CN112114079B - 一种同时检测使君子中9种化学成分的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种同时检测使君子中9种化学成分的方法，涉及分析检测技术领域。本发明采用醇水溶液对使君子进行提取，得到待测样品液；然后采用进行UPLC‑MS/MS。本发明通过UPLC‑MS/MS法，对待测使君子样品进行前处理，控制梯度洗脱的条件同时可以快速实现定性鉴定、定量检测使君子药材中9种化学(胡芦巴碱、香草酸、阿魏酸、丁香酸、儿茶素、鞣花酸、苹果酸、没食子酸、没食子酸甲酯)，为使君子药材的开发利用和质量评价提供了可靠的实验数据。本发明提供的检测方法操作简单，快速分析时间仅8min，分离速度快，灵敏度高，弥补了目前针对使君子中9种化学检测方法的空白，值得推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及分析检测技术领域，具体涉及一种同时检测使君子中9种化学成分的方法。
背景技术
使君子是使君子科使君子属植物使君子的干燥成熟果实，性甘温，归胃、脾经，功能主治：杀虫消积，健脾胃，除虚热，杀脏虫。现代药理研究表明使君子具有抗菌、抗病毒、杀虫驱虫、抗氧化、抗炎、抗高脂血症、抗糖尿病、抗癌等多种药理作用。使君子化学成分研究表明其主要有有机酸类、鞣质、挥发性化合物等，多成分是使君子多种药理作用的物质基础。
然而，目前，关于使君子质量控制研究报道较少，《中华人民共和国药典》2020年版(以下简称《中国药典》)使君子以胡芦巴碱为含量测定的指标；陈芝华等(陈芝华,李梦璐,吕伟旗,等.18个产地使君子果实葫芦巴碱含量测定与相关性分析[J].浙江中西医结合杂志,2018,28(11):972-975.)采用HPLC法测定了不同产地使君子中葫芦巴碱的含量；姜舜尧等(姜舜尧,田颂九.用高效离子交换色谱法分析使君子药材中胡芦巴碱成分[J].中国中药杂志,2004,29(2):44-46+96.)采用高效离子交换色谱法分析使君子药材中胡芦巴碱成分。然而，上述现有技术只检测了使君子的胡芦巴碱成分，难以反映出使君子的多种药理作用的整体质量。目前还未见对使君子多成分测定的文献报道，建立多成分综合评价的方法对使君子质量控制提升有着重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种同时检测使君子中9种化学成分的方法，采用本发明提供的方法能够快速、准确的实现使君子中9种化学成分的定性与定量检测。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种同时检测使君子中9种化学成分的方法，包括以下步骤：
采用醇水溶液对使君子干燥果实粉进行提取，得到待测样品液；
采用超高效液相色谱串联质谱检测所述待测样品液中9种化学成分的含量；
所述9种化学成分为胡芦巴碱、苹果酸、没食子酸、儿茶素、没食子酸甲酯、香草酸、丁香酸、鞣花酸和阿魏酸；
所述超高效液相色谱串联质谱中超高效液相色谱检测的条件包括：流动相体系为流动相A和流动相B，所述流动相A为乙腈，所述流动相B为0.01～0.2v/v甲酸水溶液；所述流动相体系的流速为0.15～0.5mL/min；采用梯度洗脱方式；
所述梯度洗脱的程序为：
0.0～2.0min，所述流动相A的体积百分含量为2％；
2.0～4.0min，所述流动相A的体积百分含量由2％匀速增加到40％；
4.0～6.0min，所述流动相A的体积百分含量由40％匀速增加到60％；
6.0～6.5min，所述流动相A的体积百分含量由60％匀速降低到2％；
6.5～8.0min，所述流动相A的体积百分含量为2％；
所述超高效液相色谱串联质谱中质谱检测的条件包括：离子源为电喷雾离子源；检测方式为正、负离子切换模式；定性离子扫描模式，质量数范围m/z为50～1000，子离子扫描模式，定量采用质谱多反应监测模式；毛细管电压负离子模式-1.5～-3.0kV，毛细管电压正离子模式+1.5～+4kV；脱溶剂气流为氮气500～1000L/h；脱溶剂温度为150～600℃；锥孔气流为氮气50～200L/h；离子源温度为120～250℃；碰撞气体为氩气。
优选的，所述醇水溶液包括甲醇水溶液或乙醇水溶液；
所述醇水溶液的体积浓度为20～90％。
优选的，所述使君子干燥果实粉的质量和醇水溶液的体积之比为1g：(30～100)mL。
优选的，所述提取为超声提取，所述超声提取的功率为200～300W，频率为20～80kHz，时间为15～60min。
优选的，所述超高效液相色谱检测的条件还包括：采用Welch Xtimate C18柱；柱温为35～50℃；进样量为2μL。
