CN111579662A - 一种灵芝孢子粉及其产品中甾醇和脂肪酸类成分的hplc测定方法 - Google Patents

一种灵芝孢子粉及其产品中甾醇和脂肪酸类成分的hplc测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了运用蒸发光散射检测器通过高效液相色谱仪建立灵芝孢子粉及其产品中甾醇和脂肪酸成分的分析测定方法。涉及样品提取条件的优化、色谱柱的选择、色谱条件的优化、检测器参数的优化等，同时对建立的方法进行了方法学验证。本发明建立的灵芝孢子粉及其产品中甾醇和脂肪酸成分的HPLC测定方法，应用广泛、方法准确度高、特异性强。

Description

一种灵芝孢子粉及其产品中甾醇和脂肪酸类成分的HPLC测定 方法
技术领域
本发明涉及药物分析领域，具体是建立一种灵芝孢子粉及其产品中甾醇和脂肪酸类成分的HPLC测定方法。
背景技术
灵芝是一种药用价值很高的名贵真菌，灵芝孢子是灵芝生长成熟期从菌褶弹射出来的卵形生殖细胞，含有脂肪酸类、三萜酸类、甾醇、多糖、核苷、生物碱等多种化学成分。灵芝孢子粉具有免疫调节、抗肿瘤、抗炎等多种生物活性，越来越多地被用于保健和医药产品之中。近年来，随着孢子粉收集和破壁技术的发展，灵芝孢子粉的药理作用已经受到消费者的广泛认可，目前灵芝孢子粉保健食品的市场占有率非常高，主要以灵芝孢子粉散剂和灵芝孢子油胶囊为主。
现有的关于灵芝孢子粉的质量评价标准比较缺乏，常用灵芝子实体中的活性成分三萜或多糖作为质控指标，大量的研究已经证明，子实体中相关成分的测定方法并不适合灵芝孢子粉的测定，结果偏差大、呈现假阳性。为了更客观的评价和反映各种因素等对灵芝孢子粉的质量影响、控制其产品质量、规范产品优劣等级，亟需寻找更多可评价灵芝孢子粉质量的指标性成分，并建立相应的分析定量方法，为灵芝孢子粉及其产品的质量评价提供依据。
灵芝孢子粉中脂溶性成分的含量高于20％，主要包括甘油三酯类化合物、游离脂肪酸、甾醇、脂溶性维生素和极微量的三萜类成分等。有学者认为，灵芝孢子粉尤其是灵芝孢子油产品的药理作用与其含有丰富的脂肪酸特别是不饱和脂肪酸如油酸、亚油酸有密切关系。另有研究表明，甾醇的抗肿瘤作用不容忽视，已有多种甾醇类单体成分报道具有抗肿瘤活性，如麦角甾醇、过氧化麦角甾醇等。除麦角甾醇外，多数甾醇和游离脂肪酸类成分均没有紫外吸收，目前甾醇的测定常将样品进行皂化或衍生化处理后通过气相色谱-质谱联用(GC-MS)进行测定，测定方法繁琐、副反应问题多，且设备昂贵、使用普及率低。本发明克服了现有甾醇及脂肪酸类分析方法的局限性，运用蒸发光散射检测器，通过高效液相色谱法对灵芝孢子粉及其产品中的甾醇和脂肪酸成分的含量进行测定，方法简单、成本低、适用范围广、准确度高、特异性强，为评价灵芝孢子粉及其产品的质量提供科学依据。
发明内容
本发明的目的是克服现有甾醇及脂肪酸类分析方法的局限性，提供一种分析成本低、适用范围广、准确度高、特异性强的灵芝孢子粉及其产品中甾醇和脂肪酸类成分的HPLC测定方法。
本发明涉及一种灵芝孢子粉及其产品中甾醇和脂肪酸类成分的HPLC测定方法，包括如下步骤：将灵芝孢子粉及其产品加入溶剂提取后，运用蒸发光散射检测器，通过高效液相色谱法对灵芝孢子粉及其产品中的甾醇和脂肪酸成分的含量进行测定。
本发明一种灵芝孢子粉及其产品中甾醇和脂肪酸类成分的HPLC测定方法，具体操作过程包括以下步骤：
(1)灵芝孢子粉及其产品的预处理步骤，将灵芝孢子粉或相关产品加入溶剂浸提，得到浸提液，离心，取上清液，经过滤后得到待测样品溶液；
(2)高效液相色谱检测步骤：采用蒸发光散射检测器，通过高效液相色谱仪对待测样品溶液进行高效液相色谱分析；
