CN102879512A

CN102879512A - 一种检测咖啡中高级脂肪酸的方法

Info

Publication number: CN102879512A
Application number: CN2012103705607A
Authority: CN
Inventors: 韩敬美; 赵伟; 王昆淼; 何沛; 刘春波; 刘志华; 陈永宽; 缪明明
Original assignee: Yunnan Academy of Tobacco Science
Current assignee: Yunnan Academy of Tobacco Science
Priority date: 2012-09-29
Filing date: 2012-09-29
Publication date: 2013-01-16
Anticipated expiration: 2032-09-29
Also published as: CN102879512B

Abstract

本发明涉及一种咖啡中高级脂肪酸的分析方法。采用特殊的样品前处理方法对咖啡样品进行处理，并在特定的超高效液相色谱-蒸发光散射检测器的条件下进行色谱分析。对咖啡中高级脂肪酸的种类和含量进行了准确的定性和定量分析。本发明不需要增加特殊设备，即可适用于一般超高效液相色谱分析室采用。应用范围包括所有种类的咖啡及咖啡副产物，该法具有操作简单、分析速度快、检测全面等特点，能够对咖啡样品进行快速检测分析，为以后的咖啡营养成分分析、营养评价等方面的研究提供了科学可靠的分析方法。

Description

一种检测咖啡中高级脂肪酸的方法

技术领域

本发明涉及咖啡检测技术领域，具体是一种检测分析咖啡中6种高级脂肪酸的方法及应用。

背景技术

随着现代社会的快速发展，人们越来越多的投入到工作学习中，而咖啡作为世界上的三大饮料之一也渐渐成为很多大城市上班族提神醒脑和休闲约会的必须品。众所周知，咖啡中的咖啡因会刺激大脑皮质、消除睡意，增强感觉和思考力，具有提神醒脑的作用。此外，咖啡还可以防止糖尿病，防止肿癌，降低炎症和心血管疾病的发生率。这些医疗功效逐渐得到人们的重视和研究，目前咖啡中的一些营养化学成分的分析已有一些报道。但是，咖啡中与儿童生长发育和成长健康有关，具有降血脂、防治冠心病等治疗作用，且与智力发育、记忆等生理功能有一定联系的高级脂肪酸，却未得到人们的普遍关注。因此有效检测咖啡中的高级脂肪酸十分重要。蒸发光散射检测器是一种基于不挥发的样品颗粒对光的散射程度与其质量成正比进行检测的质量检测器。该检测方法消除了常见于LC检测方法中的难点，其响应不依赖与样品的光学特性，任何挥发性低于流动性的样品均能被检测，不受其官能团的影响，具有稳定性好，灵敏度高等特点。超高效液相色谱是借助于高效液相色谱的理论及原理，涵盖了小颗粒填料，非常低的系统体积及快速检测手段等全新技术，增加了分析的通量，灵敏度及色谱峰容量。目前，利用超高效液相色谱-蒸发光散射检测器检测咖啡中的硬脂酸、棕榈酸、油酸、亚麻酸、亚油酸、肉豆蔻酸等高级脂肪酸并无报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测分析咖啡中6种高级脂肪酸的方法及其应用。可以对咖啡中游离态、以结合态形式存在的高级脂肪酸进行准确、快速、全面的定量分析。

发明解决技术问题的技术方案是：优化超高效液相色谱-蒸发光散射检测器分析检测高级脂肪酸的色谱条件，并在不同的皂化温度、氢氧化钾浓度、不同的皂化时间、不同的萃取溶剂和不同的萃取剂体积条件下进行正交优化试验，以得到不同浓度的高级脂肪酸的样品溶液，通过超高效液相色谱-蒸发光散射检测器分析检测，最后得到了检测咖啡中高级脂肪酸的最佳皂化条件和分析方法。具体方法如下：