本发明提供了一种同时检测使君子中9种化学成分的方法，包括以下步骤：采用醇水溶液对使君子进行提取，得到待测样品液；采用超高效液相色谱串联质谱检测所述待测样品液中9种化学成分的含量；所述9种化学成分为胡芦巴碱、苹果酸、没食子酸、儿茶素、没食子酸甲酯、香草酸、丁香酸、鞣花酸和阿魏酸；所述超高效液相色谱串联质谱中超高效液相色谱检测的条件包括：流动相体系为流动相A和流动相B，所述流动相A为乙腈，所述流动相B为0.01～0.2v/v甲酸水溶液；所述流动相体系的流速为0.15～0.5mL/min；采用梯度洗脱方式；所述梯度洗脱的程序为：0.0～2.0min，所述流动相A的体积百分含量为2％；2.0～4.0min，所述流动相A的体积百分含量由2％匀速增加到40％；4.0～6.0min，所述流动相A的体积百分含量由40％匀速增加到60％；6.0～6.5min，所述流动相A的体积百分含量由60％匀速降低到2％；6.5～8.0min，所述流动相A的体积百分含量为2％；所述超高效液相色谱串联质谱中质谱检测的条件包括：离子源为电喷雾离子源；检测方式为正、负离子切换模式；定性离子扫描模式，质量数范围m/z为50～1000，子离子扫描模式，定量采用质谱多反应监测模式；毛细管电压负离子模式-1.5～-3.0kV，毛细管电压正离子模式+1.5～+4kV；脱溶剂气流为氮气500～1000L/h；脱溶剂温度为150～600℃；锥孔气流为氮气50～200L/h；离子源温度为120～250℃；碰撞气体为氩气。本发明通过，对待测使君子样品进行提取，通过UPLC-MS/MS的条件可以快速实现定性鉴定、定量检测使君子药材中9种化学(胡芦巴碱、香草酸、阿魏酸、丁香酸、儿茶素、鞣花酸、苹果酸、没食子酸、没食子酸甲酯)，为使君子药材的开发利用和质量评价提供了可靠的实验数据。本发明提供的检测方法操作简单，快速分析时间仅8min，分离速度快，灵敏度超高，弥补了目前针对使君子中9种化学检测方法的空白，值得推广应用。
附图说明
图1为本发明检测的9种化学成分的化学结构式图；
图2为实施例1测得的9种化学成分的总离子流色谱图；
图3为实施例1测得的9种化学成分的多反应监测离子流色谱图，其中，(A)为空白溶液，(B)为混合对照品溶液，(C)为待测样品液；
图4为实施例6中34个批次的使君子样品的热图聚类分析图；
图5为实施例6测得的4个产地的使君子样品中9种化学成分的含量箱型统计图；
图1～3中，1为胡芦巴碱，2为苹果酸，3为丁香酸，4为儿茶素，5为没食子酸甲酯，6为香草酸，7为丁香酸，8为鞣花酸，9为阿魏酸。
具体实施方式
本发明提供了一种同时检测使君子中9种化学成分的方法，包括以下步骤：
采用醇水溶液对使君子干燥果实粉进行提取，得到待测样品液；
采用超高效液相色谱串联质谱检测所述待测样品液中9种化学成分的含量；
所述9种化学成分为胡芦巴碱、苹果酸、没食子酸、儿茶素、没食子酸甲酯、香草酸、丁香酸、鞣花酸和阿魏酸；
所述超高效液相色谱串联质谱中超高效液相色谱检测的条件包括：流动相体系为流动相A和流动相B，所述流动相A为乙腈，所述流动相B为0.01～0.2v/v甲酸水溶液；所述流动相体系的流速为0.15～0.5mL/min；采用梯度洗脱方式；
所述梯度洗脱的程序为：
0.0～2.0min，所述流动相A的体积百分含量为2％；
2.0～4.0min，所述流动相A的体积百分含量由2％匀速增加到40％；
4.0～6.0min，所述流动相A的体积百分含量由40％匀速增加到60％；
6.0～6.5min，所述流动相A的体积百分含量由60％匀速降低到2％；
6.5～8.0min，所述流动相A的体积百分含量为2％；
所述超高效液相色谱串联质谱中质谱检测的条件包括：离子源为电喷雾离子源；检测方式为正、负离子切换模式；定性离子扫描模式，质量数范围m/z为50～1000，子离子扫描模式，定量采用质谱多反应监测模式；毛细管电压负离子模式-1.5～-3.0kV，毛细管电压正离子模式+1.5～+4kV；脱溶剂气流为氮气500～1000L/h；脱溶剂温度为150～600℃；锥孔气流为氮气50～200L/h；离子源温度为120～250℃；碰撞气体为氩气。
在本发明中，若没有特殊说明，所采用的试剂均为本领域技术人员所熟知的市售商品。
本发明采用醇水溶液对使君子干燥果实粉进行提取，得到待测样品液。
在本发明中，所述使君子干燥果实粉优选为将使君子干燥果实粉碎得到，所述粉碎采用的仪器优选为DFY-500型中药粉碎机(温岭市林大机械有限公司)。本发明对于所述使君子干燥果实的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的使君子干燥果实即可。在本发明的实施例中，所述使君子干燥果实优选来源于广西省、四川省、广东省或福建省，其中，批号为SC1-SC12的使君子干燥果实来源于四川省，批号为GX1-GX8的使君子干燥果实来源于广西省，批号为FJ1-FJ10的使君子干燥果实来源于福建省，批号为GD1-GD4的使君子干燥果实来源于广东省；所述使君子干燥果实存放于福建中医药大学中药资源标本室。
在本发明中，所述醇水溶液优选包括甲醇水溶液或乙醇水溶液；所述醇优选为色谱纯级。在本发明中，所述水优选为超纯水；所述超纯水优选利用Milli-Q超纯水仪(美国Millipore公司)制备得到。在本发明中，所述醇水溶液的体积浓度优选为20～90％，更优选为40～60％，最优选为50％。
在本发明中，所述使君子干燥果实粉的质量和醇水溶液的体积之比优选为1g：(30～100)mL，更优选为1g：(40～80)mL，最优选为1g：(50～60)mL。
在本发明中，所述提取优选为超声提取，所述超声提取的功率优选为200～300W，更优选为220～280W，最优选为250W；频率优选为20～80kHz，更优选为40～60kHz，最优选为50kHz；温度优选为室温；时间优选为15～60min，更优选为20～50min，最优选为30～40min。在本发明中，所述超声提取优选利用KQ-500DE数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)进行。
