曲线的回归方程，线性范围及r值，线性关系结果如表5所示。
表5线性关系结果
(5)精密度实验：精密取适量银杏叶提取物供试品溶液，按谱条件进样15μL，按照上述色谱条件，连续进样6次。峰面积的RSD在1.24％～4.86％，均小于5％。试验结果表明：所建立的方法精密度良好。
(6)重复性实验：精密取6份银杏叶提取物供试品溶液，按“上述色谱条件进样15μL，连续进样6次。计算各化合物峰面积，RSD在1.11％～4.52％，均小于5％。试验结果表明：测定方法重现性良好。
(7)稳定性实验：取同一批供试品溶液，分别在0，2，4，8，12，24h后按照上述色谱条件，进样15μL，测定化合物峰面积。结果峰面积RSD在1.56～4.07％，均小于5％，可见样品在24h内稳定性良好。
(8)加样回收率试验：将芦丁、异槲皮苷、槲皮素-3-O-葡萄糖基(1→2)鼠李糖苷、山奈酚-7-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、水仙苷、3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素、3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-(1-2)鼠李糖基}山奈酚、GA、GB、GC配制成浓度分别为650ug/ml、51μg/ml、173μg/ml、25μg/ml、475μg/ml、413μg/ml、346μg/ml、273μg/ml、810μg/ml、760μg/ml、330μg/ml的混合母液，取100μl的混合溶液加入500μl的银杏叶提取物供试品溶液中，再加入400ul甲醇，涡旋，以14000r/min的速度离心10min，取上清液，再以14000r/min的速度离心10min，取上清液，标为样品1，平行6次，按色进样15μL。另取样品加甲醇稀释一倍，涡旋，以14000r/min的速度离心10min，取上清液，再以14000r/min的速度离心10min，取上清液标为样品2，平行3次，按色谱条件进样15μL。计算加样回收率。结果显示回收率RSD值在0.64％～3.38％范围以内，均小于5％，平均回收率在94.0％～106.0％范围内，表明本方法的准确度良好。
(9)含量检测
按照上述(3)所述条件处理样品，按上述(1)所述色谱条件进样，测得峰面积，代入相应的标准线，分别计算银杏叶提取物样品中11种化合物的含量。样品测定结果见表6。
表6银杏叶提取物样品含量测定结果
实施例5：
(1)色谱条件：固定相是以十八烷基键合硅胶为填料的色谱柱；紫外检测器与ELSD检测器串联；紫外检测波长360nm；流速为1mL/min；流动相A是0.05％四氢呋喃-0.1％甲酸-5％甲醇-水的混合溶剂，体积比是1：2：10：950；流动相B是0.1％四氢呋喃-甲醇乙腈溶液的混合溶剂，体积比为1：1000，其中所述甲醇乙腈溶液为甲醇和乙腈体积比1：1的溶液；进行梯度洗脱，梯度条件为：
时间(min) A(％) B(％)
0～30 90→80 10→20
30～33 80→79 20→21
33～47 79→79 21→21
47～74 79→45 21→55
74～75 45→90 55→10
；ELSD条件为：漂移管温度110℃，载气流速为2.5L/min，增益值为1。
(2)对照品储备液：精密称取芦丁、异槲皮苷、水仙苷、3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-(1-2)鼠李糖基}山奈酚、槲皮素-3-O-葡萄糖基(1→2)鼠李糖苷、3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素、山奈酚-7-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、银杏内酯A(GA)、银杏内酯B(GB)、银杏内酯C(GC)对照品5mg，分别加甲醇配成浓度为1mg/mL的单一对照品储备液，置4℃冰箱中保存备用。
(3)样品制备：精密称取银杏叶提取物样品0.05g，至10ml容量瓶中。加100％甲醇溶液至容量瓶刻度线，超声提取30min。将提取液以14000r/min的速度离心10min，取上清液，再以14000r/min的速度离心10min，取上清液，作为银杏叶提取物样品储备液置4℃冰箱中保存备用。
