CN111798937B - 一种枸杞组织的代谢组学数据库建立方法及应用 - Google Patents

一种枸杞组织的代谢组学数据库建立方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种枸杞组织的代谢组学数据库建立方法及应用，包括：收集不同品种枸杞的叶片及果实组织，将不同品种的叶片进行归总，将不同品种果实进行归总，分别进行前处理并加入提取试剂进行提取，得到叶片提取液及果实提取液；将所述步骤S1得到的提取液进行LC‑MS/MS检测并进行数据分析；解析所述各代谢物的化学结构并定位离子色谱峰；构建数据库。本发明的有益效果在于：(1)通过前处理方法、质谱方法及色谱方法的相互配合，快速鉴定枸杞叶与枸杞果的大量物质，构建了全面的代谢物数据库；(2)代谢物数据库数据库为后续枸杞代谢物的定性及定量分析提供了方便；(3)枸杞叶与枸杞果的特异代谢物的检测确定，为后续枸杞的代谢研究开发提供物质基础。

Description

一种枸杞组织的代谢组学数据库建立方法及应用
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体属于一种枸杞组织的代谢组学数据库建立方法及应用。
背景技术
枸杞作为广泛应用的药食两用作物，其果实与叶片都具有广阔的应用的前景。
但是，枸杞的品质为因种植区域、种植技术各种方法造成差异，而这些差异会影响枸杞的应用。例如，在中医药领域，由于枸杞的品质不一，会对药效造成影响，这已经成为中药难以标准化生产的因素之一。
因此，为更好的了解及鉴定不同枸杞不同组织的差异性，使其功能性物质得到最大化利用，并方便后续的枸杞种植研究，构建全面的枸杞组织的代谢组数据库十分必要。
发明内容
为构建全面的枸杞组织代谢组学数据库，本发明提供一种枸杞组织的代谢组学数据库建立方法及应用。
具体技术方案如下：
一种枸杞组织代谢组学数据库构建方法，其不同之处在于，所述枸杞组织代谢组学数据库构建方法包括：
步骤S1:收集不同品种枸杞的叶片及果实组织，将不同品种的叶片进行归总，将不同品种果实进行归总，分别进行前处理并加入提取试剂进行提取，得到叶片提取液及果实提取液；
步骤S2:将所述步骤S1得到的提取液进行LC-MS/MS检测并进行数据分析；
步骤S3：解析所述各代谢物的化学结构并定位离子色谱峰；
步骤S4：构建数据库。
进一步，所述步骤S1中提取步骤包括：
将样品依次经过冷冻干燥及研磨后，加入提取液并混合均匀，静置后离心分离取上清液；所述提取试剂为体积百分比为70％的甲醇溶液或体积百分比为70％的乙醇溶液。
进一步，所述步骤S2中，质谱测试条件为；
电喷雾离子源；温度500℃～600℃；质谱电压(+)5500V，(-)4500V；气帘气35psi；碰撞诱导电离参数设置为medium；扫描模式为正、负离子扫描；能量碰撞范围为10V～60V。
进一步，所述步骤S2中，色谱的测试条件为：
色谱柱为：C18；流动相：水相为超纯水，有机相为乙腈，均加入体积百分比为0.1％的乙酸；洗脱梯度：0min，体积比为95:5水和乙腈；10.0min，体积比为5:95水和乙腈；11.0min，体积比为5:95水和乙腈；11.1min，体积比为95:5水和乙腈；14.0min，为体积比为95:5水和乙腈；流速0.4ml/min；柱温40℃；进样量2μl。
由上述方法得到的所述代谢物色谱峰值构建的数据库。
上述数据库在测试枸杞组织代谢物的应用，其不同之处在于，所述应用包括枸杞组织代谢物的定量或定性检测。
进一步，所述枸杞组织代谢组学分析方法包括：
步骤A1:收集不同品种枸杞的叶片及果实组织，将不同品种的叶片进行归总，将不同品种果实进行归总，分别进行前处理并加入提取试剂进行提取，得到叶片提取液及果实提取液；
步骤A2:将所述步骤A1得到的提取液进行LC-MS/MS检测；
步骤A3:将所述步骤A2测试枸杞叶片及枸杞果实得到的结果用上述数据库进行差异代谢物分析筛选，分别得到枸杞叶片的特异代谢物及枸杞果实代谢物。
进一步，所述步骤A3中，枸杞叶片特异代谢物如表所示：
Figure GDA0003190365180000031
进一步，所述步骤A4中，枸杞果实特异代谢物如表所示：
Figure GDA0003190365180000041
