CN109738544B - 一种银杏酮酯片中萜内酯类和黄酮苷类成分的整合溶出度的检测及验证方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种银杏酮酯片中萜内酯类和黄酮苷类成分的溶出度的检测方法，包括以下步骤：1）供试品溶液的制备；2）对照品溶液的制备；3）溶出溶液的制备；4）检测；5）溶出度计算。本发明还进一步提供一种银杏酮酯片中萜内酯类和黄酮苷类成分的整合溶出度的检测方法及验证方法。本发明提供的一种银杏酮酯片中萜内酯类和黄酮苷类成分的整合溶出度的检测及验证方法，能够同时测定银杏酮酯片中萜内酯类和黄酮苷类两大类成分的溶出度，计算整合溶出度，并拟合出整合溶出曲线进行相似分析，验证其可靠性，为中药整体性质的研究提供一定的研究思路。

Description

一种银杏酮酯片中萜内酯类和黄酮苷类成分的整合溶出度的 检测及验证方法

技术领域

本发明属于中药成分分析检测技术领域，涉及一种银杏酮酯片中萜内酯类和黄酮苷类成分的整合溶出度的检测及验证方法。

背景技术

体外溶出度研究是中药制剂的重要评价指标之一，不仅能模拟口服固体制剂在胃肠道中崩解和溶出情况，也能控制药物制剂的质量。银杏酮酯片是上海上药杏灵药业股份有限公司生产的主要产品，被广泛用于治疗血瘀型胸痹及血瘀型轻度脑动脉硬化引起的眩晕、冠心病、心绞痛等心血管疾病。目前银杏酮酯片在国家标准中只有崩解时限的检测，尚未有溶出度检测，不能很好的反映银杏酮酯片在体内外的溶出情况。

目前，体外溶出度常见的评价方法主要以单一指标成分、多个指标成分或大类成分为指标进行体外溶出度研究，这些方法最大的不足之处是若只研究其中的一个或几个指标成分的释放，且中药药效存在多组分协同发挥作用，难以反映中药组分的整体体外溶出行为。目前对银杏酮酯中萜内酯类和黄酮苷类成分主要用不同检测器分开检测，萜内酯类成分主要用蒸发光检测器检测，黄酮苷类成分主要用紫外检测器检测，样品前处理和检测程序复杂繁琐，选用液质联用的方法同时检测两类成分，大大降低了样品前处理和检测程序的复杂繁琐过程。而且中药组分中各成分占总成分的质量百分比是影响中药组分性质的一个固定因素，如同中药的量效关系，量决定效，故本研究尝试基于液质联用技术用质量权重系数法研究银杏酮酯片溶出度，以表征银杏酮酯片整体溶出行为，为中药整体性质研究提供一定参考。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种银杏酮酯片中萜内酯类和黄酮苷类成分的整合溶出度的检测及验证方法，运用UPLC-Q-TOF/MS同时测定银杏酮酯片中萜内酯类和黄酮苷类两大类成分的溶出度，进一步通过质量分数权重系数法表征银杏酮酯片的整合溶出度，并通过f₂相似因子法比较各单体成分的溶出曲线与整合溶出曲线的相似性，验证整合溶出度的可靠性，从而整合表征银杏酮酯片中萜内酯类和黄酮苷类多成分在体外的溶出情况。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种银杏酮酯片中萜内酯类和黄酮苷类成分的溶出度的检测方法，包括以下步骤：

1)供试品溶液的制备：取银杏酮酯片，加入甲醇水溶液进行超声提取、离心后取上清液，加入甲醇水溶液定容后再稀释，即得供试品溶液；

2)对照品溶液的制备：将银杏酮酯片中萜内酯类和黄酮苷类成分的对照品分别加入二甲基亚砜(DMSO)溶解后配成相应的对照品母液，再分别取对照品母液混合后加入甲醇水溶液定容，得到对照品溶液；

3)溶出溶液的制备：取溶出介质，加入银杏酮酯片进行溶出实验后，取样离心后取上清液，再加入溶出介质稀释，即得溶出溶液；

4)检测：采用超高效液相色谱质谱联用法UPLC-Q-TOF/MS分别测定供试品溶液、对照品溶液及溶出溶液，根据分子质量、保留时间，分别确定供试品溶液和溶出溶液中萜内酯类和黄酮苷类成分，并根据外标法分别确定供试品溶液和溶出溶液中萜内酯类和黄酮苷类成分的含量；

5)溶出度计算：将供试品溶液与溶出溶液中萜内酯类和黄酮苷类成分的含量，按公式Ⅰ分别计算银杏酮酯片中萜内酯类和黄酮苷类成分的溶出度，所述公式Ⅰ为：溶出度％＝(Ai×V1×m2)/(Bi×V2×m1)×100％；其中，Ai：溶出溶液中各成分的含量，ng/mL；Bi：供试品溶液中各成分的含量，ng/mL；V1：溶出介质体积，mL；V2：供试品溶液体积，mL；m1：溶出溶液中加入银杏酮酯片重量，g；m2：供试品溶液制备时银杏酮酯片重量，g。

优选地，所述银杏酮酯片中萜内酯类和黄酮苷类成分包括有银杏内酯B(CAS号为15291-77-7)、银杏内酯A(CAS号为15291-75-5)、银杏内酯C(CAS号为15291-76-6)、白果内酯(CAS号为33570-04-6)、芦丁(CAS号为153-18-4)、异槲皮苷(CAS号为482-35-9)、3-O-GLC-异鼠李素(CAS号为5041-82-7)、山奈酚-3-O-芸香糖(CAS号为17650-84-9)、香蒲新苷(CAS号为104472-68-6)。