所述提取后，本发明优选还包括将所述提取的体系冷却至室温后称重，加入醇水溶液以弥补提取过程中的质量损失(质量损失＝使君子干燥果实粉的质量+提取用醇水溶液的质量-提取后体系的质量)，固液分离，将所得液体组分过0.22μm滤膜，得到提取液；在所述提取液中加入醇水溶液进行稀释，得到待测样品液。本发明对于所述固液分离的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的固液分离方式即可，具体如过滤。在本发明中，所述提取液和稀释用醇水溶液的体积比优选为1：(15～25)，更优选为1：(16～20)，最优选为优选为1:19。
得到待测样品液后，本发明采用超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)检测所述待测样品液中9种化学成分的含量；
所述9种化学成分为胡芦巴碱、苹果酸、没食子酸、儿茶素、没食子酸甲酯、香草酸、丁香酸、鞣花酸和阿魏酸，结构式如图1所示，其中，1为胡芦巴碱，2为苹果酸，3为丁香酸，4为儿茶素，5为没食子酸甲酯，6为香草酸，7为丁香酸，8为鞣花酸，9为阿魏酸。
在本发明中，所述超高效液相色谱串联质谱检测优选包括以下步骤：
将所述待测样品液进行超高效液相色谱串联质谱检测，得到样品色谱图；
根据所述样品色谱图分别得到样品中9种化学成分的峰面积；根据所述峰面积与线性曲线，分别计算待测样品液中9种化学成分的含量；所述线性曲线为9种化学成分各自的色谱峰面积-浓度的线性曲线；所述9种化学成分为胡芦巴碱、苹果酸、没食子酸、儿茶素、没食子酸甲酯、香草酸、丁香酸、鞣花酸和阿魏酸。
本发明将所述待测样品液进行超高效液相色谱串联质谱检测，得到样品色谱图。
在本发明中，所述超高效液相色谱串联质谱检测中超高效液相色谱检测的条件包括：色谱柱优选为Welch Xtimate C18柱；柱温优选为35～50℃，更优选为40～45℃；进样量优选为2μL；流动相体系为流动相A和流动相B；所述流动相A优选为乙腈；所述流动相B为0.01～0.2v/v甲酸水溶液，所述甲酸水溶液的浓度优选为0.05～0.15v/v％，更优选为0.1v/v％；所述流动相体系的流速为0.15～0.5mL/min，优选为0.2～0.4mL/min，更优选为0.25～0.3mL/min；洗脱方式为梯度洗脱。在本发明中，所述乙腈优选为色谱纯级。
在本发明中，所述梯度洗脱过程中所述流动相A和流动相B的体积百分含量总量为100％，所述梯度洗脱的程序具体如下：
0.0～2.0min，所述流动相A的体积百分含量为2％；
2.0～4.0min，所述流动相A的体积百分含量由2％匀速增加到40％；
4.0～6.0min，所述流动相A的体积百分含量由40％匀速增加到60％；
6.0～6.5min，所述流动相A的体积百分含量由60％匀速降低到2％；
6.5～8.0min，所述流动相A的体积百分含量为2％。
在本发明中，所述超高效液相色谱检测采用的仪器优选为ACQUITY UPLC I-Class超高效液相色谱仪(美国Waters公司)。
在本发明中，所述超高效液相色谱串联质谱检测中质谱检测的条件包括：离子源为电喷雾离子源；检测方式为正、负离子切换模式；定性离子扫描模式(MS Scan)，质量数范围m/z为50～1000；子离子扫描模式(Daughter Scan)；定量采用质谱多反应监测模式(MRM)；毛细管电压负离子模式-1.5～-3.0kV，优选为-2～-2.5kV，更优选为-2.5kV；毛细管电压正离子模式+1.5～+4kV，优选为+2～+3.5kV，更优选为+3.5kV；脱溶剂气流为氮气500～1000L/h，优选为600～900L/h，更优选为800L/h；脱溶剂温度为150～600℃，优选为300～600℃，更优选为500℃；锥孔气流为氮气50～200L/h，优选为100～150L/h，更优选为150L/h；离子源温度为120～250℃，优选为140～200℃，更优选为150℃；碰撞气体为氩气。
在本发明中，所述质谱检测采用的仪器优选为Xevo TQS三重四级杆质谱(美国Waters公司)。
使君子中9种化学成分的定性分析如表1所示，定量分析过程中采用的离子对，锥孔电压和碰撞能量条件如表2所示。在本发明中，定量分析过程中采用的离子对，锥孔电压和碰撞能量条件优选通过对9种化学成分的单一对照品进行UPLC-MS/MS检测优化得到。
表1使君子中9种化学成分的定性分析
表2使君子中9种化学成分定量分析的质谱测定条件
得到样品色谱图后，本发明根据所述样品色谱图分别得到样品中9种化学成分的峰面积；根据所述峰面积与线性曲线，分别计算待测样品液中9种化学成分的含量；所述线性曲线为9种化学成分各自的色谱峰面积-浓度的线性曲线；所述9种化学成分为胡芦巴碱、苹果酸、没食子酸、儿茶素、没食子酸甲酯、香草酸、丁香酸、鞣花酸和阿魏酸。
在本发明中，所述线性曲线的制备方法优选包括以下步骤：
分别配制9种化学成分的对照品系列溶液；所述9种化学成分为胡芦巴碱、苹果酸、没食子酸、儿茶素、没食子酸甲酯、香草酸、丁香酸、鞣花酸和阿魏酸；
将所述9种化学成分的对照品系列溶液进行UPLC-MS/MS检测，分别得到9种化学成分的色谱峰面积，将所述色谱峰面积与浓度线性拟合，得到线性曲线。
