CN105259268B - 一种银杏酮酯中黄酮类和有机酸类成分指纹图谱的检测方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种银杏酮酯中黄酮类和有机酸类成分指纹图谱的检测方法，包括以下步骤：1）供试品溶液的制备；2）参照品溶液的制备；3）采用高效液相色谱法分别测定供试品溶液和参照品溶液，将获得的指纹谱图与标准指纹谱图进行比较，从而获得供试品溶液中黄酮类和有机酸类成分的指纹图谱。本发明还进一步提供了该检测方法在银杏酮酯中对黄酮类和有机酸类成分的质量检测以及成分含量测定中的应用。本发明提供的一种银杏酮酯中黄酮类和有机酸类成分指纹图谱的检测方法及其应用，建立了银杏酮酯中黄酮类和有机酸类药味成分的指纹图谱，提高银杏酮酯中黄酮类和有机酸类成分的质控水平，并能进行有效定量分析。
Description
技术领域
本发明属于中药成分分析检测技术领域，涉及一种银杏酮酯中黄酮类和有机酸类成分指纹图谱的检测方法及其应用，具体涉及一种银杏酮酯中黄酮类和有机酸类药味成分指纹图谱的检测方法及其在含量测定中应用。
背景技术
银杏叶为银杏科植物银杏的干燥叶，性甘，苦，涩，平，归心、肺经，《中药志》中记载银杏叶能“敛肺气，平咳喘，止带浊”。银杏酮酯(Ginkgo Biloba Extract，GEB50)是我国自主研发的新一代银杏叶提取物产品，已获得原国家二类新药，并通过了美国临床预审进入IND阶段，主要用于治疗心脑血管疾病及神经系统疾病。其中，现已获得我国国家食品药品监督管理局批准文号的银杏酮酯的制剂共8种(银杏酮酯原料药，银杏酮酯片，银杏酮酯颗粒，银杏酮酯胶囊，银杏酮酯分散片，银杏酮酯滴丸3种)。
我国虽是银杏叶资源大国，但出口产品仅用于食品添加剂或保健品，故质量标准不高。中药质量标准的提高成为中药发展的瓶颈，现代化的质量标准是提高国际竞争力的前提。根据2015版《中国药典》，目前，银杏酮酯的质量标准检测项包括：制法、性状、鉴别、检查(水分、炽灼残渣、重金属、黄酮苷元峰面积比、总银杏酸)、含量测定(总黄酮醇苷、萜类内酯)、贮藏、制剂。但银杏酮酯中仍有大部分尚不清楚的成分，只测定目标成分含量并不能真正反映其质量稳定，故指纹图谱分析、原型黄酮苷类成分的测定日益引起关注。
中药指纹图谱具有整体、宏观、模糊分析等特点，可通过对中药整体特征的描述，采用适当模糊处理方式，达到整体质量控制的目的，因此成为中药质量控制的有效手段。其中色谱指纹图谱分析可以使中药所含多种化学组分的整体特征可视化，从而披露出常规检验难以发现的质量问题。虽然银杏叶提取物的指纹图谱还未被编入《中国药典》，但银杏叶提取物中黄酮苷元本身的含量较低，如人为添加如槲皮素等黄酮苷元，则测得的总黄酮醇苷含量结果明显增高，表面上符合要求，实际影响药品内在质量。为保证生产原料质量稳定；为防止生产过程中掺假、掺杂现象；为保证不同批次原料药一致性，本课题拟将银杏酮酯指纹图谱与多成分含量测定相结合，提高现有质量标准。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种银杏酮酯中黄酮类和有机酸类成分指纹图谱的检测方法及其应用，采用优化条件的高效液相色谱方法首次建立了银杏酮酯中黄酮类和有机酸类成分的指纹图谱，并且同时一次对银杏酮酯中多种成分进行定量分析。本发明中方法通过指纹图谱和多成分含量测定可以比较全面的反映银杏酮酯中黄酮类和有机酸类成分的现状，提高银杏酮酯中黄酮类和有机酸类成分的质控水平。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种银杏酮酯中黄酮类和有机酸类成分指纹图谱的检测方法，包括以下步骤：
1)供试品溶液的制备：称取银杏酮酯，加入甲醇水溶液，涡旋提取后，过滤，取续滤液，即得供试品溶液；
优选地，所述银杏酮酯加入的重量与所述甲醇水溶液加入的体积之比为1：80-120(g/ml)。
更优选地，所述银杏酮酯加入的重量与所述甲醇水溶液加入的体积之比为1：100(g/ml)。
所述银杏酮酯和甲醇水溶液称取时，应当精密称取。
优选地，所述涡旋提取的条件为：提取时间：3-10min；涡旋转速：2500-3000r/min。
更优选地，所述涡旋提取的条件为：提取时间：5min；涡旋转速：2800r/min。
所述涡旋提取是利用涡旋振荡器对样品进行的一种提取方式，通过偏心旋转使试管等容器中的溶剂产生涡流，从而使样品与溶剂充分混合后提取样品中所需成分，该提取方法对于一些难溶解物质也有较好溶解及提取效果。
所述供试品溶液在密闭容器中进行涡旋提取，所述密闭容器为密闭的离心管或试管。
优选地，所述过滤的方式为滤膜过滤方式。更优选地，所述滤膜的孔径为0.45μm。
2)参照品溶液的制备：称取芦丁对照品，加入甲醇水溶液溶解并定容，即得参照品溶液；
优选地，所述参照品溶液中芦丁的CAS号为153-18-4。
优选地，所述参照品溶液中芦丁的浓度为200-300μg/ml。更优选地，所述参照品溶液中芦丁的浓度为250μg/ml。
优选地，步骤1)或步骤2)中，所述甲醇水溶液为10-90v/v％甲醇水溶液。
更优选地，所述甲醇水溶液为10-70v/v％甲醇水溶液。
最优选地，所述甲醇水溶液为60v/v％甲醇水溶液。
3)测定：采用相同色谱条件的高效液相色谱(HPLC)法分别测定供试品溶液和参照品溶液，将获得的供试品溶液和参照品溶液的指纹谱图，与银杏酮酯的标准指纹谱图进行比较，根据相对保留时间，指认出共有特征峰，从而获得供试品溶液中黄酮类和有机酸类成分的指纹图谱。
优选地，所述高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱：C18柱；柱温：30-40℃；检测波长：230-280nm；参比波长：400-500nm；流速：0.5-2.0ml/min；进样量：5-20μl；流动相：乙腈-0.1-0.4v/v％磷酸水溶液，其中，A相为乙腈，B相为0.1-0.4v/v％磷酸水溶液；分析时间：70min；梯度洗脱。
更优选地，所述高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱：Agilent Poroshell 120SB C18柱(150mm×4.6mm，2.7μm)；柱温：35℃；检测波长：254nm；参比波长：450nm；流速：1ml/min；进样量：10μl；流动相：乙腈-0.1v/v％磷酸水溶液，其中，A相为乙腈，B相为0.1v/v％磷酸水溶液；分析时间：70min；梯度洗脱。
最优选地，所述梯度洗脱的具体程序为：
0-10min，A相：B相体积比为12：88-13：87；
10-13min，A相：B相体积比为13：87-15：85；
13-20min，A相：B相体积比为15：85-16：84；