优选地，步骤1)中，所述银杏酮酯片要研磨成粉。

优选地，步骤1)中，所述银杏酮酯片加入的质量mg与甲醇水溶液加入的体积mL之比为80-120：4-6。

更优选地，所述银杏酮酯片加入的质量mg与甲醇水溶液加入的体积mL之比为100：5。

更优选地，所述银杏酮酯片加入的质量为80-120mg。进一步优选地，所述银杏酮酯片加入的质量为100mg。

更优选地，所述甲醇水溶液进行超声提取加入的体积为4-6mL。进一步优选地，所述甲醇水溶液进行超声提取加入的体积为5mL。

优选地，步骤1)中，所述超声提取的时间为8-12min。更优选地，所述超声提取的时间为10min。

优选地，步骤1)中，所述离心转速为8000-12000r/min。更优选地，所述离心转速为10000r/min。

优选地，步骤1)中，所述离心时间为8-12min。更优选地，所述离心时间为10min。

优选地，步骤1)中，所述超声提取、离心后取上清液重复进行且合并上清液。

更优选地，所述重复进行的次数为3-5次。进一步优选地，所述重复进行的次数为3次。

优选地，步骤1)中，所述定容的体积为20-30mL。更优选地，所述定容的体积为25mL。

优选地，步骤1)中，所述稀释的倍数为9-11倍。更优选地，所述稀释的倍数为10倍。

优选地，步骤2)中，所述对照品母液的浓度为1±0.05mg/mL。

优选地，步骤1)或2)中，所述甲醇水溶液为40-60％体积百分比甲醇水溶液。更优选地，所述甲醇水溶液为50％体积百分比甲醇水溶液。

优选地，步骤2)中，所述混合对照品溶液中各成分的浓度范围为：银杏内酯B62-3980ng/mL、银杏内酯A 151-9680ng/mL、银杏内酯C 67-4260ng/mL、白果内酯238-15200ng/mL、芦丁164-10480ng/mL、异槲皮苷40-2560ng/mL、3-O-GLC-异鼠李素50-3210ng/mL、山奈酚-3-O-芸香糖93-5920ng/mL、香蒲新苷175-11200ng/mL。

优选地，步骤3)中，所述溶出介质为盐酸水溶液。

优选地，步骤3)中，所述溶出介质的pH值为1.1-1.3。更优选地，所述溶出介质的pH值为1.2。所述溶出介质用于模拟胃液，其pH值采用pH计校正测定。

优选地，步骤3)中，所述银杏酮酯片加入的质量(mg)与溶出介质加入的体积(mL)之比为1440-1560:450-550。更优选地，所述银杏酮酯加入的质量(mg)与溶出介质加入的体积(mL)之比为1500:500。

优选地，步骤3)中，所述溶出试验采用的装置为药物溶出仪(溶出度测试仪)。所述溶出试验采用浆法进行。

优选地，步骤3)中，所述溶出试验的条件为：溶出转速为90-110r/min；溶出温度为36-38℃；溶出时间为1-120min。更优选地，所述溶出试验的条件为：溶出转速为100r/min；溶出温度为37℃；溶出时间为5-120min。

优选地，步骤3)中，所述取样后加入溶出介质补足失重。

优选地，步骤3)中，所述离心转速为5000-7000r/min。更优选地，所述离心转速为6000r/min。

优选地，步骤3)中，所述离心时间为8-12min。更优选地，所述离心时间为10min。

优选地，步骤3)中，所述溶出介质的稀释倍数为9-11倍。更优选地，所述溶出介质的稀释倍数为10倍。

优选地，步骤4)中，所述超高效液相色谱质谱联用法选用的色谱柱为C₁₈色谱柱。更优选地，所述超高效液相色谱质谱联用法选用的色谱柱为UPLC BEH C₁₈(2.1mm×100mm，1.7μm)色谱柱。

优选地，步骤4)中，所述超高效液相色谱质谱联用法选用的柱温为40-50℃。更优选地，所述超高效液相色谱质谱联用法选用的柱温为45℃。

优选地，步骤4)中，所述超高效液相色谱质谱联用法选用的流速为0.3-0.5ml/min。更优选地，所述超高效液相色谱质谱联用法选用的流速为0.4ml/min。

优选地，步骤4)中，所述超高效液相色谱质谱联用法选用的进样量为1-5μL。更优选地，所述超高效液相色谱质谱联用法选用的进样量为1μL。

优选地，步骤4)中，所述超高效液相色谱质谱联用法选用的流动相为水(含甲酸)-甲醇溶液，其中，A相为水(含甲酸)，B相为甲醇。

更优选地，所述超高效液相色谱质谱联用法选用的流动相为水(含0.1％甲酸v/v)-甲醇溶液，其中，A相为水(含0.1％甲酸v/v)，B相为甲醇。

优选地，步骤4)中，所述超高效液相色谱质谱联用法选用的洗脱方式为梯度洗脱，分析时间为15min。

更优选地，所述梯度洗脱程序的具体为：

0-10min，A相：B相体积比为98：2-25：75；

10-10.5min，A相：B相体积比为25：75-2：98；

10.5-13min，A相：B相体积比为2：98-2：98；

13-13.5min，A相：B相体积比为2：98-98：2；

13.5-15min，A相：B相体积比为98：2-98：2。

优选地，步骤4)中，所述超高效液相色谱质谱联用法选用的质谱条件为：扫描模式为负离子条件下Sensitivity模式；扫描时间为14-16min；离子源为ESI源；离子源温度(sourcetemperature)为110-130℃；毛细管电压(capillary voltage)为2-3kV；脱溶剂气(desolvation gas)流速为700-900L/h；脱溶剂气(desolvation gas)温度为300-500℃；锥孔电压(sampling cone)为30-40V；萃取电压(extraction cone)为3-5V；数据采集模式为MS^E；扫描范围为m/z 40-1500amu。

