CN111337605B - 一种评价荷花蜂花粉真实性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及食品检测领域，具体涉及一种评价荷花蜂花粉真实性的方法。本发明首先发现了高含量穗花杉双黄酮(Amentoflavone,AF)作为荷花蜂花粉特征性标志物的应用。据此，本发明提出了一种评价荷花蜂花粉真实性的方法，以AF为指示性物质，当AF在荷花蜂花粉中含量介于600‑850 mg/kg时，可将其判断为真实的荷花蜂花粉；反之，则将其判定为其它类型的蜂花粉或掺假荷花蜂花粉。本发明提供的方法还具有简单、准确等优点，便于操作和推广，对保护荷花蜂花粉消费者的合法权益和维护蜂产品消费行业的健康发展具有重要的现实意义。

Description

一种评价荷花蜂花粉真实性的方法
技术领域
本发明涉及食品检测领域，具体涉及一种评价荷花蜂花粉真实性的方法。
背景技术
蜂花粉是蜜蜂采集蜜粉源植物的花粉，经过与自身分泌物混合，形成花粉团，储存在蜂巢中。蜂花粉是蜜蜂的食物，同时也是蜜蜂摄入蛋白质的主要来源。研究发现蜂花粉中含有丰富营养物质，如蛋白质、氨基酸、酚酸黄酮和矿物质等，故对人体具有较好的美容、保健等功效，深受年轻女性和老年人的喜爱。
当前我国蜂花粉的总产量约1万多吨，其中能够进入市场，成为商品的约有5000多吨。尽管蜜粉植物种类总多，但是能够大量生产蜂花粉品种主要有油菜粉、茶花粉、荷花粉、玉米粉、玫瑰粉、五味子粉、荞麦粉以及来源不明的杂花粉等，其中油茶粉和茶花粉占到我国花粉总产量的80%以上。
蜂花粉会因蜜粉源植物的不同，其产品的品质、色泽、口感和功效存在较大差异。而荷花蜂花粉色香味俱佳，口感香甜，深受人们喜爱。由于荷花蜂花粉产量稀少，市场供不应求，从而导致其在市场上的售价往往是其它花粉的3-5倍。部分不良企业为了追逐高额利润，往往采用其它品种的花粉冒充荷花蜂花粉，欺骗消费者。当前，业内尚未制定任何有关荷花蜂花粉的标准或行业标准，而相关标准和鉴别方法的缺失为当前荷花蜂花粉市场掺假的乱象提供了可能。荷花蜂花粉掺假现象不仅损害了蜂花粉消费者的正当权益，而且危害了蜂产品消费行业的健康发展和市场秩序。因此，亟需开发一种切实有效的荷花蜂花粉真实性和纯度评价方法。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明首先提出了高含量穗花杉双黄酮(Amentoflavone, 以下简称AF)作为荷花蜂花粉特征性标志物的应用，所述高含量为600-850 mg/kg。
本发明发现穗花杉双黄酮(Amentoflavone, AF)在荷花蜂花粉中含量高且相对稳定，显著区别于常见的8种蜂花粉，因此，可以采用高含量的AF用于荷花蜂花粉的真实性鉴别及纯度评价。
本发明进一步提出一种评价荷花蜂花粉真实性的方法，以AF为特征性标志物；若蜂花粉样本中AF的含量为600-850 mg/kg时，判断其为荷花蜂花粉；反之，则判定所述蜂花粉样本为其它蜂花粉或者掺假荷花蜂花粉。
作为优选，通过加入AF的空白蜂花粉确认AF的含量与峰面积间的线性关系，根据蜂花粉样本中AF的峰面积推算其含量。
作为优选，采用UHPLC-Q-Orbitrap（超高液相色谱-高分辨质谱）和/或 LC-MS/MS检测蜂花粉样本。
作为优选，AF在UHPLC-Q-Orbitrap的精确提取离子流色谱图中含有m/z539.09727（[M+H]+）准分子离子峰，其精确质量数的误差应当小于5 ppm；优选AF色谱峰的保留时间为6.39 min，保留时间允许的偏差应小于0.3 min。
此外，为了提高荷花蜂花粉的鉴别能力，AF的精确质量数和保留时间除了满足上述条件之外，该物质的MS/MS图谱（子离子图谱）中应该含有其主要的碎片离子，本发明进一步发现了其特征碎片离子：m/z 377.06558、m/z 335.05501、m/z 283.06009、m/z145.02841和m/z 153.01824，其精确质量数的误差应当小于10 ppm。基于上述MS/MS图谱中提供的主要碎片离子，即便是在无穗花杉双黄酮对照品的情况，依然可以通过判定蜂花粉样本中含有荷花蜂花粉，并可积分母离子峰面积用于荷花蜂花粉含量的计算。