20-30min，A相：B相体积比为16：84-21：79；
30-40min，A相：B相体积比为21：79-23：77；
40-50min，A相：B相体积比为23：77-30：70；
50-70min，A相：B相体积比为30：70-75：25。
所述银杏酮酯的标准指纹谱图是指按照国家食品药品监督管理局2000年8月15日颁布的《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》中的规定，取同一种至少10个批次的银杏酮酯，分别按上述步骤1)和2)制备供试品溶液和参照品溶液，再按上述步骤3)的HPLC条件进行测定后，分别获得指纹图谱，再将指纹图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价软件2.0版》，生成对照图谱，最终确定银杏酮酯的标准指纹谱图。在实际检测时，被检样品与标准指纹图谱进行相似度比较，当相似度≥0.9，即为合格，说明获得被检样品中银杏酮酯的指纹全谱图。
优选地，所述供试品溶液和参照品溶液的指纹谱图与银杏酮酯的标准指纹谱图进行的比较时，采用国家药典委员会发布的《中药色谱指纹图谱相似度评价软件2.0版》进行相似度比较，以参照品溶液的指纹谱图中的芦丁色谱峰(S峰)为参比峰，根据相对保留时间，指认出供试品溶液的指纹谱图中其它共有特征峰。
更优选地，所述中药色谱指纹图谱相似度评价软件的检测条件为：时间窗：0.15；平均值法；多点校正；全谱峰匹配。
优选地，所述供试品溶液中黄酮类和有机酸类成分的指纹图谱中的黄酮类和有机酸类成分，采用电喷雾离子源高分辨串联飞行时间质谱(ESI-Q-TOF-MS)法进行测定验证。
更优选地，所述电喷雾离子源高分辨串联飞行时间质谱(ESI-Q-TOF-MS)法的检测条件为：离子源：ESI源；检测模式：负离子电喷雾电离模式(ESI-)；采集质量范围(Massrange)：50-1200Da；毛细管电压(Capillary Voltage)：2.5kV；锥孔电压(Sampling ConeVoltage)：30V；离子源温度(Soure Temperature)：110-130℃，优选为120℃；去溶剂化温度(Desolvation Temperature)：450-550℃，优选为500℃；去溶剂化气体流量(DesolvationGas Flow)：750-850L/hr，优选为800L/hr；锥孔气体流量(Cone Gas Flow)：45-55L/hr，优选为50L/hr；校正液：甲酸钠、亮氨酸脑啡肽(Leu-enkephaline，LE)；碰撞气体：氩气；低碰撞能量通道：5eV；高碰撞能量通道：25-55eV能量梯度。
更优选地，所述电喷雾离子源高分辨串联飞行时间质谱(ESI-Q-TOF-MS)法，根据供试品溶液中黄酮类和有机酸类成分的指纹图谱中的共有特征峰，通过相对保留时间，确定供试品溶液的指纹谱图中黄酮类和有机酸类成分。
所述电喷雾离子源高分辨串联飞行时间质谱的检测原理为：TOF-MS的质量分析器是一个离子漂移管。样品在离子源中离子化后即被电场加速，由离子源产生的离子加速后进入无场漂移管，并以恒定速度飞向离子接收器。离子以此速度穿过负极板上的栅条，飞向检测器。离子从负极板到达检测器的飞行时间t，就是TOF-MS进行质量分析的判据。
更优选地，所述电喷雾离子源高分辨串联飞行时间质谱(ESI-Q-TOF-MS)法，可与超高效液相色谱(UPLC)相结合，通过超高效液相色谱(UPLC)分别测定供试品溶液和参照品溶液的指纹谱图，将获得的供试品溶液和参照品溶液的指纹谱图，与银杏酮酯的标准指纹谱图进行比较，根据相对保留时间，指认出共有特征峰，从而获得供试品溶液中黄酮类和有机酸类成分的指纹图谱，再采用电喷雾离子源高分辨串联飞行时间质谱(ESI-Q-TOF-MS)法测定供试品溶液中黄酮类和有机酸类成分的指纹图谱中的共有特征峰，通过相对保留时间，确定供试品溶液的指纹谱图中黄酮类和有机酸类成分。
最优选地，所述超高效液相色谱法测定供试品溶液和参照品溶液指纹图谱的色谱条件，与上述高效液相色谱法相同。但是，超高效液相色谱法的色谱条件中，使用的流动相为乙腈-0.1-0.4v/v％甲酸水溶液，优选为乙腈-0.1v/v％甲酸水溶液，其中，A相为乙腈，B相为0.1-0.4v/v％甲酸水溶液，优选为0.1v/v％甲酸水溶液。
由于电喷雾离子源高分辨串联飞行时间质谱仪的仪器价格昂贵且测定使用成本昂贵，并不适用于在实际检测中对多批量样品进行测定，从而进行质控。而高效液相色谱仪作为实际检测中一种常规分析仪器，仪器价格且测定使用成本低，适用于在实际检测中对多批量样品进行测定，从而进行质控。
优选地，所述黄酮类和有机酸类成分的指纹图谱为45种黄酮类和有机酸类成分的指纹图谱。具体来说，所述黄酮类和有机酸类成分的指纹图谱包括45个共有特征峰，具体见图4。
更优选地，所述黄酮类成分包括有黄烷醇类、黄酮醇苷类、黄酮醇类、单黄酮类、双黄酮类。具体成分见下表1、图4。
最优选地，所述黄烷醇类成分共1种。所述黄烷醇类成分为儿茶素。
最优选地，所述黄酮醇苷类成分共31种。所述黄酮醇苷类成分为槲皮素-3-O-(2,6-二鼠李糖基)-葡萄糖苷、杨梅素-3-O-葡萄糖基-(1-2)-鼠李糖苷、杨梅素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-鼠李糖基-(1-6)-葡萄糖苷、山柰素-3-O-(2,6-二鼠李糖基)-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-(6-p-香豆酰基)-(1-2)鼠李糖苷、杨梅苷【或异鼠李素-3-O-(2,6-二鼠李糖基)-葡萄糖苷】、芦丁、异槲皮苷、落叶松黄酮-3-O-鼠李糖基-(1-6)-葡萄糖苷、7-O-葡萄糖基-山柰素-3-O-(6-p-香豆酰基)-(1-2)鼠李糖苷、落叶松黄酮-3-O-葡萄糖苷、杨梅苷(同分异构体)、槲皮素-3-O-葡萄糖基-(1-2)鼠李糖苷、山柰素-3-O-鼠李糖基-(1-6)-葡萄糖苷、紫云英苷【或槲皮素-3-O-鼠李糖苷】、异鼠李素-3-O-葡萄糖基-(1-2)鼠李糖苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、丁香亭-3-O-葡萄糖基-(1-2)鼠李糖苷、山柰素-3-O-葡萄糖基-(1-2)鼠李糖苷、山柰素-7-O-葡萄糖苷、阿福豆苷、山柰素-3-O-(6-p-香豆酰基)-(1-2)鼠李糖苷、异鼠李素-3-O-(6-p-香豆酰基)-(1-2)鼠李糖苷、槲皮素-3-O-(6-p-香豆酰基)-(1-2)鼠李糖苷(同分异构体1)、槲皮素-3-O-(6-p-香豆酰基)-(1-2)鼠李糖苷(同分异构体2)、槲皮素-3-O-(6-p-香豆酰基)-(1-2)鼠李糖苷(同分异构体3)、山柰素-3-O-(6-p-香豆酰基)-(1-2)鼠李糖苷(同分异构体1)、山柰素-3-O-(6-p-香豆酰基)-(1-2)鼠李糖苷(同分异构体2)、山柰素-3-O-(6-p-香豆酰基)-(1-2)鼠李糖苷(同分异构体3)、山柰素-3-O-(6-p-香豆酰基)-(1-2)鼠李糖苷(同分异构体4)。