更优选地，所述超高效液相色谱质谱联用法选用的质谱条件为：扫描模式为负离子条件下Sensitivity模式；扫描时间为15min；离子源为ESI源；离子源温度(sourcetemperature)为120℃；毛细管电压(capillary voltage)为2.5kV；脱溶剂气(desolvation gas)流速为800L/h；脱溶剂气(desolvation gas)温度为400℃；锥孔电压(sampling cone)为35V；萃取电压(extraction cone)为4.0V；数据采集模式为MS^E；扫描范围为m/z 50-1200amu。

优选地，步骤4)中，所述外标法是指：分别移取一系列不同体积的步骤2)所述对照品溶液，采用超高效液相色谱质谱联用仪进样分析，获得对照品溶液中萜内酯类和黄酮苷类成分含量与峰面积的线性关系，以每一种萜内酯类和黄酮苷类成分色谱峰面积对应其相应的含量，绘制相应的标准工作曲线，计算得到各标准工作曲线的回归方程。再将供试品溶液及溶出溶液分别采用超高效液相色谱质谱联用仪检测，将获得的供试品溶液及溶出溶液中萜内酯类和黄酮苷类成分的色谱峰面积，分别代入所述各标准工作曲线的回归方程中，可得到相应萜内酯类和黄酮苷类成分的含量。

本发明第二方面提供一种银杏酮酯片中萜内酯类和黄酮苷类成分的整合溶出度的检测方法，包括以下步骤：

A)取银杏酮酯片，根据上述银杏酮酯片中萜内酯类和黄酮苷类成分的溶出度的检测方法中步骤3)，于不同溶出时间点进行溶出试验，获得一系列的溶出溶液；

B)将步骤A)获得的一系列的溶出溶液，根据上述银杏酮酯片中萜内酯类和黄酮苷类成分的溶出度的检测方法中步骤4)进行测定，获得一系列的溶出溶液中各个萜内酯类和黄酮苷类成分的含量；

C)将步骤B)获得的一系列的溶出溶液中各个萜内酯类和黄酮苷类成分的含量，根据上述银杏酮酯片中萜内酯类和黄酮苷类成分的溶出度的检测方法中步骤5)进行计算，获得一系列的溶出溶液中各个萜内酯类和黄酮苷类成分的溶出度；

D)根据上述银杏酮酯片中萜内酯类和黄酮苷类成分的溶出度的检测方法中步骤4)获得的供试品溶液中各个萜内酯类和黄酮苷类成分的含量，按公式Ⅱ计算各个萜内酯类和黄酮苷类成分的质量权重系数，所述公式Ⅱ为：ψ＝n/ω，其中，ψ为质量权重系数；ω为成分的总含量，％；n为各成分abcd...中任意一个成分的含量，即{abcd...}中任意一个，％，；n/ω选自

中的任意一个，即

中任意一个；abcd...为各成分的含量，％；

E)将步骤D)获得的供试品溶液中各个萜内酯类和黄酮苷类成分的质量权重系数，与步骤C)获得的一系列的溶出溶液中相应萜内酯类和黄酮苷类成分的溶出度，按公式Ⅲ计算各成分于不同溶出时间点的整合溶出度，所述公式Ⅲ为：

其中，δ为整合溶出度，％；ψ为质量权重系数；A，B，C…为各成分溶出度，％；ω为成分的总含量，％；i为成分个数，1-n个，n为各成分abcd...的个数集合，n＝{abcd...}；abcd...为各成分的含量，％。

本发明第三方面提供一种银杏酮酯片中萜内酯类和黄酮苷类成分的整合溶出度的验证方法，包括以下步骤：

a)根据上述银杏酮酯片中萜内酯类和黄酮苷类成分的整合溶出度的检测方法中步骤C)，将获得的一系列的溶出溶液中各个萜内酯类和黄酮苷类成分的溶出度为纵坐标，以不同溶出时间点为横坐标，绘制各个萜内酯类和黄酮苷类成分的溶出曲线；

b)根据上述银杏酮酯片中萜内酯类和黄酮苷类成分的整合溶出度的检测方法中步骤E)，将获得的各成分于不同溶出时间点的整合溶出度为纵坐标，以不同溶出时间点为横坐标，绘制整合溶出曲线；

c)将步骤a)获得的各成分的溶出曲线与步骤b)获得的整合溶出曲线，采用f₂相似因子法，按公式Ⅳ进行相似度判定，所述公式Ⅳ为：

其中，f₂：相似因子；n：时间点的个数；Ri：整合溶出曲线在第i个时间点的溶出度，％；Ti：各成分溶出曲线在第i个时间点的溶出度，％。

优选地，步骤c)中，当f₂≥50，判定成分的溶出曲线与整合溶出曲线相似。

优选地，步骤c)中，所述f₂相似因子法作为定量描述体外溶出曲线相似性的非模型依赖方法，因为其计算简单、判定方法可靠，已经被美国FDA的CDER(药品评价和研究中心)和欧盟的EMEA推荐使用，多用于受试试剂与参比制剂之间的溶出曲线相关性研究，本研究主要采用f₂相似因子法对溶出曲线的相似度进行判定。

如上所述，本发明提供的一种银杏酮酯片中萜内酯类和黄酮苷类成分的整合溶出度的检测及验证方法，运用UPLC-Q-TOF/MS同时测定银杏酮酯片中萜内酯类和黄酮苷类两大类成分(银杏内酯B、银杏内酯A、银杏内酯C、白果内酯、芦丁、异槲皮苷、3-O-GLC-异鼠李素、山奈酚-3-O-芸香糖、香蒲新苷)的溶出度，进一步通过质量分数权重系数法，计算整合溶出度，再通过各成分溶出度和整合溶出度，拟合出各成分溶出曲线和整合溶出曲线，采用f₂相似因子法比较各单体成分的溶出曲线与整合溶出曲线的相似性，验证整合溶出度的可靠性。