(3)指标成分是甾醇和脂肪酸类成分：其中甾醇类成分为啤酒甾醇、麦角甾醇过氧化物、麦角甾醇和星鱼甾醇；脂肪酸类成分为油酸、亚油酸、棕榈酸。
具体地，本发明涉及灵芝孢子粉及其产品的预处理步骤，浸提方法包括以下步骤：所用浸提溶剂为乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、正己烷、石油醚、异丙醇、己烷：异丙醇(V/V＝3：2)、己烷：乙醇(V/V＝1：1)中的一种；提取方式为超声提取、加热震荡提取，优选超声提取；提取时间为10-90min，优选30min；料液比为1：10-1：50，其中孢子粉样品优选1：10，孢子油样品优选1：30；浸提次数包括一次浸提或反复浸提。
浸提液的处理包括以下步骤：提取完成后，浸提液冷却至室温，摇匀，先经12000r/min离心5min，取上清液，用0.22μm微孔有机相滤膜过滤，备用。
进一步，本发明一种灵芝孢子粉及其产品中甾醇和脂肪酸类成分的HPLC测定方法，设计的高效液相色谱法包括以下步骤：
检测器为蒸发光散射检测器；色谱柱为反相C18色谱柱，流动相溶液成分为乙腈-甲醇-水-异丙醇四相梯度洗脱，其中水中冰醋酸的浓度为0.00％-0.02％，优选0.01％；柱温为20-40℃，优选30℃；流速0.8-1.2ml/min，优选1.0ml/min；进样体积为5-50μL，优选20μL。色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱或Agilent ZORBAXEclipse Plus-C18(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱。
具体地，蒸发光散射检测器的设定包括以下参数：
增益为100-1000，优选500；气体压力为20-40psi，优选25psi；漂移管温度为50-80℃，优选60℃；喷雾器模式为加热模式，加热功率为50％-80％，优选65％。
进一步地，流动相的洗脱程序为：
(A)乙腈+(B)水+(C)甲醇+(D)异丙醇(V/V/V/V)＝100％(体积)
0→10min，A/B/C/D＝40/0/60/0→A/B/C/D＝60/0/40/0；
10→25min，A/B/C/D＝60/0/40/0→A/B/C/D＝68/0/32/0；
25→32min，A/B/C/D＝68/0/32/0→A/B/C/D＝60/20/20/0；
32→40min，A/B/C/D＝60/20/20/0→A/B/C/D＝80/20/0/0；
40→55min，A/B/C/D＝80/20/0/0→A/B/C/D＝100/0/0/0；
55→65min，A/B/C/D＝100/0/0/0→A/B/C/D＝100/0/0/0；
65→67min，A/B/C/D＝100/0/0/0→A/B/C/D＝20/0/0/80；
67→80min，A/B/C/D＝20/0/0/80→A/B/C/D＝20/0/0/80；
80→82min，A/B/C/D＝20/0/0/80→A/B/C/D＝40/0/60/0；
82→95min，A/B/C/D＝40/0/60/0→A/B/C/D＝40/0/60/0。
本发明一种灵芝孢子粉及其产品中甾醇和脂肪酸类成分的HPLC测定方法，所述高效液相色谱法还包括以下具体步骤：
1)系列标准品溶液的配制：用甲醇配制含有所述4种甾醇化合物和3种脂肪酸类成分各适量的混合标准品溶液，并依次用甲醇稀释成系列浓度梯度，备用。
2)各待测组分的定性：将各甾醇及脂肪酸类成分单组分及混合标准品溶液进行HPLC分析，根据各单组分的保留时间定性；