1）制备6种高级脂肪酸的标准溶液：

（1）分别称取20-30、20-40、20-40、20-30、10-20、20-30 mg的亚麻酸、亚油酸、棕榈酸、油酸、肉豆蔻酸和硬脂酸，置于同一50 mL 容量瓶中，加少许甲醇超声溶解后取出，冷却至室温，用甲醇定容至50 mL，配制成标准储备液；用10 mL的容量瓶分别将标准储备液稀释2-10倍，用甲醇定容10 mL，得到不同浓度的高级脂肪酸标准工作液，摇匀备用；

（2）在超高效液相色谱仪的C18分析柱上，以乙酸水溶液-乙腈为流动相梯度洗脱游离高级脂肪酸；色谱条件如下：

分析柱：C₁₈柱，100 mm×2.3 mm i.d.,1.7 um

流动相：流动相A为体积比为1-2%乙酸水溶液，流动相B为乙腈；

洗脱方式：梯度洗脱

检测器条件：蒸发光散射检测器的漂移管温度：50-80 ℃；蒸发光散射检测器的载气：氮气（纯度＞99.9％），流速为2.89-4.5 L/min；气体压力：40.0-60 psi；喷雾器模式：冷却；增益值：400-800；

（3）按照浓度由低到高分别对高级脂肪酸标准工作液进行超高效液相色谱-蒸发光散射器测定，并将测得的峰面积y与标准溶液的质量浓度x mg/L进行Log-Log线性回归分析，得到6种高级脂肪酸的标准曲线方程， log(y)=a×log(x)+b，其中a为标准曲线方程中一次方系数，b为标准曲线方程中零次项系数；

2）咖啡样品的制备：将磨碎至40-60目的咖啡样品0.0500g-0.1000g置于100-150 mL圆底烧瓶中，加入40-80 mL 浓度为2- 4mol/L的KOH-甲醇溶液，于40-70℃水浴中回流皂化20-80 min，冷却至室温，过滤至具塞三角锥形瓶中，加入10-30 mL蒸馏水，混匀，用质量分数浓度20-36％盐酸调节滤液的pH<7，用10-20mL二氯甲烷萃取3次，合并3次的二氯甲烷层，用15-40 mL蒸馏水洗涤二氯甲烷层，二氯甲烷层用氮吹自动浓缩仪蒸干，残余物用甲醇溶解并定容至5-15 mL，用0.22 μm微孔有机滤膜过滤，取滤液进行超高效液相色谱-蒸发光散射器测定，得到试样中高级脂肪酸的峰面积A_试样；

3）用外标法定量分析计算

[lgA_试样-b]/a= lg C_试样

A_试样：试样色谱图中高级脂肪酸的峰面积；

C_试样：试样中高级脂肪酸的浓度；

a为标准曲线方程中一次方系数；

b为标准曲线方程中零次项系数；

所述的乙酸水溶液的浓度是体积百分比1-2%。

检测器条件中氮气纯度不小于99.9％。

本发明的特点在于：对咖啡进行皂化反应，并对皂化后样品进行超高效液相色谱-蒸发光散射检测器连续分析，对高级脂肪酸的保留时间有了了解。同时对咖啡中高级脂肪酸的种类和含量进行正确判断，并对咖啡的营养化学成分有了初步分析。为确定咖啡的营养含量高低提供了科学数据和全面的技术支持。

附图说明

图1是本发明的梯度洗脱前混合标样的色谱图。

图2是本发明的梯度洗脱后混合标样的色谱图。

图3 是本发明的云南小粒咖啡咖啡样品的色谱图。

图4 是本发明的后谷咖啡样品的色谱图。

图5是本发明的雀巢咖啡样品的色谱图。

具体实施方式

实施例1：

1．仪器与试剂

Waters超高效液相色谱并配有二元梯度泵、Empower色谱工作站和蒸发光散射检测器(ELSD)，瑞士BUCHI公司生产的氮吹浓缩装置、AS801KAJ型超声波、E12140型电子分析天平(感量0.1 mg)，高速万能粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司)。

亚麻酸、肉豆蔻酸、亚油酸、棕榈酸、油酸、硬脂酸6种标准品购自百灵威科技有限公司，所用试剂均为色谱纯，氢氧化钾(分析纯，广东汕头市西陇化工厂)，超纯水(自制，电阻值＞18 MΩ)，BEH C18色谱柱为Waters公司生产。