通过该方法表明银杏酮酯片中萜内酯类和黄酮苷类成分的溶出性较好，在30min内溶出度均达到90％以上，通过f₂相似性的比较，整合溶出曲线与各成分的溶出曲线的f₂均大于50，说明整合溶出曲线与各成分溶出曲线具有较好的相关性，能较好的表征银杏酮酯片体外整体溶出情况，为中药整体性质的研究提供一定的研究思路，为制剂的质量标准提升奠定基础。

另外，目前萜内酯类成分测定方法主要采用含有ELSD检测器的HPLC方法，黄酮苷类测定主要采用含有UV检测器的HPLC方法，本研究采用液质联用的方法，不仅能同时快速测定萜内酯类和黄酮苷类两类成分，简化样品前处理过程，减少两类成分分开检测的繁琐程序，而且增加了检测灵敏度，避免成分溶出浓度低未能检测出或浓度低引起较大误差。

附图说明

图1显示为本发明的空白溶液、混合对照品溶液、样品溶液中各成分提取离子色谱图，其中，1A为空白溶液中各成分提取离子色谱图，1B为阴性对照品溶液中各成分提取离子色谱图，1C为溶出样品溶液中各成分提取离子色谱图。

图2显示为本发明的银杏酮酯片中萜内酯类和黄酮苷类各成分累积释放曲线。

图3显示为本发明的银杏酮酯片的整合溶出曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

以下实施例使用的试剂和仪器如下：

1、试剂

银杏内酯B(批号110863-201611，中国食品药品检定研究院)；银杏内酯A(批号W25A7K13730，上海源叶生物科技有限公司)；银杏内酯C(批号C28S6G3986，上海源叶生物科技有限公司)；白果内酯(批号P08J9F52398，上海源叶生物科技有限公司)；芦丁(批号Y16M9S61523，上海源叶生物科技有限公司)；3-O-GLC-异鼠李素(批号Y09J9H52567，上海源叶生物科技有限公司)；山奈酚-3-O-芸香糖(批号Y15N8H48277，上海源叶生物科技有限公司)；香蒲新苷(批号Y1458H43976，上海源叶生物科技有限公司)；异槲皮苷(批号2183/17872，上海诗丹德生物技术有限公司)；银杏酮酯片(批号171002，上海上药杏灵科技药业股份有限公司)。

2、仪器

超高效液质联用仪(UPLC-Q-TOF-MS，Waters公司)；UPLC BEH C18色谱柱(Waters公司)；Rcz 6C3型溶出度测试仪(上海黄海药检仪器有限公司)；FE28PH计(梅特勒-托利多公司)；SQPQUINTIX65-1CN分析天平(Sartorius公司)。

实施例1

1、供试品溶液的制备

取银杏酮酯片研磨成粉，精密称取80-120mg，加入40-60％甲醇水溶液4-6mL，超声提取8-12min，再以8000-12000r/min转速离心8-12min，取上清液。加入甲醇水溶液进行超声提取、离心后取上清液，重复上述步骤3-5次，合并上清液加入40-60％甲醇水溶液定容至20-30mL，再加入40-60％甲醇水溶液稀释9-11倍，即得供试品溶液。

2、对照品溶液的制备

将银杏酮酯片中萜内酯类和黄酮苷类成分的对照品分别加入二甲基亚砜(DMSO)溶解后配成相应的浓度为1±0.05mg/mL对照品母液，其中，萜内酯类和黄酮苷类成分的对照品包括银杏内酯B、银杏内酯A、银杏内酯C、白果内酯、芦丁、异槲皮苷、3-O-GLC-异鼠李素、山奈酚-3-O-芸香糖、香蒲新苷，再分别精密吸取各对照品母液混合后加入40-60％甲醇水溶液稀释成一系列不同浓度对照品溶液。

3、溶出溶液的制备

取450-550mL pH1.1-1.3盐酸水溶液为溶出介质置于溶出杯中，加入银杏酮酯片6片共1440-1560mg，置于溶出仪中，进行溶出试验，溶出转速为90-110r/min，溶出温度为36-38℃，溶出时间为1-120min。取样后加入溶出介质补足失重至溶出杯中，以转速5000-7000r/min离心8-12min，取上清液加入pH1.1-1.3盐酸水溶液稀释9-11倍，即得溶出溶液。

4、检测

采用UPLC-Q-TOF液质联用仪分别测定供试品溶液、对照品溶液及溶出溶液，根据分子质量、保留时间，分别确定供试品溶液和溶出溶液中萜内酯类和黄酮苷类成分，并根据外标法分别确定供试品溶液和溶出溶液中萜内酯类和黄酮苷类成分的含量，进而获得银杏酮酯片中萜内酯类和黄酮苷类成分的含量。

其中，所述超高效液相色谱质谱联用法中的色谱条件为：色谱柱为C₁₈色谱柱，柱温为40-50℃，流速为0.3-0.5ml/min，进样量为1-5μL，流动相为水(含甲酸)-甲醇溶液，其中，A相为水(含甲酸)，B相为甲醇。洗脱方式为梯度洗脱，分析时间为15min。