所述杨梅苷【或异鼠李素-3-O-(2,6-二鼠李糖基)-葡萄糖苷】是指杨梅苷或异鼠李素-3-O-(2,6-二鼠李糖基)-葡萄糖苷中的任意一种。
所述紫云英苷【或槲皮素-3-O-鼠李糖苷】是指紫云英苷或槲皮素-3-O-鼠李糖苷中的任意一种。
最优选地，所述黄酮醇类成分共5种。所述黄酮醇类成分为杨梅素、槲皮素、山柰素、异鼠李素、丁香亭。
最优选地，所述单黄酮类成分共1种。所述单黄酮类成分为芹黄素。
最优选地，所述双黄酮类成分共4种。所述双黄酮类成分为白果素、银杏双黄酮、异银杏双黄酮、榧黄素。
更优选地，所述银杏酮酯中有机酸类成分共3种。所述银杏酮酯中有机酸类成分为原儿茶酸、对羟基苯甲酸、香草酸(或咖啡酸)。具体成分见下表1、图4。
所述香草酸(或咖啡酸)是指香草酸或咖啡酸中的任意一种。
表1银杏酮酯中黄酮类和有机酸类成分
本发明第二方面提供一种银杏酮酯中黄酮类和有机酸类成分指纹图谱的检测方法，在银杏酮酯中黄酮类和有机酸类成分的质量检测中的应用。
本发明的银杏酮酯中黄酮类和有机酸类成分的质量检测方法，包括采用银杏酮酯中黄酮类和有机酸类成分指纹图谱的检测方法，得到银杏酮酯中黄酮类和有机酸类成分指纹图谱，再采用与银杏酮酯中黄酮类和有机酸类成分指纹图谱的检测方法相同的条件得到银杏酮酯中黄酮类和有机酸类成分的标准指纹图谱，将得到的银杏酮酯中黄酮类和有机酸类成分指纹图谱与银杏酮酯中黄酮类和有机酸类成分的标准指纹图谱进行相似度比较。
本发明第三方面提供一种银杏酮酯中黄酮类和有机酸类成分指纹图谱的检测方法在银杏酮酯中黄酮类和有机酸类成分含量测定中的应用。
本发明第四方面提供一种银杏酮酯中黄酮类和/或有机酸类成分含量的测定方法，包括以下步骤：
A)供试品溶液的制备：与银杏酮酯中黄酮类和有机酸类成分指纹图谱的检测方法的步骤1)相同；
B)对照品溶液的制备：称取待测的黄酮类和/或有机酸类成分对照品中的一种或多种对照品，加入甲醇水溶液溶解并定容，即得单一对照品溶液或者混合对照品溶液；
优选地，单一对照品溶液为如表1所示的45种黄酮类和/或有机酸类成分对照品中任意一种成分的对照品溶液。
更优选地，所述单一对照品溶液为芦丁的单一对照品溶液、槲皮素的单一对照品溶液、山奈素的单一对照品溶液、异鼠李素的单一对照品溶液；所述芦丁的单一对照品溶液中芦丁的浓度为3.91-1000μg/mL；所述槲皮素的单一对照品溶液中槲皮素的浓度为0.63-80μg/mL；所述山奈素的单一对照品溶液中山奈素的浓度为0.39-50μg/mL；所述异鼠李素的单一对照品溶液中异鼠李素的浓度为0.23-15μg/mL。
优选地，所述混合对照品溶液为如表1所示的45种黄酮类和/或有机酸类成分对照品中任意至少两种成分的对照品溶液。
更优选地，所述混合对照品溶液为芦丁、槲皮素、山奈素、异鼠李素中任意两种以上的混合对照品溶液，其中，芦丁的浓度为3.91-1000μg/mL、槲皮素的浓度为0.63-80μg/mL、山奈素的浓度为0.39-50μg/mL、异鼠李素的浓度为0.23-15μg/mL。
所述混合对照品溶液配制是，先称取芦丁、槲皮素、山奈素对照品中的任意一种或多种，加入甲醇水溶液溶解并定容，获得第一混合母液；再称取异鼠李素对照品，加入甲醇水溶液溶解并定容，获得第二混合母液；再将第一混合母液与第二混合母液等量混合，获得混合对照品母液，用甲醇水溶液稀释后，即得混合对照品溶液。所述第一混合母液中，所述芦丁的浓度为2000μg/mL、槲皮素的浓度为160μg/mL、山奈素的浓度为100μg/mL。所述第二混合母液中，所述异鼠李素的浓度为30μg/mL。
更优选地，所述芦丁的CAS号为153-18-4；所述槲皮素的CAS号为117-39-5；所述山奈素的CAS号为491-54-3；所述异鼠李素的CAS号为480-19-3。
优选地，所述甲醇水溶液为10-90v/v％甲醇水溶液。更优选地，所述甲醇水溶液为60v/v％甲醇水溶液。
C)测定：采用高效液相色谱(HPLC)分别测定步骤A)中的供试品溶液和步骤B)中
的对照品溶液，并采用外标法计算供试品溶液中黄酮类和/或有机酸类成分的含量。
优选地，所述高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱：C18柱；柱温：30-40℃；检测波长：230-280nm；流速：0.5-2.0ml/min；进样量：5-20μl；流动相：乙腈-0.1-0.4v/v％磷酸水溶液，其中，A相为乙腈，B相为0.1-0.4v/v％磷酸水溶液；分析时间：70min；梯度洗脱。
更优选地，所述高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱：Agilent Poroshell 120SB C18柱(150mm×4.6mm，2.7μm)；柱温：35℃；检测波长：254nm；流速：1ml/min；进样量：10μl；流动相：乙腈-0.1v/v％磷酸水溶液，其中，A相为乙腈，B相为0.1v/v％磷酸水溶液；分析时间：70min；梯度洗脱。
最优选地，所述梯度洗脱的具体程序为：
0-10min，A相：B相体积比为12：88-13：87；
10-13min，A相：B相体积比为13：87-15：85；
13-20min，A相：B相体积比为15：85-16：84；
20-30min，A相：B相体积比为16：84-21：79；
30-40min，A相：B相体积比为21：79-23：77；
40-50min，A相：B相体积比为23：77-30：70；
50-70min，A相：B相体积比为30：70-75：25。
所述外标法是指：分别移取一定体积的步骤B)所述单一或者混合对照品溶液，配成一定浓度的单一或者混合对照品标准溶液，采用高效液相色谱仪进样分析，获得单一或者混合对照品标准溶液中黄酮类和/或有机酸类成分含量与峰面积的线性关系，以每一种黄酮类和/或有机酸类成分色谱峰面积对应其相应的含量，绘制相应的标准工作曲线，计算得到各标准工作曲线的回归方程。再将步骤A)所述供试品溶液采用高效液相色谱仪检测，将获得的供试品溶液中银杏酮酯中黄酮类和有机酸类成分的色谱峰面积，分别代入所述各标准工作曲线的回归方程中，可得到相应银杏酮酯中黄酮类和有机酸类成分的含量。
本发明中的用水均为纯净水。