作为优选，采用UHPLC-Q-Orbitrap对蜂花粉样本进行检测时，液相条件如下：
采用C18色谱柱，以0.1%的甲酸水为流动相A，0.1%的甲酸乙腈为B，采用梯度洗脱程序分离： 0-1.5 min，10%的流动相B；1.5-7.5 min，10-90%的流动相B；7.5-8.9min，90%的流动相B；8.9-9.0 min，90-10%的流动相B；9.0-10.0 min，10%的流动相B。
优选液相的流速为0.30 mL/min。
优选进样量为5.0 µL。
作为优选采用UHPLC-Q-Orbitrap对蜂花粉样本进行检测时，质谱条件如下：
离子源参数：鞘气的流速45 arb；辅助气的流速10 arb；挡锥气的流速0 arb； 电喷雾电压3.5 kV；离子导管的温度320 ℃；S-lens RF level设为 60 V；离子源的温度350℃。
优选采集的模式为正离子模式下的Full MS-ddMS2：其中Full MS的具体参数设置如下：分辨率：70000；AGC Target：3e6；Maximum IT：100 ms；Scan range：100-800 Da；Spectrum data：Centroid；其中dd-MS2的具体参数设置如下：分辨率：17500；AGC Target：1.6e5；Maximum IT：50 ms；Loop count：1； Isolation window：2.0 Da； NCE：35；Spectrumdata：Centroid；dd settings中，Minimum AGC： 8.0e3；Apex trigger：2-6 s；Excludeisotope：on；Dynamic exclusion：8.0 s。
采用LC-MS/MS对蜂花粉样本进行检测时，由于检测仪器的不同，LC-MS/MS的液相和质谱设置条件与UHPLC-Q-Orbitrap差异较大， 优选液相条件如下：采用C18色谱柱（优选采用较短的C18色谱柱），柱温为25℃，以0.1%的甲酸水为流动相A，0.1%的甲酸乙腈为流动相B，采用梯度洗脱程序分离：0-1.5 min，10%的流动相B；1.5-7.5 min，10-90%的流动相B；7.5-8.9min，90%的流动相B；8.9-9.0 min，90-10%的流动相B；9.0-10.0 min，10%的流动相B优选液相的流速为0.30 mL/min。
优选进样量为3.0 µL。
作为优选，为了准确定量蜂花粉中的穗花杉双黄酮，采用LC-MS/MS对蜂花粉样本进行检测时，选择多反应监测(MRM)的监测方式，MRM关键参数的设置如下：Fragementor：60V， 539.1>283.0，16 eV，539.1>153.0，22 eV。
质谱条件如下：电喷雾离子源（ ESI）；扫描方式：正离子扫描；离子喷雾电压：3500V；雾化气压力：45 psi；干燥气温度：300 ℃；干燥气流速：5 L /min；鞘气温度：250 ℃；鞘气流速：11 L /min。
其中，AF的详细MRM参数设置参见表1。
表1 LC-MS/MS在定量分析检测蜂花粉中AF的MRM关键参数设置
Figure 894818DEST_PATH_IMAGE001
为验证建立的LC-MS/MS方法科学合理性，本发明考察了该方法的准确度和精密度，变异系数均小于10%，完全符合残留检测分析的要求。
作为优选，在检测前，还包括利用甲醇水对所述蜂花粉样本进行提取的步骤；
优选所述蜂花粉样本与甲醇水的质量体积比1：（9~11）；更优选为1：10。
在所述甲醇水中，优选甲醇与水的体积比为2：（7~9），更优选为2：8。
作为优选，采用UHPLC-Q-Orbitrap对蜂花粉样本进行检测前，将蜂花粉按1：10000的质量体积比充分溶于甲醇水中，进行提取。
作为一种优选方案，所述提取具体包括如下步骤：将蜂花粉研磨成粉末，取0.8 g蜂花粉粉末样品:7.2 mL甲醇水的比例将其混合，并使蜂花粉充分混匀，20194 g高速离心20 min，再取10 µL提取液：990 µL甲醇水的比例稀释一次，再按照100 µL提取液：900 µL甲醇水的比例稀释一次。