所述梯度洗脱程序的具体为：

0-10min，A相：B相体积比为98：2-25：75；

10-10.5min，A相：B相体积比为25：75-2：98；

10.5-13min，A相：B相体积比为2：98-2：98；

13-13.5min，A相：B相体积比为2：98-98：2；

13.5-15min，A相：B相体积比为98：2-98：2。

所述超高效液相色谱质谱联用法中的质谱条件为：扫描模式为负离子条件下Sensitivity模式；扫描时间为14-16min；离子源为ESI源；离子源温度(sourcetemperature)为110-130℃；毛细管电压(capillary voltage)为2-3kV；脱溶剂气(desolvation gas)流速为700-900L/h；脱溶剂气(desolvation gas)温度为300-500℃；锥孔电压(sampling cone)为30-40V；萃取电压(extraction cone)为3-5V；数据采集模式为MS^E；扫描范围为m/z 40-1500amu。

5、溶出度计算

将供试品溶液与溶出溶液中萜内酯类和黄酮苷类成分的含量，按公式Ⅰ分别计算银杏酮酯片中萜内酯类和黄酮苷类成分的溶出度，所述公式Ⅰ为：溶出度％＝(Ai×V1×m2)/(Bi×V2×m1)×100％；其中，Ai：溶出溶液中各成分的含量，ng/mL；Bi：供试品溶液中各成分的含量，ng/mL；V1：溶出介质体积，mL；V2：供试品溶液体积，mL；m1：溶出溶液中加入银杏酮酯片重量，g；m2：供试品溶液制备时银杏酮酯片重量，g。

实施例2

1、供试品溶液的制备

取银杏酮酯片20片，研磨成粉，精密称取100mg，加入50％甲醇水溶液5mL，,超声提取10min，再以10000r/min转速离心10min，取上清液。加入甲醇水溶液进行超声提取、离心后取上清液，重复上述步骤3次，合并上清液加入50％甲醇水溶液定容至25mL，再加入50％甲醇水溶液稀释10倍，即得供试品溶液。

2、对照品溶液的制备

将银杏酮酯片中萜内酯类和黄酮苷类成分的对照品分别加入二甲基亚砜(DMSO)溶解后配成相应的浓度为1mg/mL对照品母液，其中，萜内酯类和黄酮苷类成分的对照品包括银杏内酯B、银杏内酯A、银杏内酯C、白果内酯、芦丁、异槲皮苷、3-O-GLC-异鼠李素、山奈酚-3-O-芸香糖、香蒲新苷，再分别精密吸取各对照品母液混合后加入50％甲醇水溶液稀释成一系列不同浓度对照品溶液。对照品溶液中各成分的含量范围为：银杏内酯B62-3980ng/mL、银杏内酯A151-9680ng/mL、银杏内酯C 67-4260ng/mL、白果内酯238-15200ng/mL、芦丁164-10480ng/mL、异槲皮苷40-2560ng/mL、3-O-GLC-异鼠李素50-3210ng/mL、山奈酚-3-O-芸香糖93-5920ng/mL、香蒲新苷175-11200ng/mL。

3、溶出溶液的制备

取500mL pH1.2盐酸水溶液为溶出介质置于溶出杯中，加入银杏酮酯片6片共1500mg，置于溶出仪中，进行溶出试验，溶出转速为100r/min，溶出温度为37℃，溶出时间为5-120min。取样3mL后加入溶出介质3mL补足失重至溶出杯中，以转速6000r/min离心10min，取上清液加入pH1.2盐酸水溶液稀释10倍，即得溶出溶液。

4、检测

采用UPLC-Q-TOF液质联用仪分别测定供试品溶液、对照品溶液及溶出溶液，根据分子质量、保留时间，分别确定供试品溶液和溶出溶液中萜内酯类和黄酮苷类成分，并根据外标法分别确定供试品溶液和溶出溶液中萜内酯类和黄酮苷类成分的含量，进而获得银杏酮酯片中萜内酯类和黄酮苷类成分的含量。

其中，所述超高效液相色谱质谱联用法中的色谱条件为：色谱柱为UPLC BEH C₁₈(2.1mm×100mm，1.7μm)色谱柱，柱温为45℃，流速为0.4ml/min，进样量为1μL，流动相为水(含0.1v/v％甲酸)-甲醇溶液，其中，A相为水(含0.1v/v％甲酸)，B相为甲醇。洗脱方式为梯度洗脱，分析时间为15min。

所述梯度洗脱程序的具体为：

0-10min，A相：B相体积比为98：2-25：75；

10-10.5min，A相：B相体积比为25：75-2：98；

10.5-13min，A相：B相体积比为2：98-2：98；

13-13.5min，A相：B相体积比为2：98-98：2；

13.5-15min，A相：B相体积比为98：2-98：2。

所述超高效液相色谱质谱联用法中的质谱条件为：扫描模式为负离子条件下Sensitivity模式；扫描时间为15min；离子源为ESI源；离子源温度(sourcetemperature)为120℃；毛细管电压(capillary voltage)为2.5kV；脱溶剂气(desolvation gas)流速为800L/h；脱溶剂气(desolvation gas)温度为400℃；锥孔电压(sampling cone)为35V；萃取电压(extraction cone)为4.0V；数据采集模式为MS^E；扫描范围为m/z 50-1200amu。

5、溶出度计算

将供试品溶液与溶出溶液中萜内酯类和黄酮苷类成分的含量，按公式Ⅰ分别计算银杏酮酯片中萜内酯类和黄酮苷类成分的溶出度，所述公式Ⅰ为：溶出度％＝(Ai×V1×m2)/(Bi×V2×m1)；其中，Ai：溶出溶液中各成分的含量，ng/mL；Bi：供试品溶液中各成分的含量，ng/mL；V1：溶出介质体积，mL；V2：供试品溶液体积，mL；m1：溶出溶液中加入银杏酮酯片重量，g；m2：供试品溶液制备时银杏酮酯片重量，g。