本发明分别配制9种化学成分的对照品系列溶液；所述9种化学成分为胡芦巴碱、苹果酸、没食子酸、儿茶素、没食子酸甲酯、香草酸、丁香酸、鞣花酸和阿魏酸。
在本发明的实施例中，9种对照品葫芦巴碱(MUST-18050501)、阿魏酸(MUST-19010106)、丁香酸(MUST-18083107)、没食子酸(MUST-18032401)、没食子酸甲酯(MUST-19012503)、儿茶素(MUST-18123009)、苹果酸(MUST-19021503)和鞣花酸(MUST-18112002)、香草酸(MUST-18051106)优选购买于成都曼斯特生物科技有限公司，9种对照品的纯度均优选大于98％。
在本发明中，所述9种化学成分的对照品系列溶液的配制方法，优选包括以下步骤：
分别在9种化学成分中加入甲醇，得到对照品母液；
将9种对照品母液混合，加入甲醇进行稀释，得到混合对照品溶液；
在所述混合对照品溶液中加入50v/v％甲醇水溶液进行逐级稀释，得到混合对照品系列溶液。
本发明在分别在9种化学成分中加入甲醇，得到对照品母液，具体的，分别在胡芦巴碱、苹果酸、没食子酸、儿茶素、没食子酸甲酯、香草酸、丁香酸、鞣花酸和阿魏酸中加入甲醇，分别得到胡芦巴碱对照品母液、苹果酸对照品母液、没食子酸对照品母液、儿茶素对照品母液、没食子酸甲酯对照品母液、香草酸对照品母液、丁香酸对照品母液、鞣花酸对照品母液和阿魏酸对照品母液。在本发明中，所述胡芦巴碱对照品母液、苹果酸对照品母液、没食子酸对照品母液、儿茶素对照品母液、没食子酸甲酯对照品母液、香草酸对照品母液、丁香酸对照品母液、鞣花酸对照品母液和阿魏酸对照品母液的浓度依次优选为1.458mg/mL、0.638mg/mL、0.49mg/mL、0.047mg/mL、0.072mg/mL、1.017mg/mL、0.68mg/mL、0.512mg/mL和0.057mg/mL。
得到对照品母液后，本发明将9种对照品母液混合，加入甲醇进行稀释，得到混合对照品溶液，具体的，将胡芦巴碱对照品母液、苹果酸对照品母液、没食子酸对照品母液、儿茶素对照品母液、没食子酸甲酯对照品母液、香草酸对照品母液、丁香酸对照品母液、鞣花酸对照品溶液和阿魏酸对照品母液置于5mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度后摇匀，得到混合对照品溶液。在本发明中，所述混合对照品溶液中胡芦巴碱、苹果酸、没食子酸、儿茶素、没食子酸甲酯、香草酸、丁香酸、鞣花酸和阿魏酸的浓度依次优选为204.12μg/mL、63.8μg/mL、19.6μg/mL、9.4μg/mL、7.2μg/mL、20.34μg/mL、13.6μg/mL、51.2μg/mL和2.052μg/mL。
得到混合对照品溶液后，本发明在所述对照品溶液中加入50v/v％甲醇水溶液进行逐级稀释，得到混合对照品系列溶液，具体的，将所述混合对照品溶液置于5mL容量瓶中，加入50v/v％甲醇水溶液定容至刻度后摇匀，得到混合对照品系列溶液。在本发明的实施例中，所述混合对照品系列溶液优选为7个，其编号为①～⑦，混合对照品系列溶液中9种化学成分的对照品的优选浓度如下：
①：胡芦巴碱、苹果酸、没食子酸、儿茶素、没食子酸甲酯、香草酸、丁香酸、鞣花酸和阿魏酸的浓度依次为163.3ng/mL、51.04ng/mL、15.68ng/mL、7.52ng/mL、5.76ng/mL、16.27ng/mL、10.88ng/mL、40.96ng/mL和1.64ng/mL；
②：胡芦巴碱、苹果酸、没食子酸、儿茶素、没食子酸甲酯、香草酸、丁香酸、鞣花酸和阿魏酸的浓度依次为408.2ng/mL、127.6ng/mL、39.20ng/mL、18.80ng/mL、14.4ng/mL、40.68ng/mL、27.2ng/mL、102.4ng/mL和4.10ng/mL；
③：胡芦巴碱、苹果酸、没食子酸、儿茶素、没食子酸甲酯、香草酸、丁香酸、鞣花酸和阿魏酸的浓度依次为653.2ng/mL、204.2ng/mL、62.72ng/mL、30.08ng/mL、23.04ng/mL、65.09ng/mL、43.52ng/mL、163.8ng/mL和6.57ng/mL；
④：胡芦巴碱、苹果酸、没食子酸、儿茶素、没食子酸甲酯、香草酸、丁香酸、鞣花酸和阿魏酸的浓度依次为816.5ng/mL、255.2ng/mL、78.40ng/mL、37.60ng/mL、28.80ng/mL、81.36ng/mL、54.4ng/mL、204.8ng/mL和8.21ng/mL；
⑤：胡芦巴碱、苹果酸、没食子酸、儿茶素、没食子酸甲酯、香草酸、丁香酸、鞣花酸和阿魏酸的浓度依次为3265.9ng/mL、1020.8ng/mL、313.6ng/mL、150.40ng/mL、115.2ng/mL、325.4ng/mL、217.6ng/mL、819.2ng/mL和32.83ng/mL；
⑥：胡芦巴碱、苹果酸、没食子酸、儿茶素、没食子酸甲酯、香草酸、丁香酸、鞣花酸和阿魏酸的浓度依次为6531.8ng/mL、2041.6ng/mL、627.2ng/mL、300.8ng/mL、230.4ng/mL、650.9ng/mL、435.2ng/mL、1638.4ng/mL和65.66ng/mL