(4)标准曲线：将上述芦丁对照品配制成浓度为250ug/ml，水仙苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷对照品配制成浓度为200μg/ml，3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-(1-2)鼠李糖基}山奈酚、槲皮素-3-O-葡萄糖基(1→2)鼠李糖苷、3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素对照品浓度为100μg/ml，异槲皮苷、山奈酚-7-O-β-D-葡萄糖苷对照品浓度为50μg/ml的混合母液，并以0.6倍逐级稀释成8个点。将GA、GB、GC配制成浓度分别为250ug/ml的混合母液，并以0.7倍逐级稀释成8个点。将上述两混合母液按照上述色谱条件进样15μl，记录峰面积。ELSD条件下以进样浓度的对数值为横坐标，以峰面积的对数值为纵坐标。求得11种化合物标准曲线的回归方程，线性范围及r值，线性关系结果如表7所示。
表7线性关系结果
(5)精密度实验：精密取适量银杏叶提取物供试品溶液，按谱条件进样15μL，按照上述色谱条件，连续进样6次。峰面积的RSD在1.69％～4.23％，均小于5％。试验结果表明：所建立的方法精密度良好。
(6)重复性实验：精密取6份银杏叶提取物供试品溶液，按“上述色谱条件进样15μL，连续进样6次。计算各化合物峰面积，RSD在1.59％～4.57％，均小于5％。试验结果表明：测定方法重现性良好。
(7)稳定性实验：取同一批供试品溶液，分别在0，2，4，8，12，24h后按照上述色谱条件，进样15μL，测定化合物峰面积。结果峰面积RSD在1.38～4.63％，均小于5％，可见样品在24h内稳定性良好。
(8)加样回收率试验：将芦丁、异槲皮苷、槲皮素-3-O-葡萄糖基(1→2)鼠李糖苷、山奈酚-7-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、水仙苷、3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素、3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-(1-2)鼠李糖基}山奈酚、GA、GB、GC配制成浓度分别为650ug/ml、51μg/ml、173μg/ml、25μg/ml、475μg/ml、413μg/ml、346μg/ml、273μg/ml、810μg/ml、760μg/ml、330μg/ml的混合母液，取100μl的混合溶液加入500μl的银杏叶提取物供试品溶液中，再加入400ul甲醇，涡旋，以14000r/min的速度离心10min，取上清液，再以14000r/min的速度离心10min，取上清液，标为样品1，平行6次，按色进样15μL。另取样品加甲醇稀释一倍，涡旋，以14000r/min的速度离心10min，取上清液，再以14000r/min的速度离心10min，取上清液标为样品2，平行3次，按色谱条件进样15μL。计算加样回收率。结果显示回收率RSD值在0.69％～3.27％范围以内，均小于5％，平均回收率在95.0％～105.0％范围内，表明本方法的准确度良好。
(9)含量检测
按照上述(3)所述条件处理样品，按上述(1)所述色谱条件进样，测得峰面积，代入相应的标准线，分别计算银杏叶提取物样品中11种化合物的含量。样品测定结果见表8。
表8银杏叶提取物样品含量测定结果
实施例6：
(1)色谱条件：固定相是以十八烷基键合硅胶为填料的色谱柱；紫外检测器与ELSD检测器串联；紫外检测波长360nm；流速为1mL/min；流动相A是0.05％四氢呋喃-0.1％甲酸-5％甲醇-水的混合溶剂，体积比是1：2：10：950；流动相B是0.1％四氢呋喃-甲醇乙腈溶液的混合溶剂，体积比为1：1000，其中所述甲醇乙腈溶液为甲醇和乙腈体积比1：1的溶液；进行梯度洗脱，梯度条件为：
时间(min) A(％) B(％)
0～33 90→79 10→21
33～47 79→79 21→21
47～74 79→45 21→55
74～75 45→90 55→10
；ELSD条件为：漂移管温度110℃，载气流速为2.5L/min，增益值为1。
(2)对照品储备液：精密称取芦丁、异槲皮苷、水仙苷、3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-(1-2)鼠李糖基}山奈酚、槲皮素-3-O-葡萄糖基(1→2)鼠李糖苷、3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素、山奈酚-7-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、银杏内酯A(GA)、银杏内酯B(GB)、银杏内酯C(GC)对照品5mg，分别加甲醇配成浓度为1mg/mL的单一对照品储备液，置4℃冰箱中保存备用。
(3)样品制备：精密称取银杏叶提取物样品0.05g，至10ml容量瓶中。加100％甲醇溶液至容量瓶刻度线，超声提取30min。将提取液以14000r/min的速度离心10min，取上清液，再以14000r/min的速度离心10min，取上清液，作为银杏叶提取物样品储备液置4℃冰箱中保存备用。