实施例3

精密称定各萜内酯类和黄酮苷类成分的对照品，分别加入二甲基亚砜(DMSO)溶解后配成相应的浓度为1mg/mL对照品母液，其中，萜内酯类和黄酮苷类成分的对照品包括银杏内酯B、银杏内酯A、银杏内酯C、白果内酯、芦丁、异槲皮苷、3-O-GLC-异鼠李素、山奈酚-3-O-芸香糖和香蒲新苷。再分别精密吸取各对照品母液混合后加入50％甲醇水溶液稀释定容，配成一系列不同浓度的对照品溶液。分别取该系列不同浓度的对照品溶液1μL，按实施例2中步骤4的液质条件进行测定并计算获得各成分的标准回归方程、相关系数和线性范围。具体结果见表1。

表1萜内酯类和黄酮苷类成分的回归方程和线性范围

化合物	标准曲线	R<sup>2</sup>	线性范围(ng/mL)
				银杏内酯B	y＝8.9283x+1660.9	0.9943	62-3980
银杏内酯A	y＝5.9015x+1069.7	0.9963	151-9680
				银杏内酯C	y＝4.3258x+107.17	0.9981	67-4260
白果内酯	y＝2.8648x+2087	0.9912	238-15200
				芦丁	y＝7.6061x+444.91	0.9986	164-10480
异槲皮苷	y＝7.1276x+64.264	0.9982	40-2560
				3-O-GLC-异鼠李素	y＝14.367x+352.07	0.9984	50-3210
山奈酚-3-O-芸香糖	y＝11.927x+540.81	0.9992	93-5920
				香蒲新苷	y＝6.9879x+249.32	0.9995	175-11200

根据表1可知，标准回归方程以色谱峰面积为纵坐标(Y)，化合物浓度为横坐标(X)，9种成分在一定线性范围内均呈良好的线性关系，其标准回归方程的相关系数均大于0.9900。

实施例4

对本发明中萜内酯类和黄酮苷类成分的测定方法的专属性进行考察，根据银杏酮酯片的处方分别称取空白辅料，按处方比例制成阴性制剂，同时准备各成分的单个对照品，按实施例2中步骤3溶出溶液的制备方法分别制备得到空白溶液、溶出溶液、阴性对照品溶液。将空白溶液、溶出溶液、阴性对照品溶液按实施例2的步骤4中液质条件进行测定，具体结果见图1。由图1可知，本发明银杏酮酯片中辅料及其余成分对萜内酯类和黄酮苷类待测成分的测定无影响，且待测成分间也互不影响。

实施例5

精密称取实施例2的步骤2中对照品溶液，按实施例2的步骤4中液质条件连续进样6次，测定各待测成分峰面积，计算各成分的精密度。各成分的精密度RSD值分别为银杏内酯B 2.63％，银杏内酯A 2.42％，银杏内酯C 2.20％，白果内酯1.98％，芦丁1.26％，异槲皮苷1.59％，3-O-GLC-异鼠李素1.55％，山奈酚-3-O-芸香糖1.37％，香蒲新苷1.39％。各成分精密度RSD值均小于5％，表明仪器精密度良好。

实施例6

取实施例2的步骤1中的供试品溶液6份，分别于0、2、4、8、12h按实施例2的步骤4中液质条件测定，结果显示供试品中各类成分在12h内基本稳定，其RSD分别为银杏内酯B2.89％，银杏内酯A2.46％，银杏内酯C 3.06％，白果内酯2.40％，芦丁2.55％，异槲皮苷2.54％，3-O-GLC-异鼠李素2.05％，山奈酚-3-O-芸香糖2.13％，香蒲新苷2.20％。各成分稳定性RSD值均小于5％，表明供试品溶液在12h内稳定。

实施例7

按实施例2的步骤3中溶出溶液的制备方法平行操作6份，按实施例2的步骤4中液质条件测定峰面积，计算各成分的重复性，结果各成分重复性RSD值分别为银杏内酯B1.69％，银杏内酯A1.69％，银杏内酯C 2.18％，白果内酯2.45％，芦丁1.12％，异槲皮苷1.06％，3-O-GLC-异鼠李素3.40％，山奈酚-3-O-芸香糖1.41％，香蒲新苷3.82％。各成分重复性RSD值小于5％，表明实验重复性能较好。

实施例8

取实施例2的步骤1中的供试品溶液6份，分别精密加入对照品溶液，涡旋混匀，按实施例2的步骤4中液质条件进样测定各成分的加样回收率。结果各成分的加样回收率分别为银杏内酯B(93.49±2.8)％，银杏内酯A(95.94±2.1)％，银杏内酯C(97.45±1.8)％，白果内酯(90.88±3.0)％，芦丁(104.21±2.8)％，异槲皮苷(101.51±4.3)％，3-O-GLC-异鼠李素(98.43±3.1)％，山奈酚-3-O-芸香糖(94.17±3.7)％，香蒲新苷(97.34±4.6)％。各成分回收率RSD值分别为银杏内酯B 3.00％，银杏内酯A2.24％，银杏内酯C 1.82％，白果内酯3.33％，芦丁2.69％，异槲皮苷4.20％，3-O-GLC-异鼠李素3.10％，山奈酚-3-O-芸香糖3.93％，香蒲新苷4.72％。各成分的回收率均在90％～105％之间，RSD值也均小于5％，表明实验方法准确度较好。

