CN112345680A - 一种同时检测灵芝中八个甾醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种同时检测灵芝中八个甾醇的方法，该方法包括如下步骤：灵芝样品的预处理步骤、超高效液相色谱检测步骤、化合物质谱信息获得步骤、超高效液相色谱‑三重四级杆质谱联用分析方法建立步骤、以及数据分析步骤。本发明的同时检测灵芝中八个甾醇的方法可以对灵芝子实体、菌丝体、孢子粉及相关产品中8个甾醇化合物进行准确的定性定量分析，准确性高，灵敏度高，且专属性强，克服了以往化学法和高效液相色谱法的不足。
Description
技术领域
本发明涉及食品药品分析领域，具体的说涉及一种同时检测灵芝中八个甾醇的方法。
背景技术
灵芝是多孔菌科(Polyporaceae)灵芝属(Ganoderma sp.)下多个种的统称，其中赤芝(Ganoderma lucidum或Ganoderma lingzhi)、白肉灵芝(Ganodermaleucocontextum)、无柄灵芝(Ganoderma resinaceum)等种，在民间有作为药材使用的悠久历史，且早已被现代药理研究证实确实具有提高免疫、降血脂、抗肿瘤、保护肝脏等多种功效，是理想的保健产品原料来源。灵芝的子实体、菌丝体和孢子中含有多种甾醇化合物，这些甾醇类化合物与三萜类化合物共同构成了灵芝诸多药理作用的物质基础。目前从灵芝中发现的甾醇已有三十余种，在某些灵芝产品如孢子粉、孢子油中，甾醇类化合物的含量远远高于三萜类化合物。因此在灵芝类产品质量标准研究的过程中，除了应该把三萜的种类和含量作为质量评价指标，甾醇类化合物的种类和含量也应当作为一个重要指标。
目前，关于灵芝中甾醇类化合物的定量分析存在以下问题：灵芝中甾醇化合物种类较多，但在已有的定量方法中，通常只检测麦角甾醇这一种化合物的含量来评价灵芝质量，这种方法缺乏科学的完整性；有些甾醇如过氧麦角甾醇因紫外吸收弱，用紫外检测器无法进行检测；此外，有些甾醇可能会与极性相近的脂肪酸等弱极性物质共流出，使得测定结果出现假阳性。因此，需要开发一种更为精确完整的甾醇检测方法。
发明内容
本发明提供了一种同时检测灵芝中八个甾醇的方法，该方法包括如下步骤：
(1)灵芝样品的预处理步骤，将灵芝样品加入有机溶剂超声提取，取上清液，过滤，得到的滤液稀释后即为待测样品溶液；配制八个甾醇的混合标准品溶液；
(2)超高效液相色谱检测步骤，对待测样品溶液和八个甾醇标准品溶液进行超高效液相色谱分离，以获得较好的分离度；
(3)化合物质谱信息获得步骤，利用质谱优化软件(Agilent Optimizer)，对八个甾醇化合物进行母离子扫描、子离子对的检出以及最佳碰撞能的寻找；
(4)超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用分析方法(DMRM)建立步骤，在数据采集软件(Agilent MassHunter Data Acquisition)中，根据超高效液相色谱条件和三重四级杆质谱检测条件，导入保留时间，母离子、子离子对以及碰撞能数据，建立八个甾醇化合物的DMRM分析测定方法；同时，对八个甾醇的混合标准品溶液和灵芝样品溶液进行上样测定；
(5)数据分析步骤，运用定量分析软件(Agilent MassHunter QuantitativeAnalysis)，创建八个甾醇化合物的标准曲线，对所建方法进行方法学验证，并对灵芝样品溶液进行定量分析；
优选的，步骤(1)中灵芝样品的预处理步骤为：
所用浸提液为甲醇、乙醇中的一种，优选甲醇；
提取方法为超声提取或60℃加热提取，优选超声提取；
提取时间为10-90min，优选60min；
料液比为1∶20--1∶40，优选1∶30(重量g：体积mL)；
浸提次数包括一次性浸提或反复浸提，优选一次；
溶液用0.20μm孔径的有机相微孔滤膜过滤；
溶液过滤后再用质谱级甲醇稀释10倍即获得待测样品溶液；
其中待测样品为灵芝子实体、菌丝体、孢子粉以及相关产品(包含但不限于子实体和菌丝体的提取物、破壁孢子粉、孢子油)
优选的，步骤(1)中灵芝中八个甾醇化合物标准品混合溶液的配制方法为，分别精密称取3，5，9-三羟基麦角甾-7，22-二烯-6-酮、啤酒甾醇、过氧麦角甾醇、麦角甾4，6，8(14)，22-四烯-3酮、麦角甾醇、星鱼甾醇、6-O-甲基啤酒甾醇、β-谷甾醇八个化合物，用色谱级甲醇配制成50μg/mL的混合标准溶液(其中每个化合物的浓度为50μg/mL)，再逐级稀释成10μg/mL、5μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、500ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、20ng/mL的混合标准溶液；