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：(1)通过前处理方法、质谱方法及色谱方法的相互配合，快速鉴定枸杞叶与枸杞果的大量物质，构建了全面的代谢物数据库；(2)代谢物数据库数据库为后续枸杞代谢物的定性及定量分析提供了方便；(3)枸杞叶与枸杞果的特异代谢物的检测确定，为后续枸杞的代谢研究开发提供物质基础。
附图说明
图1为实施例3确认枸杞叶与枸杞果实代谢物分布概况图；
图2为实施例4枸杞叶与枸杞果实的总离子流图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1
提取方法优化实验及数据
物质的前处理：
本项目样本提取流程如下：
收集不同品种枸杞的叶片及果实组织，将不同品种的叶片进行归总，将不同品种果实进行归总，分别进行前处理并加入提取试剂进行提取叶片样品及果实样品；
(1)样品真空冷冻干燥；
(2)利用研磨仪研磨至粉末状；
(3)称取40mg～50mg的粉末，溶解于体积V＝样本净重(mg)×12μL/mg的提取液中；
(4)将样本与溶剂充分混匀，每管涡旋20s，每隔半小时涡旋一次，共涡旋5次，放4℃冰箱内过夜；
(5)离心(转速12,000rpm，10分钟，4℃)后，吸取上清，用微孔滤膜(0.22μm poresize)过滤样品，并保存于进样瓶中，用于LC-MS/MS分析。
通过以上前处理方法考察不同溶剂对枸杞叶片和果实代谢物的影响，测试的面积结果如下表：
Figure GDA0003190365180000051
Figure GDA0003190365180000061
结论：在采用相同质液谱测试条件下，用体积百分比为70％甲醇溶液配合其余测试最优测试能够最大程度的检测到各种组织的含量。
实施例2
质谱参数确认实验及数据
色谱条件：
(1)色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18 1.8μm，2.1mm*100mm；
(2)流动相：水相为超纯水，有机相为乙腈，均加入体积百分比为0.1％的乙酸；
(3)洗脱梯度：0min水/乙腈(95:5V/V)，10.0min为5:95V/V，11.0min为5:95V/V，11.1min为95:5V/V，14.0min为95:5V/V；
(4)流速0.4ml/min；柱温40℃；进样量2μl。
质谱参数筛选试验：
电喷雾离子源(electrospray ionization，ESI)温度550℃，质谱电压(+)5500V，(-)4500V,气帘气(curtain gas,CUR)35psi，碰撞诱导电离(collision-activateddissociation，CAD)参数设置为medium，扫描模式为正、负离子扫描。在三重四级杆(QQQ)中，每个离子对是根据优化的去簇电压(declustering potential，DP)和碰撞能(collision energy，CE)进行扫描。使用相关代谢物的标品验证代谢物检测的准确性。
当提取液经色谱柱洗脱后，物质进入质谱进行检测。质谱参数的设置对所测物质的峰形有一定的影响。
在实验的过程中，发现可以通过调整各个物质的CE从而达到增加物质在质谱上的响应，从而增加相对含量测量的准确度。在探索中发现，CE范围选取10V～60V中的一个值与对应离子进行优化后进行匹配并配合其余的最优条件，可以使离子的响应程度较大。
如5-Methoxy-N,N-dimethyltryptamine这个物质当CE值为80V时，该物质在质谱里的峰面积为2.36*103，但调节CE值为50V时峰面积增加一个数量级为3.67*104。
质谱检测分析之后，获取质谱文件的代谢数据，以进行后续去重及具有生物学意义的代谢物离子信号筛选。为了筛选具有生物学意义的信号物质，需要对获得的潜在的代谢物离子对信号予以去重，包括去掉碎片离子，Na+、K+修饰离子，同位素离子等，防止重复的离子物质对生物学分析造成干扰。
实施例3
枸杞叶与枸杞果实数据库的构建：
经过实施例2对正负离子的初步筛选以及去重后，采用以下方法构建数据库。
步骤S1:收集20个不同品种枸杞的叶片及果实组织，分别按叶片归总，果实归总，按实施例1方法对叶片样品及果实样品进行提取，得到叶片样品提取液及果实样品提取液；
步骤S2:将所述步骤S1得到的提取液利用UPLC-QTrap6500参照实施例2确认的条件进行LC-MS/MS检测；