如上所述，本发明的一种银杏酮酯中黄酮类和有机酸类成分指纹图谱的检测方法及其应用，采用优化反应条件的高效液相方法建立了银杏酮酯中黄酮类和有机酸类药味成分的指纹图谱，同时此方法又可以对银杏酮酯中黄酮类和/或有机酸类药味成分进行定量分析。其中，本发明采用流动相：乙腈-0.1-0.4v/v％磷酸水溶液系统，特别优选为乙腈-0.1v/v％磷酸水溶液系统，这种流动相系统在优化的梯度洗脱条件下能使被分离化合物保持较好的分离度和峰形，其分离度达1.5，且理论塔板数应不低于10000。同时，本发明通过对银杏酮酯中4种指标药味成分的定量分析，定量分析结果中4种指标药味成分的回归方程的相关系数r均不小于0.9999，线性关系良好。并能保持供试品溶液在24h内稳定，精密度、稳定性和重复性试验的峰面积和保留时间RSD值均小于3％，精密度、稳定性、重复性良好。并且，加样回收率均在90～110％之间，加样回收率良好。因此，本发明中方法测定加样回收率良好中各指标药味成分结果可靠，样品测定方法简便易行，可作为银杏酮酯中黄酮类和有机酸类药味成分的质控方法，实现对银杏酮酯中多成分的定量分析，提高银杏酮酯中黄酮类和有机酸类药味成分的质控水平。
附图说明
图1显示为本发明的银杏酮酯中黄酮类和有机酸类成分的包含供试品和参照品的液相色谱图，其中，S峰(参比峰)：芦丁峰。
图2显示为本发明的银杏酮酯中黄酮类和有机酸类成分在不同液相梯度洗脱条件下的液相色谱图。
图3显示为本发明的银杏酮酯中黄酮类和有机酸类成分在不同浓度的磷酸水溶液选择下的液相色谱图，其中，1：0.1％磷酸水溶液，2：0.2％磷酸水溶液，3：0.3％磷酸水溶液，4：0.4％磷酸水溶液。
图4显示为本发明的银杏酮酯中45种黄酮类和有机酸类成分的液相色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
以下实施例使用的试剂和仪器如下：
1、试剂
乙腈(色谱纯，Merck公司)；甲醇、磷酸(分析纯，国药集团化学试剂有限责任公司)；水(纯净水)；芦丁(纯度为90.5％，中国药品生物制品检定所)、槲皮素(纯度为99.1％，中国药品生物制品检定所)、山奈素(纯度为93.2％，中国药品生物制品检定所)、异鼠李素(纯度为99.0％，中国药品生物制品检定所)；
银杏酮酯，由上海杏灵科技药业股份有限公司提供，共18批银杏酮酯，批号见下表2。
表2银杏酮酯批号
| 编号 | 批号 | 编号 | 批号 | 编号 | 批号 |
| 1 | 120902 | 7 | 130105 | 13 | 141101 |
| 2 | 121101 | 8 | 140701 | 14 | 141102 |
| 3 | 121102 | 9 | 140702 | 15 | 141103 |
| 4 | 121201 | 10 | 140703 | 16 | 141104 |
| 5 | 130103 | 11 | 140704 | 17 | 150603 |
| 6 | 130104 | 12 | 140903 | 18 | 150604 |
2、仪器
Agilent 1260型高效液相色谱仪，配备二极管阵列检测器(美国Agilent公司)；BS110S型电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；Sartorius BP 211D型电子天平(Sartorius，Germany)；VORTEX1型涡旋混合器(IKA，Germany)；微量移液器(Eppendorf，Germany)；DC-200H型超声波清洗仪(DELTA，中国台湾)；SHA-C型水浴恒温振荡器(江苏金坛市环宇科学仪器厂)；Acquity型高效液相色谱仪(美国Waters公司)、Xevo G2-XS型电喷雾离子源高分辨串联飞行时间质谱仪(美国Waters公司)；Agilent Poroshell 120 SB C18柱(美国Agilent公司)
实施例1
1、实验部分
1.1样品前处理
供试品溶液的制备：精密称取银杏酮酯100mg，置于15ml离心管中，精密加入10-90％甲醇水溶液优选为60％甲醇水溶液，使料液比为1：80-120(g/ml)，优选精密加入60％甲醇10ml(使料液比为1：100(g/ml))，密闭后在转速为2500-3000r/min优选为2800r/min下，涡旋提取3-10min优选为5min，用孔径为0.45μm的滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液。
参照品溶液的制备：精密称取芦丁对照品适量，精密加入10-90％甲醇水溶液优选为60％甲醇水溶液溶解并定容，配成已知浓度200-300μg/ml的参照品溶液，参照品溶液中芦丁的浓度优选为250μg/ml。
对照品溶液的制备：分别精密称取如表1所示的45种黄酮类和/或有机酸类成分对照品中的任意一种或多种对照品，优选芦丁、槲皮素、山奈素、异鼠李素对照品中的一种或多种对照品，精密加入10-90％甲醇水溶液优选为60％甲醇水溶液溶解并定容，即得单一对照品溶液或者混合对照品溶液。
其中，配制单一对照品溶液，分别精密称取芦丁、槲皮素、山奈素、异鼠李素对照品中任意一种适量，精密加入10-90％甲醇水溶液优选为60％甲醇水溶液溶解并定容。芦丁的单一对照品溶液中芦丁的浓度为3.91-1000μg/mL；槲皮素的单一对照品溶液中槲皮素的浓度为0.63-80μg/mL；山奈素的单一对照品溶液中山奈素的浓度为0.39-50μg/mL；异鼠李素的单一对照品溶液中异鼠李素的浓度为0.23-15μg/mL。
其中，配制混合对照品溶液，混合对照品溶液为芦丁、槲皮素、山奈素、异鼠李素中任意两种以上的混合对照品溶液，其中，芦丁的浓度为3.91-1000μg/mL、槲皮素的浓度为0.63-80μg/mL、山奈素的浓度为0.39-50μg/mL、异鼠李素的浓度为0.23-15μg/mL。
具体配制时，分别精密称取芦丁、槲皮素、山奈素对照品中的任意一种或多种适量，精密加入10-90％甲醇水溶液优选为60％甲醇水溶液溶解并定容，获得第一混合母液；再精密称取异鼠李素对照品，精密加入10-90％甲醇水溶液优选为60％甲醇水溶液溶解并定容，获得第二混合母液；再将第一混合母液与第二混合母液等量混合，获得混合对照品母液，用10-90％甲醇水溶液优选为60％甲醇水溶液对倍稀释后，即得混合对照品溶液。第一混合母液中，芦丁的浓度为2000μg/mL、槲皮素的浓度为160μg/mL、山奈素的浓度为100μg/mL。第二混合母液中，异鼠李素的浓度为30μg/mL。
1.2色谱条件
高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱：C18柱；柱温：30-40℃；检测波长：230-280nm；参比波长：400-500nm；流速：0.5-2.0ml/min；进样量：5-20μl；流动相：乙腈-0.1-0.4v/v％磷酸水溶液，其中，A相为乙腈，B相为0.1-0.4v/v％磷酸水溶液；分析时间：70min；梯度洗脱。