优选的，步骤(2)中超高效液相色谱分离的色谱条件为：选用InfinityLabPoroshell 120 Bonus-RP色谱柱(2.7μm，2.1×100mm)，检测波长：280nm。柱温：35℃，上样量：5uL，流速：0.5mL/min。流动相：甲醇(A)-0.01％醋酸水(B)；梯度洗脱：0min，80％A，20％B；10min，90％A，100％B；13.5min，100％A，0％B。
优选的，通过质谱优化软件(Agilent Optimizer)，获得步骤(3)中分析所需的各化合物的保留时间、母离子、子离子对及碰撞能信息如下：
3，5，9-三羟基麦角甾-7，22-二烯-6-酮(3，5，9-Trihydroxyergosta-7，22-dien-6-one，C28H44O4，化合物1)：保留时间：0.67min；母离子：445；定量离子：349.2，碰撞能：21；定性离子：367.2，碰撞能：17；
啤酒甾醇(cerevisterol，C28H46O3，化合物2)：保留时间：2.39min；母离子：377；定量离子：157.1，碰撞能：33；定性离子：69.3，碰撞能37；
过氧麦角甾醇(ergosterol peroxide，C28H44O3，化合物3)：保留时间：3.42min；母离子：395；定量离子：69.2，碰撞能：29；定性离子：41.3，碰撞能：65；
麦角甾4，6，8(14)，22-四烯-3酮(ergosta-4，6，8(14)，22-tetraen-3-one，C28H40O，化合物4)：保留时间：5.61min；母离子：393；定量离子：268.3，碰撞能：21；定性离子：69.2，碰撞能：37；
麦角甾醇(ergosterol，C28H44O，化合物5)：保留时间：7.12min；母离子：379；定量离子：69.2，碰撞能：21；定性离子：57.5，碰撞能：17；
星鱼甾醇(stellasterol，C28H46O，化合物6)：保留时间：7.69min；母离子：381；定量离子：69.2，碰撞能：38；定性离子：55.0，碰撞能：60；
6-0-甲基啤酒甾醇(6-o-methylcerevisterol，C29H48O3，化合物7)：保留时间：8.51min；母离子：409；定量离子：191.3，碰撞能：17；定性离子：109.2，碰撞能：17；
β-谷甾醇(β-sitosterol，C29H50O，化合物8)：保留时间：9.46min；母离子：397；定量离子：161.1，碰撞能：25；定性离子：95.1，碰撞能：25。
优选的，步骤(4)中，以超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用为分析检测仪器，液相色谱条件为：选用InfinityLab Poroshell 120 Bonus-RP色谱柱(2.7μm，2.1×100mm)，检测波长：280nm。柱温：35℃，上样量：5uL，流速：0.5mL/min。流动相：甲醇(A)-0.01％醋酸水(B)；梯度洗脱：0min，80％A，20％B；10min，90％A，100％B；13.5min，100％A，0％B。质谱条件为：选用大气压化学电离源(APCI)，检测在正离子模式下进行，选用动态多反应监测(DMRM)，毛细管电压：3500V，毛细管出口电压：380V，电晕针电流：8μA，干燥气温度：290℃，干燥气流速：13mL/min，气化室温度：350℃，雾化气压力：30psi。
本发明的同时检测灵芝子实体、菌丝体、孢子粉及相关产品中八个甾醇化合物的依据是：采用超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用检测时，灵芝子实体、菌丝体、孢子粉及相关产品中八个甾醇化合物不但要满足保留时间一致，还必须在特定质谱条件下满足一级母子和二级子离子对均符合检测参数，才能对该化合物进行精确定量分析。
本发明的有益效果是：本发明的技术方案不仅可以通过保留时间对待测物质进行定性，还可以凭借待测物质的母离子和定量、定性子离子对其进行精确的定性和定量，对灵芝(Ganoderma sp.)子实体、菌丝体、孢子粉及相关产品中八个甾醇化合物进行准确的定性定量分析，准确性高，灵敏度高，且专属性强，克服了以往检测方法的不足。
附图说明
图1、灵芝中八个甾醇化合物结构式图