(4)标准曲线：将上述芦丁对照品配制成浓度为250ug/ml，水仙苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷对照品配制成浓度为200μg/ml，3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-(1-2)鼠李糖基}山奈酚、槲皮素-3-O-葡萄糖基(1→2)鼠李糖苷、3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素对照品浓度为100μg/ml，异槲皮苷、山奈酚-7-O-β-D-葡萄糖苷对照品浓度为50μg/ml的混合母液，并以0.6倍逐级稀释成8个点。将GA、GB、GC配制成浓度分别为250ug/ml的混合母液，并以0.7倍逐级稀释成8个点。将上述两混合母液按照上述色谱条件进样15μl，记录峰面积。ELSD条件下以进样浓度的对数值为横坐标，以峰面积的对数值为纵坐标。求得11种化合物标准曲线的回归方程，线性范围及r值，线性关系结果如表9所示。
表9线性关系结果
(5)精密度实验：精密取适量银杏叶提取物供试品溶液，按谱条件进样15μL，按照上述色谱条件，连续进样6次。峰面积的RSD在2.01％～4.85％，均小于5％。试验结果表明：所建立的方法精密度良好。
(6)重复性实验：精密取6份银杏叶提取物供试品溶液，按“上述色谱条件进样15μL，连续进样6次。计算各化合物峰面积，RSD在1.31％～4.27％，均小于5％。试验结果表明：测定方法重现性良好。
(7)稳定性实验：取同一批供试品溶液，分别在0，2，4，8，12，24h后按照上述色谱条件，进样15μL，测定化合物峰面积。结果峰面积RSD在1.34～4.84％，均小于5％，可见样品在24h内稳定性良好。
(8)加样回收率试验：将芦丁、异槲皮苷、槲皮素-3-O-葡萄糖基(1→2)鼠李糖苷、山奈酚-7-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、水仙苷、3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素、3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-(1-2)鼠李糖基}山奈酚、GA、GB、GC配制成浓度分别为650ug/ml、51μg/ml、173μg/ml、25μg/ml、475μg/ml、413μg/ml、346μg/ml、273μg/ml、810μg/ml、760μg/ml、330μg/ml的混合母液，取100μl的混合溶液加入500μl的银杏叶提取物供试品溶液中，再加入400ul甲醇，涡旋，以14000r/min的速度离心10min，取上清液，再以14000r/min的速度离心10min，取上清液，标为样品1，平行6次，按色进样15μL。另取样品加甲醇稀释一倍，涡旋，以14000r/min的速度离心10min，取上清液，再以14000r/min的速度离心10min，取上清液标为样品2，平行3次，按色谱条件进样15μL。计算加样回收率。结果显示回收率RSD值在0.76％～3.61％范围以内，均小于5％，平均回收率在95.0％～105.0％范围内，表明本方法的准确度良好。
(9)含量检测
按照上述(3)所述条件处理样品，按上述(1)所述色谱条件进样，测得峰面积，代入相应的标准线，分别计算银杏叶提取物样品中11种化合物的含量。样品测定结果见表10。
表10银杏叶提取物样品含量测定结果
实施例7：
(1)色谱条件：固定相是以十八烷基键合硅胶为填料的色谱柱；紫外检测器与ELSD检测器串联；紫外检测波长360nm；流速为1mL/min；流动相A是0.05％四氢呋喃-0.1％甲酸-5％甲醇-水的混合溶剂，体积比是2：5：15：1000；流动相B是0.1％四氢呋喃-甲醇乙腈溶液的混合溶剂，体积比为3：1200，其中所述甲醇乙腈溶液为甲醇和乙腈体积比1：1的溶液；进行梯度洗脱，梯度条件为：
时间(min) A(％) B(％)
0～33 90→79 10→21
33～47 79→79 21→21
47～74 79→45 21→55
74～75 45→90 55→10
；ELSD条件为：漂移管温度105℃，载气流速为2.5L/min，增益值为1。
(2)对照品储备液：精密称取芦丁、异槲皮苷、水仙苷、3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-(1-2)鼠李糖基}山奈酚、槲皮素-3-O-葡萄糖基(1→2)鼠李糖苷、3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素、山奈酚-7-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、银杏内酯A(GA)、银杏内酯B(GB)、银杏内酯C(GC)对照品5mg，分别加甲醇配成浓度为1mg/mL的单一对照品储备液，置4℃冰箱中保存备用。