高效液相色谱法的优选色谱条件为：色谱柱：Agilent Poroshell 120 SB C18柱(150mm×4.6mm，2.7μm)；柱温：35℃；检测波长：254nm；参比波长：450nm；流速：1ml/min；进样量：10μl；流动相：乙腈-0.1v/v％磷酸水溶液，其中，A相为乙腈，B相为0.1v/v％磷酸水溶液；分析时间：70min；梯度洗脱。
梯度洗脱的具体程序为：
0-10min，A相：B相体积比为12：88-13：87；
10-13min，A相：B相体积比为13：87-15：85；
13-20min，A相：B相体积比为15：85-16：84；
20-30min，A相：B相体积比为16：84-21：79；
30-40min，A相：B相体积比为21：79-23：77；
40-50min，A相：B相体积比为23：77-30：70；
50-70min，A相：B相体积比为30：70-75：25。
1.3指纹图谱的测定
采用上述1.2中色谱条件的高效液相色谱法分别测定上述1.1中制备获得供试品溶液和参照品溶液，获得的供试品溶液和参照品溶液的指纹谱图，与银杏酮酯的标准指纹谱图进行比较，根据相对保留时间，指认出共有特征峰，从而获得供试品溶液中黄酮类和有机酸类成分的指纹图谱。
其中，供试品溶液和参照品溶液的指纹谱图与银杏酮酯的标准指纹谱图进行的比较时，采用国家药典委员会发布的《中药色谱指纹图谱相似度评价软件2.0版》进行相似度比较，以参照品溶液的指纹谱图中的芦丁色谱峰(S峰)为参比峰，根据相对保留时间，指认出供试品溶液的指纹谱图中其它共有特征峰。
中药色谱指纹图谱相似度评价软件的检测条件为：时间窗：0.15；平均值法；多点校正；全谱峰匹配。
供试品溶液中黄酮类和有机酸类成分的指纹图谱中的黄酮类和有机酸类成分，采用电喷雾离子源高分辨串联飞行时间质谱法进行测定验证，通过相对保留时间，确定供试品溶液的指纹谱图中黄酮类和有机酸类成分。测定获得的黄酮类和有机酸类成分共有45种成分，具体成分见表1、图4。
电喷雾离子源高分辨串联飞行时间质谱法的检测条件为：离子源：ESI源；检测模式：负离子电喷雾电离模式(ESI-)；采集质量范围(Mass range)：50-1200Da；毛细管电压(Capillary Voltage)：2.5kV；锥孔电压(Sampling Cone Voltage)：30V；离子源温度(Soure Temperature)：120℃；去溶剂化温度(Desolvation Temperature)：500℃；去溶剂化气体流量(Desolvation Gas Flow)：800L/hr；锥孔气体流量(Cone Gas Flow)：50L/hr；校正液：甲酸钠、亮氨酸脑啡肽(Leu-enkephaline，LE)；碰撞气体：氩气；低碰撞能量通道：5eV；高碰撞能量通道：25-55eV能量梯度。
1.4黄酮类和有机酸类成分含量的测定
采用上述1.2中色谱条件的高效液相色谱分别测定上述1.1中制备获得中的供试品溶液和对照品溶液，其中，根据采用1.1中制备的对照品溶液中黄酮类和/或有机酸类成分，采用外标法计算供试品溶液中相应黄酮类和/或有机酸类成分的含量。
2、检测条件的优化
2.1梯度洗脱程序的选择
在采用高效液相色谱进行测定时，分别考察了4种梯度洗脱程序，其具体程序见表3，采用4种梯度洗脱程序进行测定后，获得的指纹图谱见图2。由图2可知，在兼顾色谱峰分离度及分析时间情况下，第4种梯度洗脱程序最佳。
表3梯度洗脱程序的比较
2.2液相色谱条件中流动相的选择
在采用高效液相色谱进行测定时，分别考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-甲酸、乙腈-乙酸、乙腈-磷酸体系，发现各体系中，乙腈-磷酸体系峰型拖尾现象减弱，可见乙腈-磷酸体系作为流动相最佳。同时，考察磷酸含量分别为0.1％、0.2％、0.3％、0.4％水溶液，结果见图3。由图3可知，随磷酸含量增加图谱未有明显变化，考虑基线平稳度和峰型，选择乙腈-0.1％磷酸水作为流动相最为适宜。
2.3提取方法的选择
在制备供试品溶液时，分别考察了涡旋提取、超声提取、振荡提取、冷浸提取、回流提取。各种提取方法的提取条件考察指标均为：得分＝0.2×色谱峰个数+0.8×(芦丁、槲皮素、山柰素、异鼠李素总含量)。经考察后发现，各种提取方法中，涡旋提取的提取效果最充分。
2.4提取溶剂的选择
在制备供试品溶液时，进行涡旋提取时采用的提取溶剂，分别考察了甲醇、乙醇、水、乙腈-水(12％乙腈-88％水)，发现甲醇作为提取溶剂最为适合。再通过考察10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％甲醇水溶液，发现60％甲醇提取最为适合。
实施例2
1、实验部分
1.1样品前处理
供试品溶液的制备：精密称取银杏酮酯100mg，置于15ml离心管中，精密加入60％甲醇10ml(使料液比为1：100(g/ml))，密闭后在转速为2800r/min下，涡旋提取5min，用孔径为0.45μm的滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液。
参照品溶液的制备：精密称取芦丁对照品适量，精密加入60％甲醇水溶液溶解并定容，配成已知浓度的参照品溶液，参照品溶液中芦丁的浓度优选为250μg/ml。
1.2色谱条件
高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱：Agilent Poroshell 120 SB C18柱(150mm×4.6mm，2.7μm)；柱温：35℃；检测波长：254nm；参比波长：450nm；流速：1ml/min；进样量：10μl；流动相：乙腈-0.1v/v％磷酸水溶液，其中，A相为乙腈，B相为0.1v/v％磷酸水溶液；分析时间：70min；梯度洗脱。
梯度洗脱的具体程序为：
0-10min，A相：B相体积比为12：88-13：87；
10-13min，A相：B相体积比为13：87-15：85；
13-20min，A相：B相体积比为15：85-16：84；
20-30min，A相：B相体积比为16：84-21：79；
30-40min，A相：B相体积比为21：79-23：77；
40-50min，A相：B相体积比为23：77-30：70；
50-70min，A相：B相体积比为30：70-75：25。
1.3指纹图谱的测定
采用上述1.2中色谱条件的高效液相色谱法分别测定上述1.1中制备获得供试品溶液和参照品溶液，获得的供试品溶液和参照品溶液的指纹谱图，与银杏酮酯的标准指纹谱图进行比较，根据相对保留时间，指认出共有特征峰，从而获得供试品溶液中黄酮类和有机酸类成分的指纹图谱。
