CN110261512B - 基于代谢组学的维药昆仑雪菊质量评价方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于代谢组学的维药昆仑雪菊质量评价方法。该方法包括下述步骤：1)用体积比为85:15的甲醇‑水提取昆仑雪菊，得到样品溶液；2)制备标准品溶液；3)建立了昆仑雪菊的LC‑MS分析方法，并进行了方法学验证。在此基础上，对昆仑雪菊样本进行了代谢组学分析，获得了昆仑雪菊不同部位、不同地区代谢组信息，并采取多元统计分析的方法对各代谢组之间的差异进行了分析。上述研究结果表明，基于LC‑MS的代谢组学分析方法可区分不同产地，不同品种的昆仑雪菊以及昆仑雪菊的不同部位，有望为昆仑雪菊的全面质量控制提供一种新的技术和方法。此外，本研究也为昆仑雪菊的资源开发与合理利用提供了重要参考信息。

Description

基于代谢组学的维药昆仑雪菊质量评价方法

技术领域

本发明属于中药制剂质量评价技术领域，具体涉及一种基于代谢组学的维药昆仑雪菊质量评价方法。

背景技术

药用植物是人类赖以生存和发展的重要物质基础。随着医药科学分析技术的不断发展，通过寻找药用植物的活性成分而发现新药源是新药研发的基础，药用植物凭借种类的多样性而可以为新药的研制提供丰富的原材料。药用植物具有化学成分种类繁多含量差异大等特点，需全面、系统、有效分析药用植物所含有的小分子而阐明药用植物物质基础及其功能。基于LC-MS技术的代谢组学分析方法可以全面、快速、有效地研究药用植物内源性小分子，为药用植物质量控制进行合理评价。

昆仑雪菊(Kunlun chrysanthemum),学名叫两色金鸡菊(Coreopsis tinctoria),为菊科金鸡菊属(Coreopsis),一年生草本植物，具有花期短、采摘难的特点^[1]。早在秦汉时期《神农百草经》便将雪菊列为百草上品。长期以来，昆仑雪菊被当地居民当花茶饮用，经世代传承。昆仑雪菊主要分布在和田地区的昆仑山区，已开始在新疆和田、喀什、达坂城地区产业化种植。昆仑雪菊作为维吾尔医药惯用药材之一，具有降血压、抗炎、抗衰老、抗肿瘤等药理功效具有良好的开发和研究价值。

昆仑雪菊化学成分在种类和含量上表现出应有丰富性。截止目前20余类，300多种天然成分被分离和鉴定[张彦丽,韩艳春,阿依吐伦·斯马义.分光光度发测定维吾尔药昆仑雪菊中总皂苷的含量[J].西北药学杂志,2011,26(2):87-88]，主要有挥发性成分和非挥发性成分。其中挥发性成分以萜烯类、醛酮类、芳烃衍生化合物为主，非挥发性成分主要有多糖、氨基酸、黄酮类、总皂苷等，以上提到的这些成分中黄酮类、氨基酸类、多糖类在昆仑雪菊里占据主要含量和有效特征成分[景玉霞,兰卫.不同产地昆仑雪菊总黄酮含量测定[J].新疆中医药,2012,30(5):62-64]。

昆仑雪菊日常生活中以花茶饮用，饮用过程中发现具有抑制身体血压升高的作用。对此，梁淑红等[过利敏,张平,李士明,张谦.雪菊化学成分分析、提取、鉴定及其生物活性研究进展[J].食品科学,2014,35(7):298-304]人进行了昆仑雪菊在溶剂萃取条件下得到不同提取物的研究，采用高血脂小鼠体外胸主动脉血管环为标本从而以累积性地给药观察了不同提取物作用下获得的昆仑雪菊对基础状态和氯化钾血管环张力的不同表现。最终得到不同提取物下昆仑雪菊对基础状态血管环没有任何影响而对氯化钾血管环有不同程度舒张作用的结果。以上提取物中氯仿提取物部位影响作用最强从而得出氯仿部位中有着很强舒张血管的结论。