(3)样品制备：精密称取银杏叶提取物样品0.05g，至10ml容量瓶中。加100％甲醇溶液至容量瓶刻度线，超声提取30min。将提取液以14000r/min的速度离心10min，取上清液，再以14000r/min的速度离心10min，取上清液，作为银杏叶提取物样品储备液置4℃冰箱中保存备用。
(4)标准曲线：将上述芦丁对照品配制成浓度为250ug/ml，水仙苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷对照品配制成浓度为200μg/ml，3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-(1-2)鼠李糖基}山奈酚、槲皮素-3-O-葡萄糖基(1→2)鼠李糖苷、3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素对照品浓度为100μg/ml，异槲皮苷、山奈酚-7-O-β-D-葡萄糖苷对照品浓度为50μg/ml的混合母液，并以0.6倍逐级稀释成8个点。将GA、GB、GC配制成浓度分别为250ug/ml的混合母液，并以0.7倍逐级稀释成8个点。将上述两混合母液按照上述色谱条件进样15μl，记录峰面积。ELSD条件下以进样浓度的对数值为横坐标，以峰面积的对数值为纵坐标。求得11种化合物标准曲线的回归方程，线性范围及r值，线性关系结果如表11所示。
表11线性关系结果
(5)精密度实验：精密取适量银杏叶提取物供试品溶液，按谱条件进样15μL，按照上述色谱条件，连续进样6次。峰面积的RSD在1.43％～4.52％，均小于5％。试验结果表明：所建立的方法精密度良好。
(6)重复性实验：精密取6份银杏叶提取物供试品溶液，按“上述色谱条件进样15μL，连续进样6次。计算各化合物峰面积，RSD在1.19～4.17％，均小于5％。试验结果表明：测定方法重现性良好。
(7)稳定性实验：取同一批供试品溶液，分别在0，2，4，8，12，24h后按照上述色谱条件，进样15μL，测定化合物峰面积。结果峰面积RSD在1.32～4.74％，均小于5％，可见样品在24h内稳定性良好。
(8)加样回收率试验：将芦丁、异槲皮苷、槲皮素-3-O-葡萄糖基(1→2)鼠李糖苷、山奈酚-7-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、水仙苷、3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素、3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-(1-2)鼠李糖基}山奈酚、GA、GB、GC配制成浓度分别为650ug/ml、51μg/ml、173μg/ml、25μg/ml、475μg/ml、413μg/ml、346μg/ml、273μg/ml、810μg/ml、760μg/ml、330μg/ml的混合母液，取100μl的混合溶液加入500μl的银杏叶提取物供试品溶液中，再加入400ul甲醇，涡旋，以14000r/min的速度离心10min，取上清液，再以14000r/min的速度离心10min，取上清液，标为样品1，平行6次，按色进样15μL。另取样品加甲醇稀释一倍，涡旋，以14000r/min的速度离心10min，取上清液，再以14000r/min的速度离心10min，取上清液标为样品2，平行3次，按色谱条件进样15μL。计算加样回收率。结果显示回收率RSD值在0.79％～4.34％范围以内，均小于5％，平均回收率在96.0％～105.0％范围内，表明本方法的准确度良好。
(9)含量检测
按照上述(3)所述条件处理样品，按上述(1)所述色谱条件进样，测得峰面积，代入相应的标准线，分别计算银杏叶提取物样品中11种化合物的含量。样品测定结果见表12。
表12银杏叶提取物样品含量测定结果
实施例8：
(1)色谱条件：固定相是以十八烷基键合硅胶为填料的色谱柱；紫外检测器与ELSD检测器串联；紫外检测波长360nm；流速为1mL/min；流动相A是0.05％四氢呋喃-0.1％甲酸-5％甲醇-水的混合溶剂，体积比是0.1：1：5：900；流动相B是0.1％四氢呋喃-甲醇乙腈溶液的混合溶剂，体积比为0.5：1000，其中所述甲醇乙腈溶液为甲醇和乙腈体积比1：1的溶液；进行梯度洗脱，梯度条件为：
时间(min) A(％) B(％)
0～33 90→79 10→21
33～47 79→79 21→21
47～74 79→45 21→55
74～75 45→90 55→10
；ELSD条件为：漂移管温度105℃，载气流速为2.5L/min，增益值为1。