其中，供试品溶液和参照品溶液的指纹谱图与银杏酮酯的标准指纹谱图进行的比较时，采用国家药典委员会发布的《中药色谱指纹图谱相似度评价软件2.0版》进行相似度比较，以参照品溶液的指纹谱图中的芦丁色谱峰(S峰)为参比峰，根据相对保留时间，指认出供试品溶液的指纹谱图中其它共有特征峰。
中药色谱指纹图谱相似度评价软件的检测条件为：积分参数：斜率灵敏度5，峰宽0.02，最小峰面积50，最小峰高10；时间窗：0.15；平均值法；多点校正；全谱峰匹配。
供试品溶液中黄酮类和有机酸类成分的指纹图谱中的黄酮类和有机酸类成分，采用电喷雾离子源高分辨串联飞行时间质谱法进行测定，通过精确分子质量、相对保留时间，确定供试品溶液的指纹谱图中黄酮类和有机酸类成分。黄酮类和有机酸类成分共有45种成分，具体成分见表1、图4。
电喷雾离子源高分辨串联飞行时间质谱法的检测条件为：离子源：ESI源；检测模式：负离子电喷雾电离模式(ESI-)；采集质量范围(Mass range)：50-1200Da；毛细管电压(Capillary Voltage)：2.5kV；锥孔电压(Sampling Cone Voltage)：30V；离子源温度(Soure Temperature)：120℃；去溶剂化温度(Desolvation Temperature)：500℃；去溶剂化气体流量(Desolvation Gas Flow)：800L/hr；锥孔气体流量(Cone Gas Flow)：50L/hr；校正液：甲酸钠、亮氨酸脑啡肽(Leu-enkephaline，LE)；碰撞气体：氩气；低碰撞能量通道：5eV；高碰撞能量通道：25-55eV能量梯度。
2、结果与讨论
2.1参比峰的选择
如上述1.1中规定，以芦丁作为参照品，对照图谱见图1。由图1可知，由于芦丁作为银杏叶中重要黄酮成分，含量较高、峰分离度良好且易于得到对照品，故选择芦丁峰作为参比峰(S峰)。
2.2精密度试验
取批号130103银杏酮酯，按1.1制备获得供试品溶液，再采用1.2的液相色谱条件重复进样6次，检测指纹图谱，各共有峰的相对保留时间RSD<3％，共有峰面积RSD<3％，表明仪器精密度良好。
2.3重现性试验
取批号130103银杏酮酯5份，分别按1.1制备获得供试品溶液，再采用1.2的液相色谱条件进样，检测指纹图谱，各共有峰的相对保留时间RSD<3％，共有峰面积RSD<3％，表明方法重现性良好。
2.4稳定性试验
取批号130103银杏酮酯，按1.1制备获得供试品溶液，按1.2项下液相色谱条件，分别在0、2、4、6、8、12、24h进样，检测指纹图谱，各共有峰的相对保留时间RSD<3％，共有峰面积RSD<3％，表明供试品24h内稳定。
2.5银杏酮酯中黄酮类和有机酸类成分的指纹图谱
采用上述1.1的前处理方法和上述1.2的HPLC检测条件，我们建立了银杏酮酯中黄酮类和有机酸类成分的指纹图谱，银杏酮酯中45种黄酮类和有机酸类成分的指纹图见图4，各成分的保留时间见表1。
实施例3
1、实验部分
1.1样品前处理
供试品溶液的制备：精密称取银杏酮酯100mg，置于15ml离心管中，精密加入60％甲醇10ml(使料液比为1：100(g/ml))，密闭后在转速为2800r/min下，涡旋提取5min，用孔径为0.45μm的滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液。
对照品溶液的制备：分别精密称取芦丁、槲皮素、山奈素、异鼠李素对照品，精密加入60％甲醇水溶液溶解并定容，获得第一混合母液；再精密称取异鼠李素对照品，精密加入60％甲醇水溶液溶解并定容，获得第二混合母液；再将第一混合母液与第二混合母液等量混合，获得混合对照品母液，用60％甲醇水溶液对倍稀释后，即得混合对照品溶液。其中，第一混合母液中，芦丁的浓度为2000μg/mL、槲皮素的浓度为160μg/mL、山奈素的浓度为100μg/mL。第二混合母液中，异鼠李素的浓度为30μg/mL。混合对照品溶液中，芦丁的浓度为3.91-1000μg/mL、槲皮素的浓度为0.63-80μg/mL、山奈素的浓度为0.39-50μg/mL、异鼠李素的浓度为0.23-15μg/mL。
1.2色谱条件
高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱：Agilent Poroshell 120 SB C18柱(150mm×4.6mm，2.7μm)；柱温：35℃；检测波长：254nm；流速：1ml/min；进样量：10μl；流动相：乙腈-0.1v/v％磷酸水溶液，其中，A相为乙腈，B相为0.1v/v％磷酸水溶液；分析时间：70min；梯度洗脱。
梯度洗脱的具体程序为：
0-10min，A相：B相体积比为12：88-13：87；
10-13min，A相：B相体积比为13：87-15：85；
13-20min，A相：B相体积比为15：85-16：84；
20-30min，A相：B相体积比为16：84-21：79；
30-40min，A相：B相体积比为21：79-23：77；
40-50min，A相：B相体积比为23：77-30：70；
50-70min，A相：B相体积比为30：70-75：25。
1.3含量的测定
采用上述1.2中色谱条件的高效液相色谱分别测定上述1.1中制备获得中的供试品溶液和对照品溶液，其中，根据1.1中制备的对照品溶液中黄酮类和/或有机酸类成分，采用外标法计算供试品溶液中相应黄酮类和/或有机酸类成分的含量，具体采用外标法计算供试品溶液中芦丁、槲皮素、山奈素、异鼠李素的含量。
2、结果与讨论
2.1系统适应性
分别根据上述1.1制备获得中的供试品溶液和对照品溶液，采用上述1.2中液相色谱条件进样，采集指纹图谱，对供试品指纹图谱中各对照品对应色谱峰进行归属，并计算理论塔板数、分离度。结果表明，各供试品指纹图谱中对照品对应的色谱峰理论塔板数均不低于10000、分离度均不小于1.5，表明该含量测定方法的系统适应性良好。
2.2银杏酮酯中黄酮类和/或有机酸类成分含量的测定方法的线性关系
精密称取芦丁、槲皮素、山奈素、异鼠李素对照品适量，根据上述1.1制备混合对照品溶液，采用上述1.2的HPLC检测条件，进行高效液相色谱仪分析，测定并计算获得4种成分的标准回归方程、相关系数和线性范围。具体结果见表4。
表4线性回归方程
| 化合物 | 回归方程 | r | 线性范围(μg/ml) |
| 芦丁 | y＝17.937x+29.656 | 0.9999 | 3.91-1000 |
| 槲皮素 | y＝39.311x-1.3276 | 0.9999 | 0.63-80 |
| 山柰素 | y＝29.036x+3.3365 | 0.9999 | 0.39-50 |