抗肿瘤研究中，帕尔哈提等[杨博,张薇.新疆雪菊化学及研究进展[J].化学工程与装备,2013,11:140-141]人按照昆仑雪菊不同提取条件分别获得总黄酮提取物、纯化物、总多糖的形式对结肠癌细胞株(HCT116细胞、CACO-2细胞)进行干预。实验利用MTT法检测细胞生长抑制率最终测定细胞凋亡率，尤其是昆仑雪菊可以加快结肠癌细胞株凋亡率。从而得到昆仑雪菊总黄酮纯化物抗肿瘤活性强于总黄酮提取物和总多糖，而且可以有效控制结肠癌细胞株增值的研究结果。

近些年有关昆仑雪菊主要分析方法研究包括钱宗耀等人[钱宗耀,安冉,华震宇,等.固相微萃取气质联用分析新疆雪菊的挥发性成分[J].中国实验方剂学杂志,2014,20(7):82-85]利用固相微萃取气质联用探究了昆仑雪菊挥发性成分。符继红等人[符继红,史岷山.新疆昆仑雪菊中微量元素的测定及溶出性研究[J].食品科技,2013,38(10):297-300]选用昆仑雪菊测定了微量元素及溶出性的分析研究。杜鹃[杜鹃,吴忠红.高效液相色谱法测定不同产地的昆仑雪菊中绿原酸和芦丁含量比较研究[J].河南工业大学,2015,36(2):71-73]等人通过高效液相色谱法测定出了不同产地栽培的昆仑雪菊中绿原酸和芦丁含量以及彼此之间含量上的差异。上述研究所用到的分析方法分别以柱色谱、分光光度计、原子吸收光谱作为分析工具对昆仑雪菊进行了质量评价。

随着社会经济的快速发展，间接地影响了市场对昆仑雪菊的需求，导致野生昆仑雪菊无法全面满足市场需求量的局面。所以，新疆部分地区已开始专门建立昆仑雪菊种植生产基地以便满足市场需求量。但是，关于野生昆仑雪菊和人工种植的昆仑雪菊在有效化学成分含量上以及药效物质基础标准上有着不同的看法。人工种植昆仑雪菊是否可以代替野生昆仑雪菊使用仍存争议。因此，需要对不同产地种植的昆仑雪菊进行全面的质量评价建立全面、系统化的分析方法，从而对不同产地的昆仑雪菊在安全性、有效性和质量可控性方面进行质量评价。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于代谢组学的维药昆仑雪菊质量评价方法。

本发明所提供的基于代谢组学的维药昆仑雪菊质量评价方法，包括下述步骤：

1)样品溶液的制备：

取昆仑雪菊不同组织器官的干粉末，分别用有机溶剂提取、超声、离心、干燥，得到干燥物，然后将所述干燥物进行复溶、超声、涡旋、离心、过滤，得到昆仑雪菊不同组织器官样品的上清液；所述提取用的有机溶剂为体积比为85:15的甲醇-水的混合溶剂；

2)标准品溶液的制备：

每种标准品各称取2～3mg，分别用体积比为50:50甲醇-水溶液溶解，配制成1mg/mL的不同的标准品溶液，最后稀释配制成1μg/mL混合标准溶液；

所述标准品选自下述任意一种：咖啡酸、芹黄素、山柰酚、绿原酸、金丝桃苷、山柰素；

所述混合标准溶液中含有下述六种标准品：咖啡酸、芹黄素、山柰酚、绿原酸、金丝桃苷、山柰素；所述混合标准溶液中每种标准品的浓度为1μg/mL；

3)采用液相色谱-串联质谱法分别对所述昆仑雪菊不同组织器官样品的上清液和标准品溶液进行测定，得到昆仑雪菊不同组织器官样品和标准品的总离子流色谱图；对得到的色谱数据进行处理，获得含有质荷比(m/z)、保留时间(Retention time)及峰面积信息的二维数据阵，然后采用多变量统计分析得到差异变量，根据差异代谢物的高分辨质荷比及串联质谱数据，结合标准品谱图的比对分析，即得到昆仑雪菊不同组织器官的植物代谢组的差异。