3)标准曲线的绘制：取步骤1)中的系列标准品溶液，按照本发明所述色谱条件进行测定，计算峰面积，以各标准品质量浓度的对数(lgC)为横坐标，以峰面积的对数(lgA)为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程。
附图说明
图1、洗脱程序优化前连续进样分析的HPLC图谱
图2、灵芝孢子油样品的HPLC图谱(局部放大)
图3、灵芝孢子油样品完整洗脱程序(乙腈-水-甲醇-异丙醇)下的HPLC图谱图2的解释：在图2中，1-7分别代表：1、啤酒甾醇；2、亚油酸；3、棕榈酸；4、油酸；5、麦角甾醇过氧化物；6、麦角甾醇；7、星鱼甾醇。
表1、乙腈-水-甲醇-异丙醇梯度洗脱程序
Figure BDA0002485372460000041
表2-1、各待测组分的方法学数据
Figure BDA0002485372460000042
Figure BDA0002485372460000051
表2-2、各待测组分的方法学数据
Figure BDA0002485372460000052
表3、破壁孢子粉样品中甾醇和脂肪酸的含量(n＝2,mg/g)
Figure BDA0002485372460000053
表4、孢子油样品中甾醇和脂肪酸的含量(n＝2,mg/g)
Figure BDA0002485372460000054
具体实施方式
下面通过附图和具体实施例对本发明作进一步阐述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属于本发明的涵盖范围。
本发明一种灵芝孢子粉及其产品中甾醇和脂肪酸类成分的HPLC测定方法的仪器与试剂
1、主要仪器：
Waters e2695高效液相色谱仪、Waters2424蒸发光散射检测器，美国Waters公司；ZORBAX SB-C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱、ZORBAXEclipse Plus-C18(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱，安捷伦科技有限公司；KQ-2200E型超声清洗器(工作功率100W，频率40kHz)，昆山市超声仪器有限公司；MS105DU电子分析天平，瑞士Metter Toledo公司；可试氮气吹扫仪，上海乔跃电子有限公司；RVC2-25 CA plus真空离心浓缩仪，德国MartinChrist公司。
2、主要试剂：
分析纯级乙醇、甲醇、乙酸乙酯、正己烷、石油醚、丙酮、异丙醇、冰醋酸均为国药集团化学试剂有限公司；高效液相用乙腈、甲醇、异丙醇购自德国默克集团；水为超纯水，由ELGA PureLab Ultra纯水仪制备；
对照品：啤酒甾醇、麦角甾醇过氧化物、星鱼甾醇、麦角甾醇均由本实验室分离纯化所得，各组分的纯度经HPLC-ELSD检测均在95％以上；油酸、亚油酸、棕榈树均购自Sigma-aldrich公司，纯度≥99％。
实施例1高效液相色谱条件的优化
供试品溶液的制备：以灵芝孢子油为材料，以无水乙醇为提取溶剂，按料液比1：30对孢子油进行超声提取，先经12 000r/min离心5min，取上清液，用0.22μm微孔有机相滤膜过滤，即得供试品溶液。