(2)对照品储备液：精密称取芦丁、异槲皮苷、水仙苷、3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-(1-2)鼠李糖基}山奈酚、槲皮素-3-O-葡萄糖基(1→2)鼠李糖苷、3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素、山奈酚-7-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、银杏内酯A(GA)、银杏内酯B(GB)、银杏内酯C(GC)对照品5mg，分别加甲醇配成浓度为1mg/mL的单一对照品储备液，置4℃冰箱中保存备用。
(3)样品制备：精密称取银杏叶提取物样品0.05g，至10ml容量瓶中。加100％甲醇溶液至容量瓶刻度线，超声提取30min。将提取液以14000r/min的速度离心10min，取上清液，再以14000r/min的速度离心10min，取上清液，作为银杏叶提取物样品储备液置4℃冰箱中保存备用。
(4)标准曲线：将上述芦丁对照品配制成浓度为250ug/ml，水仙苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷对照品配制成浓度为200μg/ml，3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-(1-2)鼠李糖基}山奈酚、槲皮素-3-O-葡萄糖基(1→2)鼠李糖苷、3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素对照品浓度为100μg/ml，异槲皮苷、山奈酚-7-O-β-D-葡萄糖苷对照品浓度为50μg/ml的混合母液，并以0.6倍逐级稀释成8个点。将GA、GB、GC配制成浓度分别为250ug/ml的混合母液，并以0.7倍逐级稀释成8个点。将上述两混合母液按照上述色谱条件进样15μl，记录峰面积。ELSD条件下以进样浓度的对数值为横坐标，以峰面积的对数值为纵坐标。求得11种化合物标准曲线的回归方程，线性范围及r值，线性关系结果如表13所示。
表13线性关系结果
(5)精密度实验：精密取适量银杏叶提取物供试品溶液，按谱条件进样15μL，按照上述色谱条件，连续进样6次。峰面积的RSD在2.47％～4.46％，均小于5％。试验结果表明：所建立的方法精密度良好。
(6)重复性实验：精密取6份银杏叶提取物供试品溶液，按“上述色谱条件进样15μL，连续进样6次。计算各化合物峰面积，RSD在1.85％～4.61％，均小于5％。试验结果表明：测定方法重现性良好。
(7)稳定性实验：取同一批供试品溶液，分别在0，2，4，8，12，24h后按照上述色谱条件，进样15μL，测定化合物峰面积。结果峰面积RSD在1.24～4.34％，均小于5％，可见样品在24h内稳定性良好。
(8)加样回收率试验：将芦丁、异槲皮苷、槲皮素-3-O-葡萄糖基(1→2)鼠李糖苷、山奈酚-7-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、水仙苷、3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素、3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-(1-2)鼠李糖基}山奈酚、GA、GB、GC配制成浓度分别为650ug/ml、51μg/ml、173μg/ml、25μg/ml、475μg/ml、413μg/ml、346μg/ml、273μg/ml、810μg/ml、760μg/ml、330μg/ml的混合母液，取100μl的混合溶液加入500μl的银杏叶提取物供试品溶液中，再加入400ul甲醇，涡旋，以14000r/min的速度离心10min，取上清液，再以14000r/min的速度离心10min，取上清液，标为样品1，平行6次，按色进样15μL。另取样品加甲醇稀释一倍，涡旋，以14000r/min的速度离心10min，取上清液，再以14000r/min的速度离心10min，取上清液标为样品2，平行3次，按色谱条件进样15μL。计算加样回收率。结果显示回收率RSD值在1.17％～4.16％范围以内，均小于5％，平均回收率在95.0％～105.0％范围内，表明本方法的准确度良好。
(9)含量检测
按照上述(3)所述条件处理样品，按上述(1)所述色谱条件进样，测得峰面积，代入相应的标准线，分别计算银杏叶提取物样品中11种化合物的含量。样品测定结果见表14。
表14银杏叶提取物样品含量测定结果
实施例9：
(1)色谱条件：固定相是以十八烷基键合硅胶为填料的色谱柱；紫外检测器与ELSD检测器串联；紫外检测波长365nm；流速为1mL/min；流动相A是0.05％四氢呋喃-0.1％甲酸-5％甲醇-水的混合溶剂，体积比是0.1：1：5：900；流动相B是0.1％四氢呋喃-甲醇乙腈溶液的混合溶剂，体积比为0.5：1000，其中所述甲醇乙腈溶液为甲醇和乙腈体积比1：1的溶液；进行梯度洗脱，梯度条件为：
时间(min) A(％) B(％)
0～10 90→84 10→16
10～30 84→80 16→20