上述方法步骤1)中，所述昆仑雪菊不同组织器官选自下述任意一种：昆仑雪菊整体或花柄或花萼或花瓣。

所述昆仑雪菊不同组织器官的干粉末与所述有机溶剂的配比为(100±1)mg：1mL。

进行所述复溶之前所述超声的时间为30min；进行所述复溶之前所述离心的转速为13400r/min，所述离心的时间为10min；所述复溶的溶剂为体积比50:50的乙腈-水的混合溶剂；所述昆仑雪菊不同组织器官的干粉末与所述复溶溶剂的配比为(100±1)mg：1mL。

进行所述复溶之后所述超声的时间可为5min；进行所述复溶之后所述涡旋的转速为1200rpm，涡旋的时间为5min；进行所述复溶之后所述离心的转速可为13400r/min，所述离心的时间为10min。

上述方法步骤3)中，所述液相色谱条件如下：

Ultimate 3000系列超高效液相色谱，Acquity UPLC HSS T3色谱柱，规格：100mm×2.1mm，1.8μm；流动相：A:含0.1％甲酸的水溶液，B:含0.1％甲酸的乙腈溶液；流速：0.3mL/min，进样量：10μL；每次进样前用初始流动相平衡8min，洗脱梯度：洗脱梯度为：0～20min，5％～50％B；20～27min，50％～98％B；27～30min，98％B；30～30.1min，98％～5％B；

所述质谱条件如下：

Q-OT-qIT杂合型质谱仪，配有ESI离子源和Xcalibur4.02数据处理系统；蠕动泵直接进样，全扫描模式，扫描范围：m/z 100-1000，分辨率：60000(m/z 200)；喷雾电压：-3KV(负离子模式)；鞘气：35psi；辅助气：15psi；离子传输管和喷雾器温度：380℃(负离子模式)。

上述方法步骤3)中，所述多变量统计分析的方法包括主成分分析(简称PCA)和正交偏最小二乘判别分析(简称OPLS-DA分析)对样品进行模式识别，选择对分组贡献较大的变量(VIP>1.5)。

上述方法步骤3)中，在所述多变量统计分析之后还包括采用载荷图和原始轮廓图带有的Jack-knifed置信区间去筛选去除变异较大、不同地区之间较差大的变量，两两独立样本进行t检验并选择P<0.05的变量的步骤。

上述方法步骤3)中，在选择P<0.05的变量的步骤之后还包括运用Pearson相关性分析筛选除同位素离子加合离子和碎片，获得差异变量。

上述方法步骤3)的具体方法如下：将步骤3)获得的昆仑雪菊负离子检测模式下的UHPLC-(-)ESI-MS谱，采用数据格式转换软件MSConvert将原始数据raw格式转换成mzXML格式文件，然后导入R语言开源数据处理程序包XCMS对峰识别、峰对齐、峰填充及峰过滤，最终获得含有质荷比(m/z)、保留时间(Retention time)、峰面积等信息的二维数据阵；将二维数据阵导入SIMCA-P(version 14.0,Umetrics AB,

Sweden)软件进行多变量统计分析，利用主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)和正交偏最小二乘判别分析(Orthogonal partial least square-discriminant analysis,OPLS-DA)对样品进行模式识别；选择对分组贡献大的变量(VIP>1.5)，采用载荷图和原始轮廓图带有的Jack-knifed置信区间去筛选去除变异较大、不同地区之间较差大的变量，两两独立样本进行t检验并选择P<0.05的变量，再最后运用Pearson相关性分析筛选除同位素离子加合离子和碎片获得差异变量。