初始参考文献中麦角甾醇的分析方法，采用甲醇-水作为流动相进行梯度洗脱，连续进样后发现色谱图出峰异常(见图1)，考虑为孢子油中弱极性脂溶性成分含量较多，大量的弱极性成分吸附在色谱柱上难以完全洗脱，残留的样品在色谱柱上累积，并在后续样品的分析时过载溢出。因此，需要进一步选择洗脱能力更强的洗脱剂和保留强度合适的色谱柱，经过试剂、色谱柱的筛选和洗脱程序的优化，在柱洗脱过程中加入洗脱能力更强的异丙醇来清洗柱子，有效地防止了样品的残留污染，最终确定最佳的色谱条件为：选用ZORBAXSB-C18(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱，以(A)乙腈+(B)水+(C)甲醇+(D)异丙醇(V/V/V/V)＝100％(体积)为流动相进行梯度洗脱(见表1)，流速1.0mL/min，在该色谱条件下，4个甾醇、油酸、亚油酸、棕榈酸均达到较好的分离度，色谱重现性高(见图2)，且从完整洗脱程序的图谱(见图3)中可以看出，异丙醇洗脱段有大量的弱极性成分洗脱流出，经验证当次进样不会给后续进样造成干扰，极大的减少了样品对色谱柱的污染，提高了试验的重复性和可持续性。
实施例2蒸发光散射检测器参数的优化
供试品溶液的制备：以破壁孢子粉为材料，以无水乙醇为提取溶剂，按料液比1：10对孢子粉进行超声提取，先经12000r/min离心5min，取上清液，用0.22μm微孔有机相滤膜过滤，即得供试品溶液。
供试品溶液按优化好的色谱条件进样分析，优化蒸发光散射检测器的各项参数，根据信号响应强度、基线噪音大小、样品分析的重复性，确定检测器的最佳设定参数为：增益为500；气体压力为25psi；漂移管温度为60℃；喷雾器模式为加热模式，加热功率为65％。
实施例3灵芝孢子粉及其产品提取溶剂的优化工艺
以破壁孢子粉为材料，分别选用乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、正己烷、石油醚、异丙醇、己烷：异丙醇(V/V＝3：2)、己烷：乙醇(V/V＝1：1)为提取溶剂，按料液比1：10对孢子粉进行提取，浸提液冷却至室温，摇匀，先经12000r/min离心5min，取上清液，用0.22μm微孔有机相滤膜过滤，即得供试品溶液。进行HPLC比较分析，优选乙醇作为提取溶剂。
实施例4灵芝孢子粉及其产品提取时间的优化
以破壁孢子粉为材料，以乙醇为提取溶剂，按料液比1：10对孢子粉进行超声提取，提取时间分别设定为10min、30min、60min、90min，浸提液冷却至室温，摇匀，先经12 000r/min离心5min，取上清液，用0.22μm微孔有机相滤膜过滤，进行HPLC比较分析，最终优选灵芝孢子粉及其产品的提取时间为30min。
实施例5一种灵芝孢子粉及其产品中甾醇和脂肪酸类成分的HPLC测定方法的方法学验证
(1)供试品溶液的制备：
以破壁孢子粉为材料，以乙醇为提取溶剂，按料液比1：10对孢子粉进行超声提取30min，浸提液冷却至室温，摇匀，先经12000r/min离心5min，取上清液，用0.22μm微孔有机相滤膜过滤，即得供试品溶液。
(2)对照品溶液的配制：
精密称取上述标准品啤酒甾醇、麦角甾醇过氧化物、麦角甾醇、星鱼甾醇、油酸、亚油酸、棕榈酸，其中甾醇类分别加甲醇配制成1mg/mL的标准品储备液、脂肪酸类成分分别加甲醇配制成5mg/mL的标准品储备液。精密吸取适量各标准品储备液，制成混合标准品溶液，摇匀，并稀释成6个系列浓度混合标准品溶液，备用。
(3)方法学验证
1)线性关系：取上述步骤(2)中的系列浓度标准品溶液，按优化后的色谱条件依次进样分析，记录峰面积。以各标准品质量浓度的对数(lgC)为横坐标，以峰面积的对数(lgA)为纵坐标，绘制标准曲线，得到各对照品组分的线性回归方程和线性范围。结果见表2，各待测组分在线性范围内相关系数均大于0.996，线性关系良好。
2)精密度试验：取上述步骤(2)中的同一混合对照品溶液，连续进样6次，计算每次测得的各对照品峰面积的R.S.D.，考察仪器精密度，结果见表2，各R.S.D.均小于3.5％，表明仪器精密度良好。