⑦：胡芦巴碱、苹果酸、没食子酸、儿茶素、没食子酸甲酯、香草酸、丁香酸、鞣花酸和阿魏酸的浓度依次为8164.8ng/mL、2552.0ng/mL、784.0ng/mL、376.0ng/mL、288.0ng/mL、813.6ng/mL、544.0ng/mL、2048.0ng/mL和82.08ng/mL。
得到9种化学成分的对照品系列溶液后，本发明将所述9种化学成分的对照品系列溶液进行UPLC-MS/MS检测，分别得到9种化学成分的色谱峰面积，将所述色谱峰面积与浓度线性拟合，得到线性曲线。
本发明优选将所述胡芦巴碱对照品系列溶液、苹果酸对照品系列溶液、没食子酸对照品系列溶液、儿茶素对照品系列溶液、没食子酸甲酯对照品系列溶液、香草酸对照品系列溶液、丁香酸对照品系列溶液、鞣花酸对照品系列溶液和阿魏酸对照品系列溶液按照前述超高效液相色谱和质谱检测条件进行UPLC-MS/MS检测，得到对应浓度的9种化学成分系列标准工作溶液的峰面积，以待测样品的峰面积(Y)对待测样品的质量浓度(X，μg/L)进行线性回归，绘制标准曲线，得线性回归方程和相关系数，结果如表3所示：
表3使君子中9种化学成分的线性回归方程
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的实施例中，超高效液相色谱检测采用ACQUITY UPLC I-Class超高效液相色谱仪(美国Waters公司)；质谱检测采用Xevo TQS三重四级杆质谱(美国Waters公司)；称量采用CPA225D型十万分之一分析天平(德国Sartorius公司)；超声提取采用KQ-500DE数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；粉碎采用DFY-500型中药粉碎机(温岭市林大机械有限公司)；乙腈为色谱纯级(德国Merck公司)；甲醇为色谱纯级(德国Merck公司)；水为超纯水，采用Milli-Q超纯水仪(美国Millipore公司)制备；对照品葫芦巴碱(MUST-18050501)、阿魏酸(MUST-19010106)、丁香酸(MUST-18083107)、没食子酸(MUST-18032401)、没食子酸甲酯(MUST-19012503)、儿茶素(MUST-18123009)、苹果酸(MUST-19021503)、鞣花酸(MUST-18112002)、香草酸(MUST-18051106)均购于成都曼斯特生物科技有限公司，纯度均大于98％。
实施例1
(1)对照品系列溶液的配制
(1.1)配制9种化学成分的对照品母液
准确称取36.45mg胡芦巴碱，加入甲醇溶解，转移至25mL容量瓶中并定容至刻度，摇匀，得到浓度为1.458mg/mL的胡芦巴碱对照品母液；
准确称取15.95mg苹果酸，加入甲醇溶解，转移至25mL容量瓶中并定容至刻度，摇匀，得到浓度为1.458mg/mL的苹果酸对照品母液；
准确称取12.25mg没食子酸，加入甲醇溶解，转移至25mL容量瓶中并定容至刻度，摇匀，得到浓度为0.49mg/mL的没食子酸母液；
准确称取1.175mg儿茶素，加入甲醇溶解，转移至25mL容量瓶中并定容至刻度，摇匀，得到浓度为0.047mg/mL的儿茶素对照品母液；
准确称取1.80mg没食子酸甲酯，加入甲醇溶解，转移至25mL容量瓶中并定容至刻度，摇匀，得到浓度为0.072mg/mL的没食子酸甲酯母液；
准确称取25.43mg香草酸，加入甲醇溶解，转移至25mL容量瓶中并定容至刻度，摇匀，得到浓度为1.017mg/mL的香草酸对照品母液；
准确称取17.00mg丁香酸，加入甲醇溶解，转移至25mL容量瓶中并定容至刻度，摇匀，得到浓度为0.68mg/mL的丁香酸对照品母液；
准确称取12.80mg鞣花酸，加入甲醇溶解，转移至25mL容量瓶中并定容至刻度，摇匀，得到浓度为0.512mg/mL的鞣花酸母液；
准确称取1.43mg阿魏酸，加入甲醇溶解，转移至25mL容量瓶中并定容至刻度，摇匀，得到浓度为0.057mg/mL的阿魏酸对照品母液。
(1.2)配制混合对照品溶液
准确移取0.70mL胡芦巴碱对照品、0.50mL苹果酸对照品母液、0.20mL没食子酸母液、1.00mL儿茶素对照品母液、0.50mL没食子酸甲酯母液、0.10mL香草酸对照品母液、0.10mL丁香酸对照品母液、0.50mL鞣花酸母液和0.18mL阿魏酸对照品母液至5mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，得到混合对照品溶液；所述混合对照品溶液中胡芦巴碱、苹果酸、没食子酸、儿茶素、没食子酸甲酯、香草酸、丁香酸、鞣花酸和阿魏酸的浓度依次为204.12μg/mL、63.8μg/mL、19.6μg/mL、9.4μg/mL、7.2μg/mL、20.34μg/mL、13.6μg/mL、51.2μg/mL和2.052μg/mL。
(1.3)配制混合对照品系列溶液
准确移取不同量的混合对照品溶液置于5mL容量瓶中，分别加入50v/v％甲醇水溶液定容至刻度后摇匀，得到编号为①～⑦的混合对照品系列溶液，混合对照品系列溶液中9种化学成分的对照品的浓度如下：
①：胡芦巴碱、苹果酸、没食子酸、儿茶素、没食子酸甲酯、香草酸、丁香酸、鞣花酸和阿魏酸的浓度依次为163.3ng/mL、51.04ng/mL、15.68ng/mL、7.52ng/mL、5.76ng/mL、16.27ng/mL、10.88ng/mL、40.96ng/mL和1.64ng/mL；