30～33 80→79 20→21
33～47 79→79 21→21
47～48 79→76 21→24
48～63 76→67 24→33
63～64 67→60 33→40
64～74 60→45 40→55
74～75 45→90 55→10
；ELSD条件为：漂移管温度115℃，载气流速为2.5L/min，增益值为1。
(2)对照品储备液：精密称取芦丁、异槲皮苷、水仙苷、3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-(1-2)鼠李糖基}山奈酚、槲皮素-3-O-葡萄糖基(1→2)鼠李糖苷、3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素、山奈酚-7-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、银杏内酯A(GA)、银杏内酯B(GB)、银杏内酯C(GC)对照品5mg，分别加甲醇配成浓度为1mg/mL的单一对照品储备液，置4℃冰箱中保存备用。
(3)样品制备：精密称取银杏叶提取物样品0.05g，至10ml容量瓶中。加100％甲醇溶液至容量瓶刻度线，超声提取30min。将提取液以14000r/min的速度离心10min，取上清液，再以14000r/min的速度离心10min，取上清液，作为银杏叶提取物样品储备液置4℃冰箱中保存备用。
(4)标准曲线：将上述芦丁对照品配制成浓度为250ug/ml，水仙苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷对照品配制成浓度为200μg/ml，3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-(1-2)鼠李糖基}山奈酚、槲皮素-3-O-葡萄糖基(1→2)鼠李糖苷、3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素对照品浓度为100μg/ml，异槲皮苷、山奈酚-7-O-β-D-葡萄糖苷对照品浓度为50μg/ml的混合母液，并以0.6倍逐级稀释成8个点。将GA、GB、GC配制成浓度分别为250ug/ml的混合母液，并以0.7倍逐级稀释成8个点。将上述两混合母液按照上述色谱条件进样15μl，记录峰面积。ELSD条件下以进样浓度的对数值为横坐标，以峰面积的对数值为纵坐标。求得11种化合物标准曲线的回归方程，线性范围及r值，线性关系结果如表15所示。
表15线性关系结果
(5)精密度实验：精密取适量银杏叶提取物供试品溶液，按色谱条件进样15μL，按照上述色谱条件，连续进样6次。峰面积的RSD在1.21％～4.07％，均小于5％。试验结果表明：所建立的方法精密度良好。
(6)重复性实验：精密取6份银杏叶提取物供试品溶液，按“上述色谱条件进样15μL，连续进样6次。计算各化合物峰面积，RSD在0.53％～4.26％，均小于5％。试验结果表明：测定方法重现性良好。
(7)稳定性实验：取同一批供试品溶液，分别在0，2，4，8，12，24h后按照上述色谱条件，进样15μL，测定化合物峰面积。结果峰面积RSD在1.47～4.84％，均小于5％，可见样品在24h内稳定性良好。
(8)加样回收率试验：将芦丁、异槲皮苷、槲皮素-3-O-葡萄糖基(1→2)鼠李糖苷、山奈酚-7-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、水仙苷、3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素、3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-(1-2)鼠李糖基}山奈酚、GA、GB、GC配制成浓度分别为650ug/ml、51μg/ml、173μg/ml、25μg/ml、475μg/ml、413μg/ml、346μg/ml、273μg/ml、810μg/ml、760μg/ml、330μg/ml的混合母液，取100μl的混合溶液加入500μl的银杏叶提取物供试品溶液中，再加入400ul甲醇，涡旋，以14000r/min的速度离心10min，取上清液，再以14000r/min的速度离心10min，取上清液，标为样品1，平行6次，按色进样15μL。另取样品加甲醇稀释一倍，涡旋，以14000r/min的速度离心10min，取上清液，再以14000r/min的速度离心10min，取上清液标为样品2，平行3次，按色谱条件进样15μL。计算加样回收率。结果显示回收率RSD值在0.67％～4.35％范围以内，均小于5％，平均回收率在95.0％～105.0％范围内，表明本方法的准确度良好。
(9)含量检测
按照上述(3)所述条件处理样品，按上述(1)所述色谱条件进样，测得峰面积，代入相应的标准线，分别计算银杏叶提取物样品中11种化合物的含量。样品测定结果见表16