实施例9

按实施例2的步骤3中溶出溶液的制备方法，选择不同的溶出时间，具体为5min、15min、30min、45min、60min、90min、120min，从而获得不同时间点的一系列的溶出溶液。再按实施例2的步骤4中液质条件进行测定，获得一系列的溶出溶液中各个萜内酯类和黄酮苷类成分的含量。再按实施例2的步骤5中溶出度计算公式进行计算，获得各成分的溶出度，具体结果见表2。然后，将获得的一系列的溶出溶液中各个萜内酯类和黄酮苷类成分的溶出度为纵坐标，以不同溶出时间点为横坐标，绘制各个萜内酯类和黄酮苷类成分的溶出曲线，具体结果见图2。由图2、表2可知，银杏酮酯片中萜内酯类和黄酮苷类成分的溶出性较好，30min内溶出度均达到了90％以上。

表2银杏酮酯片中萜内酯类和黄酮苷类成分溶出度(n＝5)

实施例10

根据实施例2中计算获得的供试品溶液中各个萜内酯类和黄酮苷类成分的含量，按公式Ⅱ计算各个萜内酯类和黄酮苷类成分的质量权重系数，即以银杏酮酯片中萜内酯类和黄酮苷类的质量分数为质量权重系数，各成分质量权重系数为成分与总成分质量分数之比。所述公式Ⅱ为：ψ＝n/ω，其中，ψ为质量权重系数；ω为成分的总含量，％；n为各成分abcd...中任意一个成分的含量，即{abcd...}中任意一个，％，；n/ω选自

中的任意一个，即

中任意一个；abcd...为各成分的含量，％。具体结果见表3。

表3萜内酯类和黄酮苷类各成分的权重系数

成分	质量分数(％)	权重系数
			银杏内酯B	0.21	0.085
银杏内酯A	0.47	0.191
			银杏内酯C	0.16	0.065
白果内酯	0.72	0.292
			芦丁	0.44	0.178
异槲皮苷	0.11	0.045
			3-O-GLC-异鼠李素	0.012	0.005
山奈酚-3-O-芸香糖	0.29	0.118
			香蒲新苷	0.054	0.022

再将获得的各个萜内酯类和黄酮苷类成分的质量权重系数，与实施例9中计算获得的一系列的溶出溶液中各个萜内酯类和黄酮苷类成分的溶出度，按公式Ⅲ计算各成分于不同溶出时间点的整合溶出度，所述公式Ⅲ为：

其中，δ为整合溶出度，％；ψ为质量权重系数；A，B，C…为各成分溶出度，％；ω为成分的总含量，％；i为成分个数，1-n个，n为各成分abcd...的个数集合，n＝{abcd...}；abcd...为各成分的含量，％。具体结果见表4。然后，将获得的各成分于不同溶出时间点的整合溶出度为纵坐标，以不同溶出时间点为横坐标，绘制整合溶出曲线。具体结果见表图3。由表4、图3可知，整合溶出度显示银杏酮酯片整体溶出性较好，在30min内溶出度达到90％以上，与各单体成分溶出行为相似。

表4银杏酮酯片整合溶出度

T(min)	整合溶出度(％)
		5	9.16
15	77.28
		30	97.97
45	98.44
		60	97.17
90	96.37
		120	96.83

最后，将整合溶出曲线与实施例9中的各成分的溶出曲线，采用f₂相似因子法，按公式Ⅳ进行相似度判定，所述公式Ⅳ为：

其中，f₂：相似因子；n：时间点的个数；Ri：整合溶出曲线在第i个时间点的溶出度，％；Ti：各成分溶出曲线在第i个时间点的溶出度，％。

如图2、3通过相似度判定可知，银杏内酯B、银杏内酯A、银杏内酯C、白果内酯、芦丁、异槲皮苷、3-O-GLC-异鼠李素、山奈酚-3-O-芸香糖、香蒲新苷的溶出曲线分别与整合溶出曲线相比较，结果f₂相似因子分别为77、77、74、70、76、64、70、77、55，其f₂相似因子均≥50，各成分的溶出曲线与整合溶出曲线均相似，具有较好的相关性，可客观反映银杏酮酯片整体的溶出行为。

通过上述验证方法表明，银杏酮酯片在模拟胃酸的pH1.2缓冲液中溶出性较好，在30min时，各单体成分溶出度和整合溶出度均达到90％以上，表明银杏酮酯片在pH1.2缓冲液中能较快溶出。且通过f₂相似因子法验证，整合溶出曲线与各单体成分溶出曲线具有较好的相关性，能反映银杏酮酯片体外整体溶出行为，间接揭露银杏酮酯片在人体胃里的溶出情况。

由于中药具有整体性，难以用其中一个成分的溶出曲线代表银杏酮酯片的整体溶出情况。本研究采用质量分数权重系数法，将9个化学成分通过权重系数进行整合，拟合出一条整合溶出曲线，并通过f₂相似因子法进行相似度比较，结果均相似，故用整合溶出曲线更具代表性的表征银杏酮酯片整体溶出情况，为中药整体性质研究提供一定研究思路。

所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (3)

1.一种银杏酮酯片中萜内酯类和黄酮苷类成分的整合溶出度的检测方法，包括以下步骤：采用如下方法测定银杏酮酯片中萜内酯类和黄酮苷类成分的溶出度；具体步骤如下：

1)供试品溶液的制备：取银杏酮酯片，加入甲醇水溶液进行超声提取、离心后取上清液，加入甲醇水溶液定容后再稀释，即得供试品溶液；

步骤1)中，所述银杏酮酯片加入的质量mg与甲醇水溶液加入的体积mL之比为80-120：4-6；

2)对照品溶液的制备：将银杏酮酯片中萜内酯类和黄酮苷类成分的对照品分别加入二甲基亚砜溶解后配成相应的对照品母液，再分别取对照品母液混合后加入甲醇水溶液定容，得到对照品溶液；