本发明涉及到的试剂和标准品在市场上均可获得，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到较优的实施方式。
本发明的有益效果在于：
本发明首次公布了高含量AF可作为荷花蜂花粉真实性和纯度评价的指标，并提出了采用液相串联质谱(UHPLC-Q-Orbitrap或LC-MS/MS)检测蜂花粉中AF的方法。基于高分辨质谱提供的精确质量数，该方法具有较高的特异性和灵敏度，检出限可以达到1 µg/kg 。
此外，为了准确定量荷花蜂花粉中AF含量，本发明还对该物质的LC-MS/MS检测方法和关键的检测参数进行了优化。
同时，本发明中的方法还具有简单、高效等优点，便于操作和推广，对保护蜂花粉消费者的合法权益和维护蜂花粉消费行业的健康发展具有重要的现实意义。
附图说明
图1为荷花蜂花粉中生物标志物(穗花杉双黄酮, AF)的化学结构。
图2为AF精确质量数的Full Mass质谱图。
图3为AF精确质量数的MS/MS质谱图。
图4为UHPLC-Q-Orbitrap检测AF在空白荷花蜂花粉精确提取离子流色谱图，其中提取的质量窗口偏差小于5 ppm。
图5为LC-MS/MS的MRM模式检测8种蜜源蜂花粉样品中穗花杉双黄酮的含量。
图6为实施例3中20种商品化荷花蜂花粉样品中的AF含量。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
仪器与试剂：
1. 质谱仪（Q-Exactive Plus），美国Thermo Fisher Scientific公司；
2. 1200 series液相色谱-6460三重四级杆质谱，美国Agilent Technologies公司；
3.台式低温离心机（Microfuge 22R Centrifuge），美国 BeckMAN Coul TER公司；
4.电子分析天平（PL203），德国METTLERTOLEDO公司；
5.超纯水机（Milli-Q Gradient），美国Millipore公司；
6.涡动仪（G560E），美国Scientific Industries公司；
标准品穗花杉双黄酮（化学结构见图1）购买于北京百灵威科技有限公司；甲酸(FA) 购买于上海安谱实验科技股份有限(CNW)公司；乙腈(ACN)和甲醇(MeOH)购买于Fisher公司。
实施例1
1.样品来源
从市场或者蜂农处购买常见的真实蜂花粉样本共24份，分别为油菜蜂花粉（3份）、茶花蜂花粉（3份）、荷花蜂花粉（3份）、玉米蜂花粉（3份）、玫瑰蜂花粉（3份）、党参蜂花粉（3份）、五味子蜂花粉（3份），荞麦蜂花粉（3份）。用于检测各种蜂花粉中穗花杉双黄酮的含量。
2．样品处理
将蜂花粉研磨成粉，称取0.8 g研磨后的蜂花粉，加入7.2 mL 提取溶液，在室温下涡旋至完全溶解，并在20194 g，4 ℃下离心20 min。收集上清液过0.22 µm滤膜；吸取10 µL提取液，990 µL甲醇-水的比例稀释一次；再吸取100 µL提取液：900 µL甲醇-水的比例稀释一次。稀释液转移至进样瓶中等待上机分析。
3. Q Exactive plus测试条件如下：
色谱条件为：采用C18色谱柱，以0.1%的甲酸水为流动相A，0.1%的甲酸乙腈为B，采用梯度洗脱程序分离： 0-1.5 min，10%的流动相B；1.5-7.5 min，10-90%的流动相B；7.5-8.9min，90%的流动相B；8.9-9.0 min，90-10%的流动相B；9.0-10.0 min，10%的流动相B。液相的流速为0.30 mL/min；进样量：5.0 µL。
离子源参数：鞘气的流速45 arb；辅助气的流速10 arb；挡锥气的流速0 arb； 电喷雾电压3.5 kV；离子导管的温度320 ℃；S-lens RF level设为 60 V；离子源的温度350℃。
采集的模式为正离子模式下的Full MS-ddMS2。