图2、灵芝中八个甾醇化合物总离子流图
其中，化合物1：3，5，9-三羟基麦角甾-7，22-二烯-6-酮(3，5，9-Trihydroxyergosta-7，22-dien-6-one)，
化合物2：啤酒甾醇(cerevisterol)，
化合物3：过氧麦角甾醇(ergosterol peroxide)，
化合物4：麦角甾4，6，8(14)，22-四烯-3酮(ergosta-4，6，8(14)，22-tetraen-3-one)，
化合物5：麦角甾醇(ergosterol)，
化合物6：星鱼甾醇(stellasterol)，
化合物7：6-O-甲基啤酒甾醇(6-o-methylcerevisterol)，
化合物8：β-谷甾醇(β-sitosterol)
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，但不作为对本发明方案的限定，不能以此限定本发明的保护范围，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属于本发明的涵盖范围。
仪器与材料：
超高效液相色谱仪(Agilent LC1290 infinity II，美国安捷伦公司)，
三重四级杆质谱仪(Agilent 6495，美国安捷伦公司)，
超声波清洗器(KQ2200E，昆山市超声仪器有限公司)，
电子天平(FA2004A，上海精密科学仪器有限公司)，
有机滤膜(0.20μm，美国安捷伦公司)，
质谱级甲醇、乙腈和水均购自美国merk公司。
八个甾醇化合物的标准品：化合物1：3，5，9-三羟基麦角甾-7，22-二烯-6-酮(3，5，9-Trihydroxyergosta-7，22-dien-6-one)，化合物2：啤酒甾醇(cerevisterol)，化合物3：过氧麦角甾醇(ergosterol peroxide)，化合物4：麦角甾4，6，8(14)，22-四烯-3酮(ergosta-4，6，8(14)，22-tetraen-3-one)，化合物5：麦角甾醇(ergosterol)，化合物6：星鱼甾醇(stellasterol)，化合物7：6-O-甲基啤酒甾醇(6-o-methylcerevisterol)，化合物8：β-谷甾醇(β-sitosterol)。以上化合物均购自武汉琼格生物科技有限公司，纯度≥95％。
待测灵芝子实体、菌丝体、孢子粉的拉丁名及来源如下：
样品1：白肉灵芝子实体，Ganoderma leucocontextum，来自西藏曲水地区；
样品2：白肉灵芝子实体，Ganoderma leucocontextum，来自西藏包河地区；
样品3：赤芝子实体，Ganoderma lucidum，来自斯洛伐克Nitra镇；
样品4：无柄灵芝子实体，Ganoderma resinaceum，来自斯洛伐克Topolcianky镇；
样品5：赤芝菌丝体，Ganoderma lucidum，来自斯洛伐克Nitra镇；
样品6：无柄灵芝菌丝体，Ganoderma resinaceum，来自斯洛伐克Topolcianky镇；
样品7：赤芝菌丝体，Ganoderma lingzhi，来自上海市农业科学院；
样品8：赤芝菌丝体，Ganoderma lingzhi，来自上海市农业科学院；
样品9：赤芝孢子粉，Ganoderma lingzhi，来自吉林地区；
样品10：赤芝孢子粉，Ganoderma lingzhi，来自吉林地区；
样品11：赤芝子实体，Ganoderma lingzhi，来自上海市农业科学院。
实施例1检测方法的建立
1.样品预处理步骤：将灵芝子实体(或菌丝体、或孢子粉，菌种来源为Ganodermalucidum、Ganoderma lingzhi、Ganoderma leucocontextum和Ganoderma resinaceum)样品0.50g，按照1∶30(重量体积比，重量g：体积ml)的料液比加入甲醇15mL，超声提取60min后，取上清液，过0.20μm有机滤膜后用质谱级甲醇稀释10倍(10倍体积)后作为待测样品溶液。
其中，混合标准溶液的准备：取八个甾醇化合物标准品，分别准确称取1.00mg用质谱级甲醇溶解，配制成1mg/mL的单标样品溶液，再分别用质谱级甲醇稀释至0.5mg/mL，各取100μL混合稀释成50μg/mL的混合标准溶液，再逐级稀释成10μg/mL、5μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、500ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、20ng/mL的混合标准溶液，放置4℃冰箱保存。