所述昆仑雪菊中代表性活性成分的提取结果如下：

本发明以维药昆仑雪菊为研究对象，建立了基于LC-MS技术的代谢组学分析方法。考察了样品前处理过程中的提取溶剂及提取比例对昆仑雪菊代谢组学提取效果的影响，以溶剂提取峰数目和代表性活性成分在不同溶剂比例下提取峰面积为指标选择了最佳提取比例。进一步通过色谱条件和质谱条件的优化，建立了昆仑雪菊的LC-MS分析方法，并进行了方法学验证。在此基础上，对昆仑雪菊样本进行了代谢组学分析，获得了昆仑雪菊不同部位、不同地区代谢组信息，并采取多元统计分析的方法对各代谢组之间的差异进行了分析。昆仑雪菊不同部位代谢组学结果发现，昆仑雪菊不同部位之间代谢组差异明显，其中花柄部位与其它部位的代谢组差异最大。代表性活性成分的分布在不同部位分布特征具有显著差异，花柄部位绿原酸、金丝桃苷、咖啡酸的含量均高于花萼和花瓣，花瓣中的山柰素和芹黄素均高于花瓣和花萼，而花萼中的山柰酚高于花柄和花瓣。上述结果提示花柄可能是绿原酸、金丝桃苷、咖啡酸的合成或累积部位，花瓣可能是山柰素和芹黄素合成或累积部位，而花萼可能是山柰酚的合成或累积部位。不同地区昆仑雪菊代谢组学结果表明，各地区昆仑雪菊代谢组之前存在显著差异，推测可能与不同地区独特的地理和生态环境有关。进一步比较了海拔高度和栽培品种对代表性活性成分含量的影响，结果发现，高海拔地区(墨玉，塔什库尔干)昆仑雪菊中的山奈酚，芹黄素和咖啡酸的含量均高于低海拔地区(莎车)，而绿原酸含量则显著低于低海拔地区。上述结果提示，高海拔地区可能有利于山奈酚，芹黄素和咖啡酸的合成和累积，而低海拔地区可能有利于绿原酸的合成和累积。人工栽培的平原雪菊(达坂城)中除金丝桃苷外，绿原酸、咖啡酸、芹黄素、山柰酚、山柰素等其他5种活性成分的含量均高于莎车县野生平原雪菊。这可能与人工栽培条件下，水分、养分较为充足，更有利于活性成分的合成和累积。上述研究结果表明，基于LC-MS的代谢组学分析方法可区分不同产地，不同品种的昆仑雪菊以及昆仑雪菊的不同部位，有望为昆仑雪菊的全面质量控制提供一种新的技术和方法。此外，本研究也为昆仑雪菊的资源开发与合理利用提供了重要参考信息。

附图说明

图1为负离子检测模式下各提取溶剂比例下得到的峰离子数目的比较，A:甲醇100％B:甲醇95％C:甲醇85％D:甲醇85％(含甲酸0.1％)。

图2为负离子检测模式各提取比例下得到的代表性活性成分峰面积的比较，A:甲醇100％B:甲醇95％C:甲醇85％D:甲醇85％(含甲酸0.1％)。

图3为负离子检测模式下昆仑雪菊的代表性总离子流色谱图。

图4为LC-(-)ESIMS色谱保留时间偏差曲线；正偏差表示在中位保留时间后进行洗脱，负偏差表示在中位保留时间前进行洗脱。

图5为负离子检测模式下昆仑雪菊不同部位UHPLC-(-)ESI-MS数据数据构建的OPLS-DA模型得分图A1:整体A2:花柄A3:花萼A4:花瓣。

图6为昆仑雪菊代表性活性成分在不同部位的提取结果。

图7为负离子检测模式下昆仑雪菊不同地区UHPLC-(-)ESI-MS数据数据构建的OPLS-DA模型得分图A:达坂城B:墨玉C:莎车D:塔什库尔干。

图8为昆仑雪菊代表性活性成分在不同地区的提取结果。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、

1.实验部分

1.1试剂与仪器

乙腈、甲醇购自德国Merck公司，甲酸购自美国ROE公司，均为色谱纯；实验用水娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)。

标准品：咖啡酸、芹黄素、山柰酚、绿原酸、金丝桃苷、山柰素。

表1实验使用仪器及生产公司名称

1.2实验方法

1.2.1样品的采集与制备

表2采集的昆仑雪菊基本信息

昆仑雪菊室温下干燥10天。取昆仑雪菊整体、花柄、花萼、花瓣用粉粹机粉粹成粉，称取100±1mg粉末于EP管中，使用1mL甲醇-水(85:15，V/V)匀浆1min，超声30min后离心10min(13400rpm)，取上清滤液烘干3h，取1mL乙腈-水(50:50V/V)进行复溶，超声5min涡旋5min(1200rpm)后离心10min(13400rpm)，取800μL上清液使用0.22μm微孔滤膜过滤取上清液进行LC-MS分析的准备。