其中Full MS的具体参数设置如下：分辨率：70000；AGC Target：3e6；Maximum IT：100 ms；Scan range：200-800 Da； Spectrum data：Centroid。其中dd-MS2的具体参数设置如下：分辨率：17500；AGC Target：1.6e5；Maximum IT：50 ms；Loop count：1； Isolationwindow：2.0 Da； NCE：90；Spectrum data：Centroid。而dd settings中，Minimum AGC：8.0e3；Apex trigger：2-6 s；Exclude isotope：on；Dynamic exclusion：8.0 s。
4.数据分析
质谱生成的数据通过Xcalibur软件收集并存储，将质谱采集的raw数据通过Compound Discoverer进行分析，比较不同种类的蜂花粉的化合物的种类和浓度，发现在荷花蜂花粉的数据分析结果中，疑似为穗花杉双黄酮化合物的浓度较大，且在荷花蜂花粉和其他蜂花粉之间可以形成明显区别。通过与穗花杉双黄酮对照品的色谱和高分辨质谱检测数据对比，确定该物质为穗花杉双黄酮。
实施例2
1.样品来源
从市场或者蜂农处购买常见的真实蜂花粉样本共24份，分别为油菜蜂花粉（3份）、茶花蜂花粉（3份）、荷花蜂花粉（3份）、玉米蜂花粉（3份）、玫瑰蜂花粉（3份）、党参蜂花粉（3份）、五味子蜂花粉（3份），荞麦蜂花粉（3份）。用于检测各种蜂花粉中穗花杉双黄酮的含量。
2. 溶液配制
（1）溶液配制
提取溶液：移取甲醇20 mL，超纯水定容到100 mL。4 ℃保存。
穗花杉双黄酮标准溶液：称取10 mg的穗花杉双黄酮标准品，甲醇定容至10 mL。4℃保存，有效期2个月。
3. Q Exactive plus测试条件如下：
（1）样品处理：
将蜂花粉研磨成粉，称取0.8 g研磨后的蜂花粉，加入7.2 mL 提取溶液，在室温下涡旋至完全溶解，并在20194 g，4 ℃下离心20 min。收集上清液过0.22 µm滤膜；吸取10 µL提取液，990 µL甲醇-水的比例稀释一次；再吸取100 µL提取液：900 µL甲醇-水的比例稀释一次。稀释液转移至进样瓶中等待上机分析。
（2）空白蜂花粉加标：
将空白蜂花粉（不含AF）研磨成粉，称取0.8 g研磨后的空白蜂花粉，加入7.2 mL提取溶液，在室温下涡旋至完全溶解，并在20194 g，4 ℃下离心20 min。收集上清液过0.22µm滤膜转移至进样品中，吸取10 µL提取液，990 µL甲醇-水的比例稀释一次；再吸取100µL提取液：900 µL甲醇-水的比例稀释一次。取900 µL稀释过滤后的液体加入进样瓶，再移取100 µL浓度为1 mg/kg的穗花杉双黄酮标准溶液。涡旋混匀，等待上机分析。
（3）Q Exactive plus仪器设置
色谱条件为：采用C18色谱柱，以0.1%的甲酸水为流动相A，0.1%的甲酸乙腈为B，采用梯度洗脱程序分离： 0-1.5 min，10%的流动相B；1.5-7.5 min，10-90%的流动相B；7.5-8.9min，90%的流动相B；8.9-9.0 min，90-10%的流动相B；9.0-10.0 min，10%的流动相B。液相的流速为0.30 mL/min；进样量：5.0 µL。
离子源参数：鞘气的流速45 arb；辅助气的流速10 arb；挡锥气的流速0 arb； 电喷雾电压3.5 kV；离子导管的温度320 ℃；S-lens RF level设为 60 V；离子源的温度350℃。
采集的模式为正离子模式下的Full MS-ddMS2。
其中Full MS的具体参数设置如下：分辨率：70000；AGC Target：3e6；Maximum IT：100 ms；Scan range：200-800 Da； Spectrum data：Centroid。其中dd-MS2的具体参数设置如下：分辨率：17500；AGC Target：1.6e5；Maximum IT：50 ms；Loop count：1； Isolationwindow：2.0 Da； NCE：90；Spectrum data：Centroid。而dd settings中，Minimum AGC：8.0e3；Apex trigger：2-6 s；Exclude isotope：on；Dynamic exclusion：8.0 s。