表16银杏叶提取物样品含量测定结果
实施例10：
(1)色谱条件：固定相是以十八烷基键合硅胶为填料的色谱柱；紫外检测器与ELSD检测器串联；紫外检测波长365nm；流速为1mL/min；流动相A是0.05％四氢呋喃-0.1％甲酸-5％甲醇-水的混合溶剂，体积比是2：5：15：1000；流动相B是0.1％四氢呋喃-甲醇乙腈溶液的混合溶剂，体积比为3：1200，其中所述甲醇乙腈溶液为甲醇和乙腈体积比1：1的溶液；进行梯度洗脱，梯度条件为：
时间(min) A(％) B(％)
0～10 90→84 10→16
10～30 84→80 16→20
30～33 80→79 20→21
33～47 79→79 21→21
47～48 79→76 21→24
48～63 76→67 24→33
63～64 67→60 33→40
64～74 60→45 40→55
74～75 45→90 55→10
；ELSD条件为：漂移管温度115℃，载气流速为2.5L/min，增益值为1。
(2)对照品储备液：精密称取芦丁、异槲皮苷、水仙苷、3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-(1-2)鼠李糖基}山奈酚、槲皮素-3-O-葡萄糖基(1→2)鼠李糖苷、3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素、山奈酚-7-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、银杏内酯A(GA)、银杏内酯B(GB)、银杏内酯C(GC)对照品5mg，分别加甲醇配成浓度为1mg/mL的单一对照品储备液，置4℃冰箱中保存备用。
(3)样品制备：精密称取银杏叶提取物样品0.05g，至10ml容量瓶中。加100％甲醇溶液至容量瓶刻度线，超声提取30min。将提取液以14000r/min的速度离心10min，取上清液，再以14000r/min的速度离心10min，取上清液，作为银杏叶提取物样品储备液置4℃冰箱中保存备用。
(4)标准曲线：将上述芦丁对照品配制成浓度为250ug/ml，水仙苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷对照品配制成浓度为200μg/ml，3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-(1-2)鼠李糖基}山奈酚、槲皮素-3-O-葡萄糖基(1→2)鼠李糖苷、3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素对照品浓度为100μg/ml，异槲皮苷、山奈酚-7-O-β-D-葡萄糖苷对照品浓度为50μg/ml的混合母液，并以0.6倍逐级稀释成8个点。将GA、GB、GC配制成浓度分别为250ug/ml的混合母液，并以0.7倍逐级稀释成8个点。将上述两混合母液按照上述色谱条件进样15μl，记录峰面积。ELSD条件下以进样浓度的对数值为横坐标，以峰面积的对数值为纵坐标。求得11种化合物标准曲线的回归方程，线性范围及r值，线性关系结果如表17示。
表17线性关系结果
(5)精密度实验：精密取适量银杏叶提取物供试品溶液，按色谱条件进样15μL，按照上述色谱条件，连续进样6次。峰面积的RSD在1.24％～4.58％，均小于5％。试验结果表明：所建立的方法精密度良好。
(6)重复性实验：精密取6份银杏叶提取物供试品溶液，按“上述色谱条件进样15μL，连续进样6次。计算各化合物峰面积，RSD在1.34％～4.61％，均小于5％。试验结果表明：测定方法重现性良好。
(7)稳定性实验：取同一批供试品溶液，分别在0，2，4，8，12，24h后按照上述色谱条件，进样15μL，测定化合物峰面积。结果峰面积RSD在1.22～4.68％，均小于5％，可见样品在24h内稳定性良好。
(8)加样回收率试验：将芦丁、异槲皮苷、槲皮素-3-O-葡萄糖基(1→2)鼠李糖苷、山奈酚-7-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、水仙苷、3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素、3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-(1-2)鼠李糖基}山奈酚、GA、GB、GC配制成浓度分别为650ug/ml、51μg/ml、173μg/ml、25μg/ml、475μg/ml、413μg/ml、346μg/ml、273μg/ml、810μg/ml、760μg/ml、330μg/ml的混合母液，取100μl的混合溶液加入500μl的银杏叶提取物供试品溶液中，再加入400ul甲醇，涡旋，以14000r/min的速度离心10min，取上清液，再以14000r/min的速度离心10min，取上清液，标为样品1，平行6次，按色进样15μL。另取样品加甲醇稀释一倍，涡旋，以14000r/min的速度离心10min，取上清液，再以14000r/min的速度离心10min，取上清液标为样品2，平行3次，按色谱条件进样15μL。计算加样回收率。结果显示回收率RSD值在0.72％～4.61％范围以内，均小于5％，平均回收率在95.0％～105.0％范围内，表明本方法的准确度良好。