| 异鼠李素 | y＝37.39x-1.9782 | 0.9999 | 0.23-15 |
注：y为峰面积，x为浓度(μg/ml)
根据表4可知，标准回归方程以色谱峰面积为纵坐标(y)，成分浓度为横坐标(x)，同时，4种成分在一定浓度的线性范围内均呈良好的线性关系，其标准回归方程的相关系数均不小于0.9999。
2.3精密度试验
精密称取芦丁、槲皮素、山奈素、异鼠李素对照品适量，根据上述1.1制备混合对照品溶液，混合对照品溶液中芦丁的浓度为125μg/mL、槲皮素的浓度为20μg/mL、山奈素的浓度为12.5μg/mL、异鼠李素的浓度为7.5μg/mL。采用在上述1.2确认的HPLC条件下连续进样分析6次，测定并计算芦丁、槲皮素、山奈素、异鼠李素的相对峰面积精密度，具体结果见表5。由表5可知，4种成分的相对峰面积RSD均小于3％，表明该方法的仪器精密度良好。
表5 4种成分含量测定的精密度考察结果(相对峰面积)
2.4稳定性试验
精密称取芦丁、槲皮素、山奈素、异鼠李素对照品适量，根据上述1.1制备混合对照品溶液，混合对照品溶液中芦丁的浓度为125μg/mL、槲皮素的浓度为20μg/mL、山奈素的浓度为12.5μg/mL、异鼠李素的浓度为7.5μg/mL。再按1.2项下液相色谱条件，分别在0、2、4、6、8、10、12、24h进样检测，测定并计算芦丁、槲皮素、山奈素、异鼠李素的相对峰面积稳定性，具体结果见表6。由表6可知，4种成分的相对峰面积RSD均小于3％，表明供试品在24h内稳定。
表6 4种成分含量测定的稳定性考察结果(相对峰面积)
2.5重复性试验
精密称取批号130103银杏酮酯6份，分别按1.1制备获得供试品溶液，再采用1.2的液相色谱条件进样，检测供试品溶液中芦丁、槲皮素、山奈素、异鼠李素的含量，测定并计算芦丁、槲皮素、山奈素、异鼠李素的相对峰面积重复性，具体结果见表7。由表7可知，4种成分的相对峰面积RSD分别为0.23％、0.57％、2.15％、1.61％，相对峰面积RSD均小于3％，表明本方法重复性良好。
表7 4种成分含量测定的重复性考察结果(相对峰面积)
2.6加样回收率
精密称取130103银杏酮酯适量，分别精密加入一定含量的4种对照品溶液，具体按照样品含量的0.8、1、1.2倍加入，即加入量分别为样品含有量的80％、100％、120％，各平行三份，并按1.1进行前处理，依1.2的液相色谱条件进样测定，具体结果见表8。由表8可知，测得3个浓度加样平均回收率在90-110％之间，表明本方法加样回收率良好。
表8加样回收率结果
2.7实际样品的测定
精密称取批号为141104、151604银杏酮酯样品，按上述1.1和1.2的条件处理并测定，具体结果见表9。由表9可知，采用本发明中的方法可以对银杏酮酯中黄酮类和/或有机酸类成分含量进行有效检测，例如对黄酮类成分中芦丁、槲皮素、山奈素、异鼠李素含量的检测结果如下。
表9银杏酮酯样品的黄酮类和有机酸类成分中4种成分含量
实施例4
1、实验部分
1.1样品前处理
供试品溶液的制备：精密称取银杏酮酯100mg，置于15ml离心管中，精密加入60％甲醇10ml(使料液比为1：100(g/ml))，密闭后在转速为2800r/min下，涡旋提取5min，用孔径为0.45μm的滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液。
参照品溶液的制备：精密称取芦丁对照品适量，精密加入60％甲醇水溶液溶解并定容，配成已知浓度的参照品溶液，参照品溶液中芦丁的浓度优选为250μg/ml。
1.2色谱条件
高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱：Agilent Poroshell 120 SB C18柱(150mm×4.6mm，2.7μm)；柱温：35℃；检测波长：254nm；参比波长：450nm；流速：1ml/min；进样量：10μl；流动相：乙腈-0.1v/v％磷酸水溶液，其中，A相为乙腈，B相为0.1v/v％磷酸水溶液；分析时间：70min；梯度洗脱。
梯度洗脱的具体程序为：
0-10min，A相：B相体积比为12：88-13：87；
10-13min，A相：B相体积比为13：87-15：85；
13-20min，A相：B相体积比为15：85-16：84；
20-30min，A相：B相体积比为16：84-21：79；
30-40min，A相：B相体积比为21：79-23：77；
40-50min，A相：B相体积比为23：77-30：70；
50-70min，A相：B相体积比为30：70-75：25。
2、质量检测
采用上述1.2中色谱条件的高效液相色谱法分别测定上述1.1中制备获得供试品溶液和参照品溶液，获得的供试品溶液和参照品溶液的指纹谱图，与银杏酮酯的标准指纹谱图进行比较，根据相对保留时间，指认出共有特征峰，从而获得供试品溶液中黄酮类和有机酸类成分的指纹图谱。
再采用与上述供试品溶液中黄酮类和有机酸类成分的指纹图谱相同的检测条件，分别检测10批银杏酮酯，银杏酮酯的批号见表10，从而获得银杏酮酯中黄酮类和有机酸类成分的标准指纹图谱，再将得到的银杏酮酯中黄酮类和有机酸类成分指纹图谱与银杏酮酯中黄酮类和有机酸类成分的标准指纹图谱进行相似度比较。从而对任意银杏酮酯样品中的黄酮类和有机酸类成分能够进行有效的质量控制。
相似度比较采用国家药典委员会发布的《中药色谱指纹图谱相似度评价软件2.0版》进行。中药色谱指纹图谱相似度评价软件的检测条件为：积分参数：斜率灵敏度5，峰宽0.02，最小峰面积50，最小峰高10；时间窗：0.15；平均值法；多点校正；全谱峰匹配。
表10质量检测中的银杏酮酯批号
| 编号 | 批号 | 编号 | 批号 | 编号 | 批号 |
| 1 | 120902 | 7 | 130105 | 13 | 141101 |
| 2 | 121101 | 8 | 140701 | 14 | 141102 |
| 3 | 121102 | 9 | 140702 | 15 | 141103 |
| 4 | 121201 | 10 | 140703 | / | / |
所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (9)
1.一种银杏酮酯中黄酮类和有机酸类成分指纹图谱的检测方法，包括以下步骤：
1)供试品溶液的制备：称取银杏酮酯，加入甲醇水溶液，涡旋提取后，过滤，取续滤液，即得供试品溶液；
2)参照品溶液的制备：称取芦丁对照品，加入甲醇水溶液溶解并定容，即得参照品溶液；
3)测定：采用相同色谱条件的高效液相色谱法分别测定供试品溶液和参照品溶液，将获得的供试品溶液和参照品溶液的指纹谱图，与银杏酮酯的标准指纹谱图进行比较，根据相对保留时间，指认出共有特征峰，从而获得供试品溶液中黄酮类和有机酸类成分的指纹图谱；