3)重复性试验：取同一破壁孢子粉样品，精密称取6份，按上述步骤(1)中方法平行制备供试品溶液，计算每份样品测得的各待测组分含量，求出R.S.D.，考察方法重复性，结果见表2，各R.S.D.均小于5％，表明方法重复性良好。
4)稳定性试验：取同一供试品溶液，分别在提取0、2、4、6、8、12、24h后进样测定，计算每次测得的各待测组分峰面积R.S.D.，考察样品稳定性，结果见表2，各R.S.D.均小于5％，表明样品24h稳定性良好。
5)准确性考察：方法的准确性由样品的加标回收率表示，向含量已知的某待测样品中加入一定量的各对照品组分，按照本实施例步骤(1)的方法制备待测样品溶液，进行HPLC分析，计算其加标回收率，结果见表2，各待测组分的回收率均在95.02-102.60％之间，回收率RSD均在1.50-4.06％之间，表明该方法对各待测组分的检测准确性良好。
6)以信噪比S/N＝3，S/N＝10分别考察各待测组分的检测限和定量限，结果见表2.
实施例6孢子粉样品中甾醇和脂肪酸含量的测定
取破壁孢子粉样品，以乙醇为提取溶剂，按料液比1：10对孢子粉进行超声提取30min，浸提液冷却至室温，摇匀，先经12000r/min离心5min，取上清液，用0.22μm微孔有机相滤膜过滤，即得供试品溶液。各供试品溶液按优化后的色谱条件依次进样分析，计算各孢子粉样品中甾醇和脂肪酸的含量，结果见表3。
实施例7孢子油样品中甾醇和脂肪酸含量的测定
取孢子油样品，以乙醇为提取溶剂，按料液比1：30对孢子油进行超声提取30min，浸提液冷却至室温，摇匀，先经12000r/min离心5min，取上清液，用0.22μm微孔有机相滤膜过滤，即得供试品溶液。各供试品溶液按优化后的色谱条件依次进样分析，计算各孢子油样品中甾醇和脂肪酸的含量，结果见表4。

Claims (9)

1.一种灵芝孢子粉及其产品中甾醇和脂肪酸类成分的HPLC测定方法，其特征在于，包括如下步骤：将灵芝孢子粉及其产品加入溶剂提取后，运用蒸发光散射检测器，通过高效液相色谱法对灵芝孢子粉及其产品中的甾醇和脂肪酸成分的含量进行测定。
2.根据权利要求1的一种灵芝孢子粉及其产品中甾醇和脂肪酸类成分的HPLC测定方法，其特征在于，具体操作过程包括以下步骤：
(1)灵芝孢子粉及其产品的预处理步骤，将灵芝孢子粉或相关产品加入溶剂浸提，得到浸提液，离心，得上清液，经过滤后得到待测样品溶液；
(2)高效液相色谱检测步骤：采用蒸发光散射检测器，通过高效液相色谱仪对待测样品溶液进行高效液相色谱分析；
(3)指标成分是甾醇和脂肪酸类成分：其中甾醇类成分为啤酒甾醇、麦角甾醇过氧化物、麦角甾醇和星鱼甾醇；脂肪酸类成分为油酸、亚油酸、棕榈酸。
3.根据权利要求1-2的一种灵芝孢子粉及其产品中甾醇和脂肪酸类成分的HPLC测定方法，其特征在于，所述步骤(1)灵芝孢子粉及其产品的预处理步骤，浸提方法包括以下步骤：所用浸提溶剂为乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、正己烷、石油醚、异丙醇、己烷：异丙醇(V/V＝3：2)、己烷：乙醇(V/V＝1：1)中的一种；提取方式为超声提取、加热震荡提取，优选超声提取；提取时间为10-90min，优选30min；料液比为1：10-1：50，其中孢子粉样品优选1：10，孢子油样品优选1：30；浸提次数包括一次浸提或反复浸提。
4.根据权利要求1-2的一种灵芝孢子粉及其产品中甾醇和脂肪酸类成分的HPLC测定方法，其特征在于，所述步骤(1)灵芝孢子粉及其产品的预处理步骤，浸提液的处理包括以下步骤：提取完成后，浸提液冷却至室温，摇匀，先经12000r/min离心5min，取上清液，经0.22μm微孔有机相滤膜过滤，备用。