步骤S3：解析所述各代谢物的化学结构并定位离子色谱峰；
步骤S4：构建数据库。
共检测出了3448个代谢物色谱峰，在鉴定到的3448个代谢物中，对于已知代谢物搜寻数据库查询文献，进行结构确认并定位离子色谱峰；对于未知代谢物，进行人工解谱确认结构并定位离子色谱峰，最后构建的数据库包括已知代谢物为550个，主要有黄酮类代谢物(77个)、氨基酸及衍生物(73个)、羟基肉桂酰衍生物(58个)、生物碱(53个)等。
实施例4
枸杞叶与枸杞果实的代谢组分析
步骤A1:将20个不同品种的枸杞叶及枸杞果实按实施例1方法进行提取；
步骤A2:按实施例2确认的条件进行LC-MS/MS检测；
得到枸杞叶片的总离子流图与枸杞果实的总离子流图，从总离子流图对比可知，叶片含有的特异代谢物比果实更加丰富。
步骤A3:将所述步骤A2枸杞叶与枸杞果实的测试结果利用实施例3得到的数据库经过峰识别、峰对齐、峰匹配，归一化等，得到物质的保留时间和峰面积，再使用simca 14.0软件计算VIP值，使用excel计算代谢物含量的差异倍数。
差异代谢物的筛选标准为：FC≥2或≤0.5，VIP≥1，分别得到枸杞叶片的特异代谢物如表1所示及枸杞果实代谢物如表2所示。
表1枸杞叶片中特异代谢物数量及类别
Figure GDA0003190365180000081
Figure GDA0003190365180000091
表2枸杞果实中特异代谢物数量及类别
Figure GDA0003190365180000092
Figure GDA0003190365180000101
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种枸杞组织代谢组学分析方法，其特征在于，所述枸杞组织代谢组学分析方法包括：
步骤A1:收集不同品种枸杞的叶片及果实组织，将不同品种的叶片进行归总，将不同品种果实进行归总，分别进行前处理并加入提取试剂进行提取，得到叶片提取液及果实提取液；
步骤A2:将所述步骤A1得到的提取液进行LC-MS/MS检测；
步骤A3:将所述步骤A2测试枸杞叶片及枸杞果实得到的结果用数据库进行差异代谢物分析筛选，分别得到枸杞叶片的特异代谢物及枸杞果实代谢物；
所述数据库包括代谢物色谱峰值，其构建方法为：
步骤S1:收集不同品种枸杞的叶片及果实组织，将不同品种的叶片进行归总，将不同品种果实进行归总，分别进行前处理并加入提取试剂进行提取，得到叶片提取液及果实提取液；
步骤S2:将所述步骤S1得到的提取液进行LC-MS/MS检测并进行数据分析；
步骤S3：解析所述各代谢物的化学结构并定位离子色谱峰；
步骤S4：构建数据库；
所述步骤A3中，枸杞叶片特异代谢物如表所示：
Figure FDA0003190365170000011
Figure FDA0003190365170000021
所述步骤A3中，枸杞果实特异代谢物如表所示：
Figure FDA0003190365170000022
Figure FDA0003190365170000031
2.根据权利要求1所述的枸杞组织代谢组学分析方法，其特征在于，所述步骤S1中提取步骤包括：
将样品依次经过冷冻干燥及研磨后，加入提取液并混合均匀，静置后离心分离取上清液；所述提取试剂为体积百分比为70％的甲醇溶液或体积百分比为70％的乙醇溶液。
3.根据权利要求1所述的枸杞组织代谢组学分析方法，其特征在于，所述步骤S2中，质谱测试条件为；
电喷雾离子源；温度500℃～600℃；质谱电压正电压5500V，质谱电压负电压4500V；气帘气35psi；碰撞诱导电离参数设置为medium；扫描模式为正、负离子扫描；能量碰撞范围为10V～60V。
4.根据权利要求1所述的枸杞组织代谢组学分析方法，其特征在于，所述步骤S2中，色谱的测试条件为：
色谱柱为：C18；流动相：水相为超纯水，有机相为乙腈，均加入体积百分比为0.1％的乙酸；洗脱梯度：0min，体积比为95:5水和乙腈；10.0min，体积比为5:95水和乙腈；11.0min，体积比为5:95水和乙腈；11.1min，体积比为95:5水和乙腈；14.0min，为体积比为95:5水和乙腈；流速0.4ml/min；柱温40℃；进样量2μl。
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