1.2.2标准品的配制

标准品称取2～3mg，用甲醇-水(50:50，V/V)溶解，配制成1mg/mL的溶液，最后稀释配制成各标准品浓度均为1μg/mL的混合溶液，备检。

1.2.3色谱条件

Ultimate 3000系列超高效液相色谱(Ultra High Performance LiquidChromatography,UHPLC，美国Thermo公司)，Acquity UPLC HSS T3色谱柱(100mm×2.1mm，1.8μm，Waters公司)流动相：A:水(含0.1％甲酸)，B:乙腈(含0.1％甲酸)。流速：0.3mL/min，进样量：10μL；每次进样前用初始流动相平衡8min，洗脱梯度：洗脱梯度为：0～20min，5％～50％B；20～27min，50％～98％B；27～30min，98％B；30～30.1min，98％～5％B。

1.2.4质谱条件

Q-OT-qIT杂合型质谱仪(Orbitrap Fusion Lumos，美国Thermo公司)，配有ESI离子源和Xcalibur4.02数据处理系统。蠕动泵直接进样，全扫描模式，扫描范围：m/z 100-1000；分辨率：60000(m/z 200)；喷雾电压：-3KV(负离子模式)；鞘气：35psi；辅助气：15psi；离子传输管和喷雾器温度：380℃(负离子模式)。

1.2.5数据处理

运用建立的LC-MS分析方法获得昆仑雪菊负离子检测模式下的UHPLC-(-)ESI-MS谱后，采用数据格式转换软件MSConvert将原始数据(raw格式)转换成mzXML格式文件，然后导入R语言开源数据处理程序包XCMS对峰识别、峰对齐、峰填充及峰过滤，最终获得含有质荷比(m/z)、保留时间(Retention time)、峰面积等信息的二维数据阵。将二维数据阵导入SIMCA-P(version 14.0,Umetrics AB,

Sweden)软件进行多变量统计分析，利用主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)和正交偏最小二乘判别分析(Orthogonalpartial least square-discriminant analysis,OPLS-DA)对样品进行模式识别。选择对分组贡献大的变量(VIP>1.5)，采用载荷图和原始轮廓图带有的Jack-knifed置信区间去筛选去除变异较大、不同地区之间较差大的变量，两两独立样本进行t检验并选择P<0.05的变量，再最后运用Pearson相关性分析筛选除同位素离子加合离子和碎片获得差异变量。

1.2.6方法学验证

1.2.6.1仪器精密度

取昆仑雪菊粉末，按上述制备方法制作提取液，对提取液连续进样6次，计算6种已知活性成分峰面积的相对标准偏差(RSD)，对仪器精密度进行考察。

1.2.6.2方法稳定性

按三天为计划同一天平行制备6份提取液，计算不同时间洗脱的6种已知活性成分的RSD，评估方法的批内精密度；连续三天制备18份提取液计算6种已知活性成分的RSD评估方法批间精密度。

2.实验结果与讨论

2.1样品提取方法的优化

样品提取优化实验分别选用不同比例的甲醇-水(100％；95:5；85:15，V/V)、甲醇-水-甲酸(85:15:1,V/V)作为提取试剂考察了其对昆仑雪菊中化学成分的提取效果。首先对各种溶剂提取得到的色谱峰数目进行了比较(图1)，结果发现甲醇-水(85:15，V/V)条件下提取得到的色谱峰数目最多，昆仑雪菊在甲醇、甲醇-水(95:5，V/V)、甲醇-水(85:15，V/V)、甲醇-水-甲酸(85:15:1，V/V)提取溶剂中分别提取到5724，6044，6092和5923个色谱峰。随后对咖啡酸、芹黄素、绿原酸、山柰酚、金丝桃苷、山柰素等代表性活性成分的峰面积进行了比较(图2)，结果发现在甲醇-水(85:15，V/V)条件下各活性成分的峰面积最大。基于上述获得的色谱离子峰数目、代表性活性成分提取峰面积的比较最终确定甲醇-水(85:15，V/V)为最佳提取溶剂。