2.超高效液相色谱检测步骤：对待测样品溶液和八个甾醇化合物标准品进行超高效液相色谱分离，以获得较好的分离度；
其中，超高效液相条件：InfinityLab Poroshell 120 Bonus-RP色谱柱(2.7μm，2.1×100mm)，检测波长：280nm。柱温：35℃，上样量：5uL，流速：0.5mL/min。流动相：甲醇(A)-0.01％醋酸水(B)。梯度洗脱程序：0min，80％A，20％B；10min，90％A，10％B；13.5min，100％A，0％B。
3.化合物质谱信息获得步骤：将八个甾醇化合物标准品分别配制成5ppm的甲醇溶液，在正离子模式下确认了8种甾醇的母离子信息，通过Agilent Optimizer软件在确定母离子的情况下，自动优化子离子以及碰撞能。
3，5，9-三羟基麦角甾-7，22-二烯-6-酮(3，5，9-Trihydroxyergosta-7，22-dien-6-one，C28H44O4，化合物1)：保留时间：0.67min；母离子：445；定量离子：349.2，碰撞能：21；定性离子：367.2，碰撞能：17；
啤酒甾醇(cerevisterol，C28H46O3，化合物2)：保留时间：2.39min；母离子：377；定量离子：157.1，碰撞能：33；定性离子：69.3，碰撞能37；
过氧麦角甾醇(ergosterol peroxide，C28H44O3，化合物3)：保留时间：3.42min；母离子：395；定量离子：69.2，碰撞能：29；定性离子：41.3，碰撞能：65；
麦角甾4，6，8(14)，22-四烯-3酮(ergosta-4，6，8(14)，22-tetraen-3-one，C28H40O，化合物4)：保留时间：5.61min；母离子：393；定量离子：268.3，碰撞能：21；定性离子：69.2，碰撞能：37；
麦角甾醇(ergosterol，C28H44O，化合物5)：保留时间：7.12min；母离子：379；定量离子：69.2，碰撞能：21；定性离子：57.5，碰撞能：17；
星鱼甾醇(stellasterol，C28H46O，化合物6)：保留时间：7.69min；母离子：381；定量离子：69.2，碰撞能：38；定性离子：55.0，碰撞能：60；
6-0-甲基啤酒甾醇(6-o-methylcerevisterol，C29H48O3，化合物7)：保留时间：8.51min；母离子：409；定量离子：191.3，碰撞能：17；定性离子：109.2，碰撞能：17；
β-谷甾醇(β-sitosterol，C29H50O，化合物8)：保留时间：9.46min；母离子：397；定量离子：161.1，碰撞能：25；定性离子：95.1，碰撞能：25。
4.超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用定量分析方法的建立：在数据采集软件(Agilent MassHunter Data Acquisition)中超高效液相色谱和三重四级杆质谱参数设定条件下，将质谱采集方式改为多反应监测(MRM)，再将化合物的母离子信息、定量和定性的子离子对信息、碰撞能等信息导入检测方法中，取混合标准品溶液上样，运行程序后将采集模式更新为动态多反应监测(DMRM)。
其中，超高效液相色谱条件：InfinityLab Poroshell 120 Bonus-RP色谱柱(2.7μm，2.1×100mm)，检测波长：280nm。柱温：35℃，上样量：5uL，流速：0.5mL/min。流动相：甲醇(A)-0.01％醋酸水(B)。梯度洗脱程序：0min，80％A，20％B；10min，90％A，10％B；13.5min，100％A，0％B。
其中，三重四级杆质谱条件：大气压化学电离源(APCI)作为离子源，检测在正离子模式下进行，选用动态多反应监测(DMRM)，毛细管电压：3500V，毛细管出口电压：380V，电晕针电流：8μA。干燥气温度：290℃，干燥气流速：13mL/min，气化室温度：350℃，雾化气压力：30psi。
5.检测限和定量限：基于响应值标准偏差和标准曲线的斜率计算检测限(LOD)和定量限(LOQ)。其中：LOD＝3σ/S，LOQ＝10σ/S，σ：响应值的标准偏差，S：标准曲线的斜率，响应值的标准偏差为标准曲线的剩余标准偏差。