(9)含量检测
按照上述(3)所述条件处理样品，按上述(1)所述色谱条件进样，测得峰面积，代入相应的标准线，分别计算银杏叶提取物样品中11种化合物的含量。样品测定结果见表18。
表18银杏叶提取物样品含量测定结果
应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种采用双检测器的高效液相色谱法同时测定银杏叶、银杏叶提取物及其制剂中3种银杏内酯和8种黄酮苷的含量的方法，其中所述制剂不包括舒血宁注射液，其特征在于，3种内酯分别为银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C ，8种黄酮苷分别为芦丁、异槲皮苷、水仙苷、3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-（1-2）鼠李糖基}山奈酚、槲皮素-3-O-葡萄糖基（1→2）鼠李糖苷、3-O-{2-O-[6-O-(对羟基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}槲皮素、山奈酚-7-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷，采用的色谱条件为：固定相是以十八烷基键合硅胶为填料的色谱柱；洗脱流速为0.5～2.0mL/min；流动相A是0.05%四氢呋喃-0.1%甲酸-5%甲醇-水的混合溶剂，体积比是0.1～2：1～5：5～15：900～1000；流动相B是0.1%四氢呋喃-甲醇乙腈溶液的混合溶剂，体积比为0.5～3：1000～1200，其中所述甲醇乙腈溶液为甲醇和乙腈体积比1：1的溶液；进行梯度洗脱，梯度条件为：
时间（min） A(%) B(%) 0～33 90→79 10→21 33～47 79→79 21→21 47～74 79→45 21→55 74～75 45→90 55→10
紫外检测器与ELSD检测器串联，其中紫外检测波长355～365nm、ELSD条件为：漂移管温度115～105℃，载气流速为2～3L/min，增益值为1。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的梯度条件替换为：
时间（min） A(%) B(%) 0～30 90→80 10→20 30～33 80→79 20→21 33～47 79→79 21→21 47～74 79→45 21→55 74～75 45→90 55→10
。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的梯度条件替换为：
时间（min） A(%) B(%) 0～30 90→80 10→20 30～33 80→79 20→21 33～47 79→79 21→21 47～63 79→67 21→33 63～74 67→45 33→55 74～75 45→90 55→10
。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的梯度条件替换为：
时间（min） A(%) B(%) 0～10 90→84 10→16 10～30 84→80 16→20 30～33 80→79 20→21 33～47 79→79 21→21 47～48 79→76 21→24 48～63 76→67 24→33 63～64 67→60 33→40 64～74 60→45 40→55 74～75 45→90 55→10
。
5.根据权利要求1～4任意一项所述的方法，其特征在于，所述流动相A，0.05%四氢呋喃-0.1%甲酸-5%甲醇-水的体积比是1：2：10：950。
6.根据权利要求1～4任意一项所述的方法，其特征在于，所述的流动相B，0.1%四氢呋喃-甲醇乙腈溶液体积比为1：1000，其中所述甲醇乙腈溶液为甲醇和乙腈体积比1：1的溶液。
7.根据权利要求1～4任意一项所述的方法，其特征在于，所述紫外检测波长为360nm。
8.根据权利要求1～4任意一项所述的方法，其特征在于，所述洗脱流速为1mL/min。
9.根据权利要求1～4任意一项所述的方法，其特征在于，所述漂移管温度为110℃。
10.根据权利要求1～4任意一项所述的方法，其特征在于，所述载气流速为2.5L/min。
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