2.2色谱-质谱条件的优化

2.2.1色谱条件的优化

分别考察了乙腈-水、甲醇-水等多种流动相体系及其比例、进样体积、流速、梯度洗脱程序对色谱分离的影响。结果显示，甲醇-水为流动相时，弱极性部分的分离效果不如乙腈-水，同时甲酸的加入有利于抑制峰拖尾现象，所以选择流动相为乙腈(含0.1％甲酸)-水(含0.1％甲酸)在优化后的色谱条件下获得的总离子流色谱图(Total lonChromatographys,TICs)如图3所示，从图中可以看出，在进样量为10μL，流速为0.3mL/min，梯度洗脱时间为30min时各化合物分离度和峰型良好，表明该液相色谱条件适合于后续的代谢组学研究。

2.2.2质谱条件的优化

由于昆仑雪菊成分的复杂性，质谱条件的选定需兼顾各种类型及性质的活性成分检测，本研究在负离子检测模式下使用注射泵对咖啡酸、山柰素、绿原酸、山柰酚、金丝桃苷、芹黄素6种标准品的混合液直接进样，进行了主要测定参数的考察与优化确定参数如下：喷雾电压：-3KV(负离子模式)；鞘气：35psi；辅助气：15psi；离子传输管和喷雾器温度：380℃(负离子模式)。

2.3方法学验证的结果

基于建立的样品前处理方法和UHPLC-(-)ESI-MS分析方法，对昆仑雪菊样品6种已知活性成分标准品咖啡酸、山柰素、绿原酸、山柰酚、金丝桃苷、芹黄素检测考察结果如表3所示。

表3代表性活性成分在负离子检测模式下仪器精密度、方法精密度结果

仪器精密度结果显示负离子模式下代谢物提取离子峰面积相对标准偏差(RSD)均小于9.7％，保留时间偏差在正负4秒之内，如图4所示。本发明建立的分析方法精密度、稳定性良好，可用于昆仑雪菊植物样本的分析。

方法精密度结果显示，6种活性成分提取离子峰面积的批内RSD均小于8.4％和批间RSD均小于6.7％，表明方法精密度符合实验要求；连续测定3d，各活性成分保留时间RSD在0.3％之内，表明色谱系统稳定性良好。基于上述结果，本研究建立的分析方法可用于昆仑雪菊样本分析。

2.4昆仑雪菊不同部位代谢组学研究结果

采用上述建立的LC-MS分析方法对昆仑雪菊整体、花柄、花萼、花瓣等部位进行了代谢组学分析。采用有监督性的OPLS-DA模型图如图5所示，在负离子检测模式下，昆仑雪菊各部位的分离趋势明显，表明各部位的化学成分差异较大，其中花柄部位与其他部位的差异最大。

为了进一步考察各部位的成分差异，分别对各部位中代表性活性成分的峰面积进行了比较分析。代表性活性成分的分子式、精确分子量、保留时间等信息如表4所示。各代表活性成分在不同部位峰面积如图6所示。从图中可以看出，花柄部位绿原酸、金丝桃苷、咖啡酸的含量均高于花萼和花瓣，花瓣中的山柰素和芹黄素均高于花瓣和花萼，花萼中的山柰酚高于花柄和花瓣。上述结果提示花柄可能是绿原酸、金丝桃苷、咖啡酸的合成或累积部位，花瓣可能是山柰素和芹黄素合成或累积部位，而花萼可能是山柰酚的合成或累积部位。同时，上述研究结果为昆仑雪菊资源的有效利用提供了重要参考信息。

表4昆仑雪菊代表性活性成分的提取结果

2.5昆仑雪菊不同地区代谢组学研究结果

为了全面比较不同产地的昆仑雪菊的化学成分的差异，采用上述建立的基于LC-MS技术的代谢组学方法对乌鲁木齐(达坂城)、和田(墨玉)、喀什(莎车)和喀什(塔什库尔干)地区的昆仑雪菊进行了分析。从OPLS-DA模型图(图7)可以看出，在负离子检测模式下，各地区之间分组趋势明显，其中塔什库尔干地区昆仑雪菊的代谢组跟其它三个地区的差异最为明显，其次是墨玉地区的昆仑雪菊，推测与不同地区独特的地理和生态环境有关。达坂城和莎车地区昆仑雪菊虽然地理距离较远，但在OPLS-DA模型图的分布位置相似，可能与其生长区域的海拔高度相近有关。