②：胡芦巴碱、苹果酸、没食子酸、儿茶素、没食子酸甲酯、香草酸、丁香酸、鞣花酸和阿魏酸的浓度依次为408.2ng/mL、127.6ng/mL、39.20ng/mL、18.80ng/mL、14.4ng/mL、40.68ng/mL、27.2ng/mL、102.4ng/mL和4.10ng/mL；
③：胡芦巴碱、苹果酸、没食子酸、儿茶素、没食子酸甲酯、香草酸、丁香酸、鞣花酸和阿魏酸的浓度依次为653.2ng/mL、204.2ng/mL、62.72ng/mL、30.08ng/mL、23.04ng/mL、65.09ng/mL、43.52ng/mL、163.8ng/mL和6.57ng/mL；
④：胡芦巴碱、苹果酸、没食子酸、儿茶素、没食子酸甲酯、香草酸、丁香酸、鞣花酸和阿魏酸的浓度依次为816.5ng/mL、255.2ng/mL、78.40ng/mL、37.60ng/mL、28.80ng/mL、81.36ng/mL、54.4ng/mL、204.8ng/mL和8.21ng/mL；
⑤：胡芦巴碱、苹果酸、没食子酸、儿茶素、没食子酸甲酯、香草酸、丁香酸、鞣花酸和阿魏酸的浓度依次为3265.9ng/mL、1020.8ng/mL、313.6ng/mL、150.40ng/mL、115.2ng/mL、325.4ng/mL、217.6ng/mL、819.2ng/mL和32.83ng/mL；
⑥：胡芦巴碱、苹果酸、没食子酸、儿茶素、没食子酸甲酯、香草酸、丁香酸、鞣花酸和阿魏酸的浓度依次为6531.8ng/mL、2041.6ng/mL、627.2ng/mL、300.8ng/mL、230.4ng/mL、650.9ng/mL、435.2ng/mL、1638.4ng/mL和65.66ng/mL
⑦：胡芦巴碱、苹果酸、没食子酸、儿茶素、没食子酸甲酯、香草酸、丁香酸、鞣花酸和阿魏酸的浓度依次为8164.8ng/mL、2552.0ng/mL、784.0ng/mL、376.0ng/mL、288.0ng/mL、813.6ng/mL、544.0ng/mL、2048.0ng/mL和82.08ng/mL。
(2)待测样品液的制备
精密称取0.50g使君子干燥果实粉，置具塞三角锥形瓶中，加入20mL50v/v％甲醇水溶液，塞密封，称量，在室温、250W、50kHz下超声提取30min，冷确至室温后，再称重，用50v/v％甲醇水溶液补足重量损失，摇匀，过0.22μm滤膜，取50μL滤液加入950μL 50v/v％甲醇水溶液进行稀释，摇匀，得到待测样品液。
(3)待测样品液的UPLC-MS/MS检测
(3.1)UPLC-MS/MS检测条件
超高效液相色谱(UPLC)检测的条件：色谱柱为Welch Xtimate C18柱；柱温为45℃；进样量为2μL；流动相为流动相A和流动相B；所述流动相A为乙腈；所述流动相B为0.1v/v甲酸水溶液；所述流动相体系的流速为0.25mL/min；洗脱方式为梯度洗脱；
所述梯度洗脱过程中所述流动相A和流动相B的体积百分含量总量为100％，所述梯度洗脱的程序具体如下：
0.0～2.0min，所述流动相A的体积百分含量为2％；
2.0～4.0min，所述流动相A的体积百分含量由2％匀速增加到40％；
4.0～6.0min，所述流动相A的体积百分含量由40％匀速增加到60％；
6.0～6.5min，所述流动相A的体积百分含量由60％匀速降低到2％；
6.5～8.0min，所述流动相A的体积百分含量为2％。
质谱(MS/MS)检测的条件：离子源为电喷雾离子源；检测方式为正、负离子切换模式；定性离子扫描模式(MS Scan)，质量数范围m/z为50～1000，子离子扫描模式(DaughterScan)，定量采用质谱多反应监测模式(MRM)；毛细管电压负离子模式-2.5kV，毛细管电压正离子模式+3.5kV；脱溶剂气流为氮气800L/h；脱溶剂温度为500℃；锥孔气流为氮气15L/h；离子源温度为150℃；碰撞气体为氩气。
(3.2)使君子化学成分定性分析
使君子总离子流色谱图结果如图2所示，其中，1为胡芦巴碱，2为苹果酸，3为丁香酸，4为儿茶素，5为没食子酸甲酯，6为香草酸，7为丁香酸，8为鞣花酸，9为阿魏酸。使君子中胡芦巴碱、苹果酸、没食子酸、儿茶素、没食子酸甲酯、香草酸、丁香酸、鞣花酸和阿魏酸9种化学成分的鉴定方法为：Masslynx 4.1工作站中对正负总离子流进行分子离子峰的识别，根据母离子、子离子质谱信息，与相应对照品比对，定性检测结果如表1所示。
表1使君子中9种化学成分的定性分析结果
由表1和图2可知，通过比对相应对照品，胡芦巴碱、苹果酸、没食子酸、儿茶素、没食子酸甲酯、香草酸、丁香酸、鞣花酸和阿魏酸9种化学成分的保留时间、母离子、子离子质谱信息与对照品信息均一致，说明使君子中检测到胡芦巴碱、苹果酸、没食子酸、儿茶素、没食子酸甲酯、香草酸、丁香酸、鞣花酸和阿魏酸。
(3.3)使君子化学成分定量分析
采用多反应检测(MRM)定量模式，采用的定量离子对、锥孔电压和碰撞能量如表2所示，其他条件按照步骤(3.1)UPLC-MS/MS检测条件进行测定，待测样品液和步骤(1.2)配制的混合对照品溶液的MRM离子流色谱图如图3所示，其中，(A)为空白溶液，(B)为混合对照品溶液，(C)为待测样品液，1为胡芦巴碱，2为苹果酸，3为丁香酸，4为儿茶素，5为没食子酸甲酯，6为香草酸，7为丁香酸，8为鞣花酸，9为阿魏酸。