5.根据权利要求1-2的一种灵芝孢子粉及其产品中甾醇和脂肪酸类成分的HPLC测定方法，其特征在于，所述步骤(2)高效液相色谱法包括以下步骤：
检测器为蒸发光散射检测器；色谱柱为反相C18色谱柱，流动相溶液成分为乙腈-甲醇-水-异丙醇四相梯度洗脱，其中水中冰醋酸的浓度为0.00％-0.02％，优选0.01％；柱温为20-40℃，优选30℃；流速0.8-1.2ml/min，优选1.0ml/min；进样体积为5-50μL，优选20μL。
6.根据权利要求5的一种灵芝孢子粉及其产品中甾醇和脂肪酸类成分的HPLC测定方法，其特征在于，蒸发光散射检测器的设定包括以下参数：
增益为100-1000，优选500；气体压力为20-40psi，优选25psi；漂移管温度为50-80℃，优选60℃；喷雾器模式为加热模式，加热功率为50％-80％，优选65％。
7.根据权利要求5的一种灵芝孢子粉及其产品中甾醇和脂肪酸类成分的HPLC测定方法，其特征在于，所用色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱或Agilent ZORBAX Eclipse Plus-C18(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱。
8.根据权利要求5的一种灵芝孢子粉及其产品中甾醇和脂肪酸类成分的HPLC测定方法，其特征在于，流动相的洗脱程序为：
(A)乙腈+(B)水+(C)甲醇+(D)异丙醇(V/V/V/V)＝100％(体积)：
0→10min，A/B/C/D＝40/0/60/0→A/B/C/D＝60/0/40/0；
10→25min，A/B/C/D＝60/0/40/0→A/B/C/D＝68/0/32/0；
25→32min，A/B/C/D＝68/0/32/0→A/B/C/D＝60/20/20/0；
32→40min，A/B/C/D＝60/20/20/0→A/B/C/D＝80/20/0/0；
40→55min，A/B/C/D＝80/20/0/0→A/B/C/D＝100/0/0/0；
55→65min，A/B/C/D＝100/0/0/0→A/B/C/D＝100/0/0/0；
65→67min，A/B/C/D＝100/0/0/0→A/B/C/D＝20/0/0/80；
67→80min，A/B/C/D＝20/0/0/80→A/B/C/D＝20/0/0/80；
80→82min，A/B/C/D＝20/0/0/80→A/B/C/D＝40/0/60/0；
82→95min，A/B/C/D＝40/0/60/0→A/B/C/D＝40/0/60/0。
9.根据权利要求1-2的一种灵芝孢子粉及其产品中甾醇和脂肪酸类成分的HPLC测定方法，其特征在于，所述步骤(2)-(3)高效液相色谱法还包括以下具体步骤：
1)系列标准品溶液的配制：用甲醇配制含有所述4种甾醇化合物和3种脂肪酸类成分各适量的混合标准品溶液，并依次用甲醇稀释成系列浓度梯度，备用。
2)各待测组分的定性：将各甾醇及脂肪酸类成分单组分及混合标准品溶液进行HPLC分析，根据各单组分的保留时间定性；
3)标准曲线的绘制：取步骤1)中的系列标准品溶液，按照本发明所述色谱条件进行测定，计算峰面积，以各标准品质量浓度的对数(lgC)为横坐标，以峰面积的对数(lgA)为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程。
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