质谱生成的数据通过Xcalibur软件收集并存储，将质谱采集的raw数据通过Xcalibur的Qualitative browser分析，比较样品与空白加标样品中AF的Full MS（见图2）及MS/MS图谱（见图3），确定样品中含有穗花杉双黄酮。检测AF在空白荷花蜂花粉精确提取离子流色谱图，其中提取的质量窗口偏差小于5 ppm，得到图4。
（4）标准曲线的绘制：在空白蜂花粉样品提取后过滤膜的溶液中制备一系列AF溶液（10，20，50，100，200，500 ng/mL）。数据通过Trace Finder软件处理，定量蜂花粉样品中穗花杉双黄酮的含量。
4.Agilent1200液相色谱-6460三重四级杆质谱分析条件如下：
（1）样品处理：
将蜂花粉研磨成粉，称取0.8 g研磨后的蜂花粉，加入7.2 mL 提取溶液，在室温下涡旋至完全溶解，并在20194 g，4 ℃下离心20 min。收集上清液过0.22 µm滤膜；吸取10 µL提取液，990 µL甲醇-水的比例稀释一次；再吸取100 µL提取液：900 µL甲醇-水的比例稀释一次。稀释液转移至进样瓶中等待上机分析。
（2）空白蜂花粉加标：
将空白蜂花粉(不含AF)研磨成粉，称取0.8 g研磨后的空白蜂花粉，加入7.2 mL提取溶液，在室温下涡旋至完全溶解，并在20194 g，4 ℃下离心20 min。收集上清液过0.22µm滤膜转移至进样品中，吸取10 µL提取液，990 µL甲醇-水的比例稀释一次；再吸取100µL提取液：900 µL甲醇-水的比例稀释一次。取900 µL稀释过滤后的液体加入进样瓶，再移取100 µL浓度为1 mg/kg的AF标准溶液。涡旋混匀，等待上机分析。
（3）Agilent 1200-6460仪器参数设置如下：采用C18色谱柱，以0.1%的甲酸水为流动相A，0.1%的甲酸乙腈为B，采用梯度洗脱程序分离： 0-1.5 min，10%的流动相B；1.5-7.5min，10-90%的流动相B；7.5-8.9min，90%的流动相B；8.9-9.0 min，90-10%的流动相B；9.0-10.0 min，10%的流动相B。液相的流速为0.30 mL/min；进样量：5.0 µL。
LC-MS/MS的质谱条件如下：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子扫描；监测方式：多反应监测（MRM）；离子喷雾电压：3500 V；雾化气压力：45 psi；干燥气温度：300℃；干燥气流速：11 L /min；鞘气温度：250℃；鞘气流速：11 L /min。
采集的模式为正离子模式下的MRM模式。MRM参数：539.1>283.0，16 eV （定量离子），539.1>153.0，22 eV （定性离子）。
（4）在空白蜂花粉样品提取后过滤膜的稀释10000倍的溶液中制备一系列AF（1，2，5，10，20，50 ng/mL）。并指定20 ng/mL的空白添加为质控样本。
通过Agilent 的MassHunter定量软件分析样品及空白加标样品。外标法定量，得到标曲公式为Y=1.549e5X+1.566e5，R2=0.9998 （X为浓度Y定量离子响应积分值）。
通过定量软件即可分析蜂花粉样品中的AF含量，通过浓度稀释计算，得到蜂花粉样品中AF的含量。对20中已知花粉源的蜂花粉样本的检测结果见图5。由图5可知，荷花蜂花粉中的AF的含量显著区别于其他花粉源的蜂花粉样本，当样品中AF的含量为600-850 mg/kg时，可被判别为样品花粉源为荷花，该样品为荷花蜂花粉。
实施例3
1.样品来源
从市场购买20种商品化荷花蜂花粉。
2. 实验步骤
（1）溶液配制