为了获得不同地区的昆仑雪菊的差异代谢物，构建了有监督的OPLS-DA模型，选择对不同地区差异产生贡献的变量(VIP>1.5)，采用载荷图和原始轮廓图带有的Jack-knifed置信区间去筛选去除组内变异较大的变量，将和田地区与其它三个地区独立按照两两独立样本进行t检验，选择了P<0.05的变量，再运用Pearson相关性分析筛选了除同位素离子、加合离子和碎片。最后筛选出变化倍数>10的差异变量。结果如表5所示。

表5负离子模式下和田(墨玉)与乌鲁木齐(达坂城)、喀什(莎车)、喀什(塔什库尔干)之间的差异代谢物数目

通过上述结果表明，和田地区的昆仑雪菊和达坂城地区种植基地栽培昆仑雪菊差异变量数、变化倍数>10的差异变量数最多。和田地区的昆仑雪菊和塔什库尔干地区的昆仑雪菊差异变量数、变化倍数>10的差异变量数较少，变化倍数>10的差异变量数在15以下两个地区雪菊主要成分上有相同趋势，差异量明显少于较其它地区。

为了进一步考察不同地区昆仑雪菊的成分差异，分别对不同地区昆仑雪菊中的绿原酸、咖啡酸、芹黄素、山柰酚、金丝桃苷、山柰素等代表性活性成分的峰面积进行了比较分析。结果如图8所示。从图中可以看出，和田地区昆仑雪菊中的咖啡酸和金丝桃素含量最高，塔什库尔干地区昆仑雪菊中山奈酚含量最高，达坂城地区的昆仑雪菊中芹黄素、山奈素和绿原酸含量最高。

进一步考察了海拔高度对野生昆仑雪菊中代表性活性成分含量的影响。结果发现高海拔地区(墨玉，塔什库尔干)昆仑雪菊中的山奈酚，芹黄素和咖啡酸的含量均高于低海拔地区(莎车)，而绿原酸含量则显著低于低海拔地区。上述结果提示，高海拔地区可能有利于山奈酚，芹黄素和咖啡酸的合成和累积，而低海拔地区可能有利于绿原酸的合成和累积。

为了考察栽培方式对昆仑雪菊活性成分的影响，进一步比较了达坂城县人工栽培平原雪菊与莎车县野生平原雪菊中主要活性成分的含量差异，结果发现达坂城人工栽培的平原雪菊中除金丝桃苷外，绿原酸、咖啡酸、芹黄素、山柰酚、山柰素等其他5种活性成分的含量均高于莎车县野生平原雪菊。这可能与人工栽培条件下，水分、养分较为充足，更有利于活性成分的合成和累积。

3结论

本研究通过样品前处理条件、色谱条件和质谱条件的优化，建立了基于LC/MS技术的昆仑雪菊植物代谢组学分析方法。该方法灵敏度高，重复性好，可用于全面获取昆仑雪菊中的代谢物信息。采用该方法对不同部位、不同地区的昆仑雪菊样本进行了代谢组学分析，结合多元统计分析的方法，全面考察了不同部位、不同地区的昆仑雪菊中代谢物的差异，初步揭示了绿原酸、咖啡酸、芹黄素、山柰酚、金丝桃苷、山柰素等代表性活性成分在不同部位的含量分布特征以及栽培方式、海拔高度对其含量的影响。综上所述，本研究为昆仑雪菊的质量控制、合理利用等方面提供了重要参考信息。

Claims (9)

1.一种基于代谢组学的昆仑雪菊质量评价方法，包括下述步骤：

1）取昆仑雪菊不同组织器官的干粉末，分别用有机溶剂提取、超声、离心、干燥，得到干燥物，然后将所述干燥物进行复溶、超声、涡旋、离心、过滤，得到昆仑雪菊不同组织器官样品的上清液；所述提取用的有机溶剂为体积比为85:15的甲醇-水的混合溶剂；