表2使君子中9种化学成分的的质谱测定条件
由图3可知，通过本发明方法可同时实现使君子药材中胡芦巴碱、苹果酸、没食子酸、儿茶素、没食子酸甲酯、香草酸、丁香酸、鞣花酸和阿魏酸9种化学成分的准确鉴定，在该条件下，色谱分析时间短，仅需8min，溶剂损耗缩小为2.0mL；而且，9种化学成分分离良好，空白无干扰，符合分析要求。
(4)分析方法学验证
(4.1)线性和范围分析
采用步骤(3.1)的UPLC-MS/MS检测条件，将混合对照品系列溶液按浓度从小到大依次进行UPLC-MS/MS检测，得到对应浓度的9种化学成分系列标准工作溶液的峰面积，以待测样品的峰面积(Y)对待测样品的质量浓度(X，μg/L)进行线性回归，绘制标准曲线，得线性回归方程和相关系数，以信噪比(S/N)为3计算9个待测化学成分的检测下限，并以信噪比(S/N)为10计算9个待测化学成分的定量下限，结果如表4所示：
表4使君子中9种化学成分的线性回归方程、线性范围、相关系数r、检测下限及定量下限
由表4可知，9种化学成分的检测下限为0.192～0.544ng/mL，定量下限为0.576～1.63ng/mL，说明本发明提供的检测限低，灵敏度高。
实施例2
精密度试验
将实施例1步骤(1.2)配制的混合对照品溶液，采用实施例1步骤(3.1)的UPLC-MS/MS检测条件进行UPLC-MS/MS检测，记录9种对照品的峰面积，1天内连续测试6次以测试日内精密度；连续测试3天，每天测试3次以测定日间精密度。根据表4中的线性回归方程分别计算混合对照品溶液中9种化学成分的浓度，通过各化学成分峰浓度计算日内精密度和日间精密度，结果如表5所示。
实施例3
稳定性试验
采用实施例1步骤(3.1)的UPLC-MS/MS检测条件，将实施例1步骤(2)制备的待测样品液分别于0h、2h、6h、10h、12h和24h进行UPLC-MS/MS检测，根据表4中的线性回归方程计算各个时间点9种化学成分的浓度，计算稳定性RSD，结果如表5所示。
实施例4
重复性试验
精密称取同一批次(批次为FJ8)使君子样品6份，按照实施例1步骤(2)制备的待测样品液，采用实施例1步骤(3.1)的UPLC-MS/MS检测条件进行UPLC-MS/MS检测，根据表4中的线性回归方程计算9种化学成分的含量及其RSD，结果如表5所示。
表5 9种化学成分的精密度、稳定性和重复性实验结果
由表5可知，日内精密度RSD为1.21～2.73％，内间精密度RSD为1.30～3.30％；待测样品液的稳定性RSD为1.27～3.13％；待测样品液测试6个时间点的RSD为1.12～2.43％，说明，本发明提供的方法，精密度良好，待测样品液在24h内稳定性良好，方法重复性好。
实施例5
回收率试验
称取约0.25g实施例4测试的已知9种化学成分含量的使君子样品(批次为FJ8)6份，分别加入与FJ8中9种化学成分相同质量的对应对照品，置具塞三角锥形瓶中，加入20mL50v/v％甲醇水溶液，塞密封，称量，在室温、250W、50kHz下超声提取30min，冷确至室温后，再称重，用50v/v％甲醇水溶液补足重量损失，摇匀，过0.22μm滤膜，取50μL滤液加入950μL50v/v％甲醇水溶液进行稀释，摇匀，得到待测样品-对照品液。采用实施例1步骤(3.1)的UPLC-MS/MS检测条件检测待测样品-对照品液，计算回收率，结果如表6所示：
表6 9种化学成分的回收率试验结果(n＝6)
由表6可知，9种化学成分的平均回收率为95.36％～99.47％，RSD值为2.52％～3.44％，表明本发明提供的方法回收率良好。
实施例6
按照实施例1步骤(2)制备待测样品液，采用实施例1步骤(3.1)的UPLC-MS/MS检测条件检测待测样品液，分别得到样品中9种化学成分的峰面积；根据所述峰面积代入表4中的线性回归方程，计算得到使君子中9种化学丰富的含量结果，如表7所示。将34个批次的使君子样品中9种化学成分的含量数据导入到OmicShare Tools热图聚类分析工具，设置归一化法得到热图聚类分析图，见图4。纵向的聚类能够反映不同批次的样品之间的关系，热图颜色的深浅可以能够反映不同批次的样品中相应成分的含量大小。进一步运用Graphpad8.01数据处理软件分析4个产地的使君子样品含量进行含量箱型图统计分析，见图5。其中，使君子分别来源于广西省(批号为GX1-GX8)、四川省(批号为SC1-SC12)、广东省(批号为GD1-GD4)和福建省(批号为FJ1-FJ10)。
表7各批次使君子样品中9种化学成分的含量(mg/g)
其中，ND表示低于定量下限。
对比例1
色谱柱分别采用Waters HSS T3 C18色谱柱(100×2.1mm,1.8μm，简写为柱1)、Waters CORTECS C18色谱柱(100×2.1mm,1.6μm，简写为柱2)、Phenomenex kintecx色谱柱(100×2.1mm，1.7μm，简写为柱3)和Welch Xtimate C18色谱柱(100mm×2.1mm,1.8μm，简写为柱4)，其他测试条件按照实施例1步骤(3.1)的UPLC-MS/MS检测条件，检测实施例1步骤(1.3)配制的混合对照品系列溶液中编号为⑦的溶液，每个色谱柱平行测试两次，测试结果如表8所示。