提取溶液：移取甲醇20 mL，超纯水定容到100 mL。4 ℃保存。
AF标准溶液：称取10 mg的AF标准品，甲醇定容至10 mL。4 ℃保存，有效期2个月。
（2）样品处理：
将蜂花粉研磨成粉，称取0.8 g研磨后的蜂花粉，加入7.2 mL 提取溶液，在室温下涡旋至完全溶解，并在20194 g，4 ℃下离心20 min。收集上清液过0.22 µm滤膜；吸取10 µL提取液，990 µL甲醇-水的比例稀释一次；再吸取100µL提取液：900 µL甲醇-水的比例稀释一次。稀释液转移至进样瓶中等待上机分析。
（3）空白蜂花粉加标：
将空白蜂花粉（不含AF）研磨成粉，称取0.8 g研磨后的空白蜂花粉，加入7.2 mL提取溶液，在室温下涡旋至完全溶解，并在20194 g，4 ℃下离心20 min。收集上清液过0.22µm滤膜转移至进样品中，吸取10 µL提取液，990 µL甲醇-水的比例稀释一次；再吸取10 0µL提取液：900 µL甲醇-水的比例稀释一次。取900 µL稀释过滤后的液体加入进样瓶，再移取100 µL浓度为1 mg/kg的AF标准溶液。涡旋混匀，等待上机分析。
（3）Agilent 1200-6460仪器参数设置如下：采用C18色谱柱，以0.1%的甲酸水为流动相A，0.1%的甲酸乙腈为B，采用梯度洗脱程序分离： 0-1.5 min，10%的流动相B；1.5-7.5min，10-90%的流动相B；7.5-8.9min，90%的流动相B；8.9-9.0 min，90-10%的流动相B；9.0-10.0 min，10%的流动相B。液相的流速为0.30 mL/min；进样量：5.0 µL。
LC-MS/MS的质谱条件如下：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子扫描；监测方式：多反应监测（MRM）；离子喷雾电压：3500 V；雾化气压力：45 psi；干燥气温度：300℃；干燥气流速：11 L /min；鞘气温度：250℃；鞘气流速：11 L /min。
采集的模式为正离子模式下的MRM模式。MRM参数：539.1>283.0，16 eV （定量离子），539.1>153.0，22 eV （定性离子）。
（4）在空白蜂花粉样品提取后过滤膜的稀释10000倍的溶液中制备一系列AF（1，2，5，10，20，50 ng/mL）。并指定20 ng/mL的空白添加为质控样本。
通过Agilent 的MassHunter定量软件分析样品及空白加标样品。外标法定量，得到标曲公式为Y=1.527e5X+1.519e5，R2=0.9997 （X为浓度Y定量离子响应积分值）。
通过定量软件即可分析20种荷花蜂花粉样品中的AF含量，通过浓度稀释计算，得到蜂花粉中AF的含量如图6。其中编号为1、9、10、13、16的荷花蜂花粉AF的含量在600-850mg/kg。因此判定编号为1、3、4、5、8、9、10、13、16、17的荷花蜂花粉花为真实的荷花蜂花粉，编号为2、6、7、11、12、14、15、18、19、20为其它蜂花粉或掺假荷花蜂花粉。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.高含量穗花杉双黄酮作为荷花蜂花粉特征性标志物的应用，所述高含量为600-850mg/kg。
2.一种评价荷花蜂花粉真实性的方法，其特征在于，以穗花杉双黄酮为特征性标志物；若蜂花粉样本中穗花杉双黄酮的含量介于600-850 mg/kg时，判断所述蜂花粉样本为荷花蜂花粉；若蜂花粉样本中穗花杉双黄酮的含量低于600 mg/kg时，判定所述蜂花粉样本为其它蜂花粉或者掺假荷花蜂花粉。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，采用UHPLC-Q-Orbitrap和/或 LC-MS/MS检测蜂花粉样本。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，穗花杉双黄酮在UHPLC-Q-Orbitrap的精确提取离子流色谱图中含有m/z 539.09727（[M+H]+）准分子离子峰，其精确质量数的误差应当小于5 ppm；穗花杉双黄酮色谱峰的保留时间为6.39min，保留时间允许的偏差应小于0.3min。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，穗花杉双黄酮的MS/MS图谱中应含有以下一个或多个碎片离子蜂，m/z 377.06558、m/z 335.05501、m/z 283.06009、m/z 145.02841和m/z 153.01824，其精确质量数的误差应当小于10 ppm。