6.标准曲线制定：取已经配制好的10μg/mL、5μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、500ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、20ng/mL的混合标准品溶液按照上述优化的液相和质谱条件上样，以横坐标为化合物的浓度，纵坐标为化合物的定量离子响应值，制作定量标准曲线见表1。
实施例2
方法学验证和结果检测：方法学验证参照实验室质量控制规范食品理化检测标准以及药典相关规定。
1精密度：配制八个甾醇化合物的混合标准品溶液一份，在同一天内重复进样6次，根据标准曲线计算6次实验所得八种甾醇的浓度，计算日内精密度。取该混合标准溶液稀释一倍，连续三天，每天进样两次，根据6次实验的结果计算日间精密度。结果表明，8个甾醇化合物的日内精密度和日间精密度测定结果的RSD均小于15.00％说明该方法的日内和日间精密度良好。具体结果分别见表2和表3。
2稳定性：取待测样品11(赤芝子实体，Ganoderma lingzhi)，按照实施例1的样品预处理步骤提取后，配制待测样品溶液一份，分别在0h、2h、4h、6h、8h、12h、24h、48h进样测定，根据8次实验的结果计算样品稳定性。结果证实，八个甾醇化合物的的RSD均小于15.00％，说明样品在48小时内性质稳定。具体结果见表4。
3重复性：取待测样品11，平行称取6份，分别按照实施例1的预处理步骤提取后配制为待测样品溶液，进样测定，根据6次的实验结果计算样品重复性。结果证实，八个甾醇化合物的的RSD均小于15.00％，说明样品重复性良好。具体结果见表5。
4回收率：取已知浓度的待测样品，加入混合标准溶液样品，混匀后重复上样三次，计算样品回收率。
回收率％＝(实测值-供试样品中所含被测成分量)/加入对照品量×100％
回收率的具体结果见表6。结果证实，八个甾醇化合物在样品内的回收率RSD均在15.00％以内，符合方法要求。
5结果检测：取10个灵芝子实体、菌丝体和孢子粉样品(样品1：白肉灵芝子实体，Ganoderma leucocontextum，来自西藏曲水地区；样品2：白肉灵芝子实体，Ganodermaleucocontextum，来自西藏包河地区；样品3：赤芝子实体，Ganoderma lucidum，来自斯洛伐克Nitra镇；样品4：无柄灵芝子实体，Ganoderma resinaceum，来自斯洛伐克Topolcianky镇；样品5：赤芝菌丝体，Ganoderma lucidum，来自斯洛伐克Nitra镇；样品6：无柄灵芝菌丝体，Ganoderma resinaceum，来自斯洛伐克Topolcianky镇；样品7：赤芝菌丝体，Ganodermalingzhi，来自上海市农业科学院；样品8：赤芝菌丝体，Ganoderma lingzhi，来自上海市农业科学院；样品9：赤芝孢子粉，Ganoderma lingzhi，来自吉林地区；样品10：赤芝孢子粉，Ganoderma lingzhi，来自吉林地区)。按照实施例1的检测方法，分别进行检测，具体检测结果见表7。
从该结果可以看出，八个甾醇化合物在不同种的灵芝子实体、菌丝体和孢子粉中均有检出，其中化合物5(麦角甾醇)和化合物6(星鱼甾醇)在子实体、菌丝体和孢子粉中含量均较高，是灵芝中的主要甾醇成分。此结果证实，八个甾醇化合物适合用于多种灵芝子实体、菌丝体和孢子粉中甾醇类成分的检测分析。
表1、灵芝中8个甾醇化合物定量分析标准曲线及参数
表2、日内精密度结果
表3、日间精密度结果
表4、样品稳定性结果
表5、样品重复性结果
表6、样品回收率结果
表7、样品测定结果
Claims (6)
1.一种同时检测灵芝中八个甾醇的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
(1)灵芝样品的预处理步骤：将灵芝样品加入有机溶剂超声提取，取上清液，过滤，得到的滤液稀释后即为待测样品溶液；配制八个甾醇的混合标准品溶液；
(2)超高效液相色谱检测步骤：对待测样品溶液和八个甾醇标准品溶液进行超高效液相色谱分离，以获得较好的分离度；
(3)化合物质谱信息获得步骤，利用质谱优化软件Agilent Optimizer，对八个甾醇化合物进行母离子扫描、子离子对的检出以及最佳碰撞能的寻找；
(4)超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用分析方法DMRM建立步骤：在数据采集软件Agilent MassHunter Data Acquisition中，在超高效液相色谱分析条件和三重四级杆质谱检测条件下，导入保留时间，母离子、子离子对以及碰撞能数据，建立八个甾醇化合物的DMRM分析测定方法；同时，对八个甾醇的混合标准品溶液和样品溶液进行上样测定；