3)溶出溶液的制备：取溶出介质，加入银杏酮酯片进行溶出实验后，取样离心后取上清液，再加入溶出介质稀释，即得溶出溶液；

步骤3)中，所述银杏酮酯片加入的质量mg与溶出介质加入的体积mL之比为1440-1560:450-550；

4)检测：采用UPLC-Q-TOF-MS分别测定供试品溶液、对照品溶液及溶出溶液，根据分子质量、保留时间，分别确定供试品溶液和溶出溶液中萜内酯类和黄酮苷类成分，并根据外标法分别确定供试品溶液和溶出溶液中萜内酯类和黄酮苷类成分的含量；

步骤4)中，色谱条件，包括以下条件：

A1)色谱柱为C₁₈色谱柱；

A2)柱温为40-50℃；

A3)流速为0.3-0.5ml/min；

A4)进样量为1-5μL；

A5)流动相为甲酸水-甲醇溶液，其中，A相为甲酸水，B相为甲醇；

A6)洗脱方式为梯度洗脱，分析时间为15min；

所述梯度洗脱程序具体为：

0-10min，A相：B相体积比为98：2-25：75；

10-10.5min，A相：B相体积比为25：75-2：98；

10.5-13min，A相：B相体积比为2：98-2：98；

13-13.5min，A相：B相体积比为2：98-98：2；

13.5-15min，A相：B相体积比为98：2-98：2；

步骤4)中，质谱条件为：扫描模式为负离子条件下Sensitivity模式；扫描时间为14-16min；离子源为ESI源；离子源温度为110-130℃；毛细管电压为2-3kV；脱溶剂气流速为700-900L/h；脱溶剂气温度为300-500℃；锥孔电压为30-40V；萃取电压为3-5V；数据采集模式为MS^E；扫描范围为m/z 40-1500amu；

5)溶出度计算：将供试品溶液与溶出溶液中萜内酯类和黄酮苷类成分的含量，按公式Ⅰ分别计算银杏酮酯片中萜内酯类和黄酮苷类成分的溶出度，所述公式Ⅰ为：溶出度％＝(Ai×V1×m2)/(Bi×V2×m1)×100％；其中，Ai：溶出溶液中各成分的含量，ng/mL；Bi：供试品溶液中各成分的含量，ng/mL；V1：溶出介质体积，mL；V2：供试品溶液体积，mL；m1：溶出溶液中加入银杏酮酯片重量，g；m2：供试品溶液制备时银杏酮酯片重量，g；

所述银杏酮酯片中萜内酯类和黄酮苷类成分包括有银杏内酯B、银杏内酯A、银杏内酯C、白果内酯、芦丁、异槲皮苷、3-O-GLC-异鼠李素、山奈酚-3-O-芸香糖、香蒲新苷；

其特征在于，

A)取银杏酮酯片，根据溶出度的检测方法中步骤3)，于不同溶出时间点进行溶出试验，获得一系列的溶出溶液；

B)将步骤A)获得的一系列的溶出溶液，根据溶出度的检测方法中步骤4)进行测定，获得一系列的溶出溶液中各个萜内酯类和黄酮苷类成分的含量；

C)将步骤B)获得的一系列的溶出溶液中各个萜内酯类和黄酮苷类成分的含量，根据溶出度的检测方法中步骤5)进行计算，获得一系列的溶出溶液中各个萜内酯类和黄酮苷类成分的溶出度；

D)根据溶出度的检测方法中步骤4)获得的供试品溶液中各个萜内酯类和黄酮苷类成分的含量，按公式Ⅱ计算各个萜内酯类和黄酮苷类成分的质量权重系数，所述公式Ⅱ为：ψ＝n/ω，其中，ψ为质量权重系数；ω为成分的总含量，％；n为各成分中任意一个成分的含量，％；

E)将步骤D)获得的供试品溶液中各个萜内酯类和黄酮苷类成分的质量权重系数，与步骤C)获得的一系列的溶出溶液中相应萜内酯类和黄酮苷类成分的溶出度，按公式Ⅲ计算各成分于不同溶出时间点的整合溶出度，所述公式Ⅲ为：

其中，δ为整合溶出度，％；A，B，C…为各成分溶出度，％；ω为成分的总含量，％；i为成分个数，n为各成分的个数集合；abc…为各成分的含量，％。

2.一种银杏酮酯片中萜内酯类和黄酮苷类成分的整合溶出度的验证方法，包括以下步骤：根据权利要求1所述的方法测定银杏酮酯片中萜内酯类和黄酮苷类成分的整合溶出度；其特征在于，

a)根据权利要求1所述的整合溶出度的检测方法中步骤C)，将获得的一系列的溶出溶液中各个萜内酯类和黄酮苷类成分的溶出度为纵坐标，以不同溶出时间点为横坐标，绘制各个萜内酯类和黄酮苷类成分的溶出曲线；

b)根据权利要求1所述的整合溶出度的检测方法中步骤E)，将获得的各成分于不同溶出时间点的整合溶出度为纵坐标，以不同溶出时间点为横坐标，绘制整合溶出曲线；

c)将步骤a)获得的各成分的溶出曲线与步骤b)获得的整合溶出曲线，采用f₂相似因子法，按公式Ⅳ进行相似度判定，所述公式Ⅳ为：

其中，f₂：相似因子；n：时间点的个数；Ri：整合溶出曲线在第i个时间点的溶出度，％；Ti：各成分溶出曲线在第i个时间点的溶出度，％。

3.根据权利要求2所述的一种银杏酮酯片中萜内酯类和黄酮苷类成分的整合溶出度的验证方法，其特征在于，步骤c)中，当f₂≥50，判定成分的溶出曲线与整合溶出曲线相似。

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