6.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，采用UHPLC-Q-Orbitrap对蜂花粉样本进行检测时，液相条件如下：
采用C18色谱柱，以0.1%的甲酸水为流动相A，0.1%的甲酸乙腈为B，采用梯度洗脱程序分离：0-1.5 min，10%的流动相B；1.5-7.5 min，10-90%的流动相B；7.5-8.9min，90%的流动相B；8.9-9.0 min，90-10%的流动相B；9.0-10.0 min，10%的流动相B。
7.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，采用UHPLC-Q-Orbitrap对蜂花粉样本进行检测时，质谱条件如下：
离子源参数：鞘气的流速45 arb；辅助气的流速10 arb；挡锥气的流速0 arb；电喷雾电压3.5 kV；离子导管的温度320 ℃；S-lens RF level设为 60 V；离子源的温度350℃；
采集的模式为正离子模式下的Full MS-ddMS2：其中Full MS的具体参数设置如下：分辨率：70000；AGC Target：3e6；Maximum IT：100 ms；Scan range：100-800 Da； Spectrumdata：Centroid；其中dd-MS2的具体参数设置如下：分辨率：17500；AGC Target：1.6e5；Maximum IT：50 ms；Loop count：1； Isolation window：2.0 Da； NCE：35；Spectrum data：Centroid；dd settings中，Minimum AGC： 8.0e3；Apex trigger：2-6 s；Exclude isotope：on；Dynamic exclusion：8.0 s。
8.根据权利要求3或5所述的方法，其特征在于，采用LC-MS/MS对蜂花粉样本进行检测时，液相条件如下：采用C18色谱柱，柱温为25℃，以0.1%的甲酸水为流动相A，0.1%的甲酸乙腈为流动相B；采用梯度洗脱程序分离：0-1.5 min，10%的流动相B；1.5-7.5 min，10-90%的流动相B；7.5-8.9min，90%的流动相B；8.9-9.0 min，90-10%的流动相B；9.0-10.0 min，10%的流动相B。
9.根据权利要求3或5所述的方法，其特征在于，采用LC-MS/MS对蜂花粉样本进行检测时，选择多反应监测的监测方式，MRM关键参数的设置如下：穗花杉双黄酮的Fragementor：60 V， 539.1>283.0，16 eV，539.1>153.0，22 eV；
谱条件如下：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；离子喷雾电压：3500 V；雾化气压力：45 psi；干燥气温度：300℃；干燥气流速：5 L /min；鞘气温度：250℃；鞘气流速：11 L /min。
10.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在检测前，还包括利用甲醇水对所述蜂花粉样本进行提取的步骤；
所述蜂花粉样本与甲醇水的质量体积比1：（9~11）；
在所述甲醇水中，甲醇与水的体积比为2：（7~9）。
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