表8不同色谱柱下9种化学成分的响应值
由表8可知，本发明采用的Welch Xtimate C18色谱柱在色谱峰的响应值优于Waters HSS T3 C18色谱柱、Waters CORTECS C18色谱柱和Phenomenex kintecx色谱柱。
对比例2
流动相A和流动相B(简写为A-B)分别为乙腈-水(简写为流动相1)、乙腈-0.1v/v％甲酸水溶液(简写为流动相2)、甲醇-水(简写为流动相3)、甲醇-0.1v/v％甲酸水溶液(简写为流动相4)，其他测试条件按照实施例1步骤(3.1)的UPLC-MS/MS检测条件，检测实施例1步骤(1.3)配制的混合对照品系列溶液中编号为⑦的溶液，每种流动相体系平行检测两次，检测结果如表9所示。
表9不同流动相下9种化学成分的响应值
由表9可知，本发明使用乙腈-0.1v/v％甲酸水溶液作为流动相体系在色谱峰的响应值优于乙腈-水、甲醇-水和甲醇-0.1v/v％甲酸水溶液的流动相体系。
对比例3
采用MRM正、负离子切换模式同时定量使君子中9种化学成分，其他测试条件按照实施例1步骤(3.1)的UPLC-MS/MS检测条件，实施例1步骤(1.3)配制的混合对照品系列溶液中编号为⑦的溶液，每种模式平行检测两次，检测结果如表10所示。
表10不同离子模式下9种化学成分的响应值
| 成分 | 正离子-1 | 正离子-2 | 负离子-1 | 负离子-2 |
| 葫芦巴碱 | 32348296 | 32024454 | 12139318 | 12009782 |
| 苹果酸 | 554325 | 556311 | 865036 | 856392 |
| 没食子酸 | 110716 | 110223 | 275849 | 273133 |
| 儿茶素 | 261541 | 259352 | 839166 | 830687 |
| 没食子酸甲酯 | 761464 | 756837 | 839026 | 830612 |
| 香草酸 | 893519 | 884505 | 691435 | 686478 |
| 丁香酸 | 12694209 | 12567137 | 3981815 | 3911925 |
| 鞣花酸 | 6967512 | 6897436 | 4832132 | 4793590 |
| 阿魏酸 | 2285317 | 2262287 | 1956924 | 1944258 |
由表10可知，葫芦巴碱、香草酸、阿魏酸、丁香酸和鞣花酸在正离子模式下灵敏度高于负离子模式，而没食子酸、没食子酸甲酯、儿茶素和苹果酸则是在负离子模式下灵敏度较高。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种同时检测使君子中9种化学成分的方法，包括以下步骤：
采用甲醇水溶液对使君子干燥果实粉进行提取，得到待测样品液；
采用超高效液相色谱串联质谱检测所述待测样品液中9种化学成分的含量；
所述9种化学成分为胡芦巴碱、苹果酸、没食子酸、儿茶素、没食子酸甲酯、香草酸、丁香酸、鞣花酸和阿魏酸；
所述超高效液相色谱串联质谱中超高效液相色谱检测的条件包括：采用WelchXtimate C18柱；流动相体系为流动相A和流动相B，所述流动相A为乙腈，所述流动相B为0.01～0.2v/v甲酸水溶液；所述流动相体系的流速为0.15～0.5mL/min；采用梯度洗脱方式；
所述梯度洗脱的程序为：
0.0～2.0min，所述流动相A的体积百分含量为2％；
2.0～4.0min，所述流动相A的体积百分含量由2％匀速增加到40％；
4.0～6.0min，所述流动相A的体积百分含量由40％匀速增加到60％；
6.0～6.5min，所述流动相A的体积百分含量由60％匀速降低到2％；
6.5～8.0min，所述流动相A的体积百分含量为2％；
所述超高效液相色谱串联质谱中质谱检测的条件包括：离子源为电喷雾离子源；检测方式为正、负离子切换模式；定性离子扫描模式，质量数范围m/z为50～1000，子离子扫描模式，定量采用质谱多反应监测模式；毛细管电压负离子模式-1.5～-3.0kV，毛细管电压正离子模式+1.5～+4kV；脱溶剂气流为氮气500～1000L/h；脱溶剂温度为150～600℃；锥孔气流为氮气50～200L/h；离子源温度为120～250℃；碰撞气体为氩气。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述醇水溶液的体积浓度为20～90％。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述使君子干燥果实粉的质量和醇水溶液的体积之比为1g：(30～100)mL。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述提取为超声提取，所述超声提取的功率为200～300W，频率为20～80kHz，时间为15～60min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超高效液相色谱检测的条件还包括：柱温为35～50℃；进样量为2μL。
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