所述步骤3)中，所述高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱：C18柱；柱温：30-40℃；
检测波长：230-280nm；参比波长：400-500nm；流速：0.5-2.0ml/min；进样量：5-20μl；
流动相：乙腈-0.1-0.4％磷酸水溶液，其中，A相为乙腈，B相为0.1-0.4％磷酸水溶液；分析时间：70min；梯度洗脱；
所述梯度洗脱的具体程序为：0-10min，A相：B相体积比为12：88-13：87；10-13min，A相：B相体积比为13：87-15：85；13-20min，A相：B相体积比为15：85-16：84；20-30min，A相：B相体积比为16：84-21：79；30-40min，A相：B相体积比为21：79-23：77；40-50min，A相：B相体积比为23：77-30：70；50-70min，A相：B相体积比为30：70-75：25；
所述黄酮类和有机酸类成分的指纹图谱为45种黄酮类和有机酸类成分的指纹图谱；
所述黄酮类成分包括有黄烷醇类、黄酮醇苷类、黄酮醇类、单黄酮类、双黄酮类；
所述黄烷醇类成分共1种；所述黄烷醇类成分为儿茶素；
所述黄酮醇苷类成分共31种；所述黄酮醇苷类成分为槲皮素-3-O-(2,6-二鼠李糖基)-葡萄糖苷、杨梅素-3-O-葡萄糖基-(1-2)-鼠李糖苷、杨梅素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-鼠李糖基-(1-6)-葡萄糖苷、山柰素-3-O-(2,6-二鼠李糖基)-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-(6-p-香豆酰基)-(1-2)鼠李糖苷、杨梅苷或异鼠李素-3-O-(2,6-二鼠李糖基)-葡萄糖苷中的任意一种、芦丁、异槲皮苷、落叶松黄酮-3-O-鼠李糖基-(1-6)-葡萄糖苷、7-O-葡萄糖基-山柰素-3-O-(6-p-香豆酰基)-(1-2)鼠李糖苷、落叶松黄酮-3-O-葡萄糖苷、杨梅苷-同分异构体、槲皮素-3-O-葡萄糖基-(1-2)鼠李糖苷、山柰素-3-O-鼠李糖基-(1-6)-葡萄糖苷、紫云英苷或槲皮素-3-O-鼠李糖苷中的任意一种、异鼠李素-3-O-葡萄糖基-(1-2)鼠李糖苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、丁香亭-3-O-葡萄糖基-(1-2)鼠李糖苷、山柰素-3-O-葡萄糖基-(1-2)鼠李糖苷、山柰素-7-O-葡萄糖苷、阿福豆苷、山柰素-3-O-(6-p-香豆酰基)-(1-2)鼠李糖苷、异鼠李素-3-O-(6-p-香豆酰基)-(1-2)鼠李糖苷、槲皮素-3-O-(6-p-香豆酰基)-(1-2)鼠李糖苷-同分异构体1、槲皮素-3-O-(6-p-香豆酰基)-(1-2)鼠李糖苷-同分异构体2、槲皮素-3-O-(6-p-香豆酰基)-(1-2)鼠李糖苷-同分异构体3、山柰素-3-O-(6-p-香豆酰基)-(1-2)鼠李糖苷-同分异构体1、山柰素-3-O-(6-p-香豆酰基)-(1-2)鼠李糖苷-同分异构体2、山柰素-3-O-(6-p-香豆酰基)-(1-2)鼠李糖苷-同分异构体3、山柰素-3-O-(6-p-香豆酰基)-(1-2)鼠李糖苷-同分异构体4；
所述黄酮醇类成分共5种；所述黄酮醇类成分为杨梅素、槲皮素、山柰素、异鼠李素、丁香亭；
所述单黄酮类成分共1种；所述单黄酮类成分为芹黄素；
所述双黄酮类成分共4种；所述双黄酮类成分为白果素、银杏双黄酮、异银杏双黄酮、榧黄素；
所述银杏酮酯中有机酸类成分共3种；所述银杏酮酯中有机酸类成分为原儿茶酸、对羟基苯甲酸、香草酸或咖啡酸；
所述供试品溶液中黄酮类和有机酸类成分的指纹图谱中的黄酮类和有机酸类成分，采用电喷雾离子源高分辨串联飞行时间质谱法进行测定验证；
所述电喷雾离子源高分辨串联飞行时间质谱法的检测条件为：离子源：ESI源；检测模式：负离子电喷雾电离模式；采集质量范围：50-1200Da；毛细管电压：2.5kV；锥孔电压：30V；离子源温度：110-130℃；去溶剂化温度：450-550℃；去溶剂化气体流量：750-850L/hr；锥孔气体流量：45-55L/hr；校正液：甲酸钠、亮氨酸脑啡肽；碰撞气体：氩气；低碰撞能量通道：5eV；高碰撞能量通道：25-55eV能量梯度。
2.根据权利要求1所述的银杏酮酯中黄酮类和有机酸类成分指纹图谱的检测方法，其特征在于，所述步骤1)中，所述银杏酮酯加入的重量与所述甲醇水溶液加入的体积之比为1：80-120。
3.根据权利要求1所述的银杏酮酯中黄酮类和有机酸类成分指纹图谱的检测方法，其特征在于，所述步骤1)中，所述涡旋提取的条件为：提取时间：3-10min；涡旋转速：2500-3000r/min。
4.根据权利要求1所述的银杏酮酯中黄酮类和有机酸类成分指纹图谱的检测方法，其特征在于，步骤1)或步骤2)中，所述甲醇水溶液为10-90％甲醇水溶液。
5.根据权利要求1-4任一所述的银杏酮酯中黄酮类和有机酸类成分指纹图谱的检测方法，在银杏酮酯中黄酮类和有机酸类成分的质量检测中的应用。
6.一种银杏酮酯中黄酮类和有机酸类成分的质量检测方法，包括采用如权利要求1-4任一所述的银杏酮酯中黄酮类和有机酸类成分指纹图谱的检测方法，得到银杏酮酯中黄酮类和有机酸类成分指纹图谱，再采用与银杏酮酯中黄酮类和有机酸类成分指纹图谱的检测方法相同的条件得到银杏酮酯中黄酮类和有机酸类成分的标准指纹图谱，将得到的银杏酮酯中黄酮类和有机酸类成分指纹图谱与银杏酮酯中黄酮类和有机酸类成分的标准指纹图谱进行相似度比较。
7.根据权利要求1-4任一所述的银杏酮酯中黄酮类和有机酸类成分指纹图谱的检测方法，在银杏酮酯中黄酮类和有机酸类成分含量测定中的应用。
8.一种银杏酮酯中黄酮类和/或有机酸类成分含量的测定方法，包括以下步骤：
A)供试品溶液的制备：采用权利要求1-4任一权利要求所述银杏酮酯中黄酮类和有机酸类成分指纹图谱的检测方法的步骤1)制备；
B)对照品溶液的制备：称取待测的黄酮类和/或有机酸类成分对照品中的一种或多种对照品，加入甲醇水溶液溶解并定容，即得单一对照品溶液或者混合对照品溶液；
C)采用高效液相色谱分别测定步骤A)中的供试品溶液和步骤B)中的对照品溶液，并采用外标法计算供试品溶液中黄酮类和/或有机酸类成分的含量。
9.根据权利要求8所述的银杏酮酯中黄酮类和/或有机酸类成分含量的测定方法，其特征在于，如步骤C)所述高效液相色谱法的色谱条件采用权利要求1-4任一权利要求所述银杏酮酯中黄酮类和有机酸类成分指纹图谱的检测方法的色谱条件。
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