(5)数据分析步骤：运用定量分析软件Agilent MassHunter Quantitative Analysis，创建八个甾醇化合物的标准曲线，对所建方法进行方法学验证，并对灵芝样品溶液进行定量分析。
2.根据权利要求1所述的同时检测灵芝中八个甾醇的方法，其特征在于其中步骤(1)中灵芝样品的预处理步骤为：
所用浸提液为甲醇、乙醇中的一种；
提取方法为超声提取或60℃加热提取；
提取时间为10-90min；
料液比为1∶20--1∶40，重量g：体积ml；
浸提次数包括一次性浸提或反复浸提；
溶液用0.20μm孔径的有机相微孔滤膜过滤；
溶液过滤后再用质谱级甲醇稀释10倍即获得待测样品溶液；
其中待测样品为灵芝子实体、菌丝体、孢子粉以及相关产品。
3.根据权利要求1所述的同时检测灵芝中八个甾醇的方法，其特征在于其中步骤(1)中灵芝中8个甾醇化合物标准品混合溶液的配制方法为：分别精密称取8个甾醇化合物标准品，用色谱级甲醇配制成50μg/mL的混合标准溶液，再逐级稀释成10μg/mL、5μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、500ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、20ng/mL的混合标准溶液。
4.根据权利要求1所述的同时检测灵芝中八个甾醇的方法，其特征在于其中步骤(2)中的色谱条件为：选用InfinityLab Poroshell 120Bonus-RP色谱柱，2.7μm，2.1×100mm，检测波长：280nm。柱温：35℃，上样量：5uL，流速：0.5mL/min。流动相：甲醇(A)-0.01％醋酸水(B)；梯度洗脱：0min，80％A，20％B；10min，90％A，10％B；13.5min，100％A，0％B。
5.根据权利要求1所述的同时检测灵芝中八个甾醇的方法，其特征在于其中通过质谱优化软件Agilent Optimizer，获得步骤(3)中分析所需的各化合物的保留时间、母离子、子离子对及碰撞能信息如下：
3，5，9-三羟基麦角甾-7，22-二烯-6-酮：保留时间：0.67min；母离子：445；定量离子：349.2，碰撞能：21；定性离子：367.2，碰撞能：17；
啤酒甾醇：保留时间：2.39min；母离子：377；定量离子：157.1，碰撞能：33；定性离子：69.3，碰撞能37；
过氧麦角甾醇：保留时间：3.42min；母离子：395；定量离子：69.2，碰撞能：29；定性离子：41.3，碰撞能：65；
麦角甾4，6，8(14)，22-四烯-3酮：保留时间：5.61min；母离子：393；定量离子：268.3，碰撞能：21；定性离子：69.2，碰撞能：37；
麦角甾醇：保留时间：7.12min；母离子：379；定量离子：69.2，碰撞能：21；定性离子：57.5，碰撞能：17；
星鱼甾醇：保留时间：7.69min；母离子：381；定量离子：69.2，碰撞能：38；定性离子：55.0，碰撞能：60；
6-0-甲基啤酒甾醇：保留时间：8.51min；母离子：409；定量离子：191.3，碰撞能：17；定性离子：109.2，碰撞能：17；
β-谷甾醇：保留时间：9.46min；母离子：397；定量离子：161.1，碰撞能：25；定性离子：95.1，碰撞能：25。
6.根据权利要求1所述的同时检测灵芝中八个甾醇的方法，其特征在于其中步骤(4)中，以超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用为分析检测仪器，色谱条件为：选用InfinityLab Poroshell 120Bonus-RP色谱柱，2.7μm，2.1×100mm，检测波长：280nm。柱温：35℃，上样量：5uL，流速：0.5mL/min；流动相：甲醇(A)-0.01％醋酸水(B)；梯度洗脱：0min，80％A，20％B；10min，90％A，10％B；13.5min，100％A，0％B；质谱条件为：选用大气压化学电离源APCI，检测在正离子模式下进行，选用动态多反应监测DMRM，毛细管电压：3500V，毛细管出口电压：380V，电晕针电流：8μA，干燥气温度：290℃，干燥气流速：13mL/min，气化室温度：350℃，雾化气压力：30psi。
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