2）每种标准品各称取2~3mg，分别用体积比为50:50甲醇-水溶液溶解，配制成1mg/mL的不同的标准品溶液，最后稀释配制成1μg/mL混合标准溶液；

所述标准品选自：咖啡酸、芹黄素、山柰酚、绿原酸、金丝桃苷、山柰素；

所述混合标准溶液中含有下述六种标准品：咖啡酸、芹黄素、山柰酚、绿原酸、金丝桃苷、山柰素；所述混合标准溶液中每种标准品的浓度均为1μg/mL；

3）采用液相色谱-串联质谱法分别对所述昆仑雪菊不同组织器官样品的上清液和标准品溶液进行测定，得到昆仑雪菊不同组织器官样品和标准品的总离子流色谱图；对得到的色谱数据进行处理，获得含有质荷比、保留时间及峰面积信息的二维数据阵，然后采用多变量统计分析得到差异变量，根据差异代谢物的高分辨质荷比及串联质谱数据，结合标准品谱图的比对分析，即得到昆仑雪菊不同组织器官的植物代谢组的差异；

所述步骤3）中，所述液相色谱条件如下：

Ultimate 3000系列超高效液相色谱，Acquity UPLC HSS T3色谱柱，规格：100 mm×2.1 mm，1.8 μm；流动相：A:含0.1%甲酸的水溶液，B: 含0.1%甲酸的乙腈溶液；流速：0.3mL/min，进样量：10μL；每次进样前用初始流动相平衡8min，洗脱梯度：洗脱梯度为：0~20 min，5%~50% B；20~27 min，50%~98% B；27~30 min，98% B；30~30.1 min，98%~5% B。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1）中，所述昆仑雪菊不同组织器官选自下述任意一种：昆仑雪菊的花柄或花萼或花瓣。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤1）中，所述昆仑雪菊不同组织器官的干粉末与所述有机溶剂的配比为（100±1）mg：1mL；

进行所述复溶之前所述超声的时间为30min；进行所述复溶之前所述离心的转速为13400r/min，所述离心的时间为10min；所述复溶的溶剂为体积比50:50的乙腈-水的混合溶剂。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1）中，所述昆仑雪菊不同组织器官的干粉末与复溶溶剂的配比为（100±1） mg：1mL；

进行所述复溶之后所述超声的时间为5min；进行所述复溶之后所述涡旋的转速为1200rpm，涡旋的时间为5min；进行所述复溶之后所述离心的转速可为13400r/min，所述离心的时间为10min。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤3）中，

所述质谱条件如下：

Q-OT-qIT杂合型质谱仪，配有ESI离子源和Xcalibur4.02数据处理系统；蠕动泵直接进样，全扫描模式，扫描范围：m/z 100-1000，分辨率：60000，m/z 200；喷雾电压：-3 KV，负离子模式；鞘气：35 psi；辅助气：15 psi；离子传输管和喷雾器温度：380℃，负离子模式。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤3）中，所述多变量统计分析的方法包括主成分分析和正交偏最小二乘判别分析对样品进行模式识别，选择对分组贡献较大的变量。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤3）中，在所述多变量统计分析之后还包括采用载荷图和原始轮廓图带有的Jack-knifed置信区间去筛选去除变异较大、不同地区之间较差大的变量，两两独立样本进行t检验并选择P<0.05的变量的步骤。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述步骤3）中，在选择P<0.05的变量的步骤之后还包括运用Pearson相关性分析筛选除同位素离子加合离子和碎片，获得差异变量。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述昆仑雪菊中代表性活性成分的提取结果如下：

咖啡酸 质荷比 m/z 179.0303，保留时间6.41 min；

芹黄素 质荷比 m/z 269.0389，保留时间12.07 min；

绿原酸 质荷比 m/z 353.0808，保留时间5.72 min；

山柰酚 质荷比 m/z 285.0342，保留时间10.87 min；

金丝桃苷 质荷比 m/z 463.0793，保留时间9.23 min；

山柰素 质荷比 m/z 299.0486，保留时间15.81 min。

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