3种咖啡产品为随机抽取的市场上不同品牌的特浓咖啡。

2．样品准备

在高速万能粉碎机中加入20g的未处理过的云南小粒咖啡样品，打磨至40-60目粉末后，待称量和测试分析。

3. 色谱条件及检测器条件

超高效液相色谱条件：色谱柱为Waters UPLC BEH C₁₈柱（100 mm×2.3 mm i.d.,1.7 um）；流动相：1％(体积分数)的乙酸水溶液(A)、乙腈(B)，流速0.2 mL·min^-1；梯度洗脱方式进行；柱温：20℃；进样量：2uL；

蒸发光散射检测器条件：ELSD的漂移管温度：50 ℃；ELSD的载气：氮气（纯度＞99.9％），流速为2.89 L/min；气体压力：40.0psi；喷雾器模式：冷却；增益值：400。

4．标准曲线的建立

分别称取20.0、20.0、20.0、20.0、20.0、10.0 mg的亚麻酸、亚油酸、棕榈酸、油酸、肉豆蔻酸和硬脂酸，置于同一50 mL 容量瓶中，加少许甲醇超声溶解后取出，冷却至室温，用甲醇定容至50 mL，配制成标准储备液。用10 mL的容量瓶分别将标准储备液稀释2、2.5、4、5倍，用甲醇定容至10 mL，得到不同浓度的高级脂肪酸标准工作液。计算其浓度如表一。

按照浓度由低到高分别对标准混合溶液进行超高效液相色谱-蒸发光散射器测定，并将测得的峰面积（y）与标准溶液的质量浓度（x，mg/L)进行Log-Log线性回归分析，得到6种高级脂肪酸的标准曲线方程及相关性系数如表二。

表二方法的标准曲线、相关系数

5. 检测

称取步骤2中的云南小粒咖啡样品0.0500g于100 mL圆底烧瓶中，加入40 mL 2mol/L的KOH-甲醇溶液，于40℃水浴中回流皂化20 min，冷却至室温，过滤至具塞三角锥形瓶中，加入10 mL蒸馏水，混匀，用20％（质量分数）盐酸调节滤液的pH至<7，用10 mL二氯甲烷萃取3次，合并3次萃取的二氯甲烷层，用15 mL蒸馏水洗涤二氯甲烷层，二氯甲烷层用氮吹自动浓缩仪蒸干，残余物用甲醇溶解并定容至5 mL，用0.22 μm微孔有机滤膜过滤，取滤液，按照选定的色谱条件和检测器条件进行超高效液相色谱分析检测，然后根据检测结果进行定性分析和定量分析。

通过与标准色谱图中标准品的色谱峰的保留时间的对比，样品测试的谱图中的高级脂肪酸的谱峰得到了定性；通过标准工作曲线和样品色谱图中高级脂肪酸的峰面积可以计算咖啡中高级脂肪酸的含量。云南小粒咖啡产品中含有高级脂肪酸的种类如表五所示。

实施例2：

1. 仪器与试剂

该步骤与实施例1相同。

2. 样品准备

在高速万能粉碎机中加入20g的未处理过的后谷咖啡样品，打磨至40-60目粉末后，待称量和测试分析。

3. 色谱条件及检测器条件

超高效液相色谱条件：色谱柱与实施例1中相同；流动相：1.5％(体积分数)的乙酸水溶液(A)、乙腈(B)，流速0.3 mL·min^-1；梯度洗脱方式进行；柱温：30℃；进样量：3uL；

蒸发光散射检测器条件：ELSD的漂移管温度：70 ℃；ELSD的载气：氮气（纯度＞99.9％），流速为3.5 L/min；气体压力：50.0psi；喷雾器模式：冷却；增益值：600。

4.标准曲线的建立

分别称取25.0、30.0、30.0、25.0、15.0、25.0 mg的亚麻酸、亚油酸、棕榈酸、油酸、肉豆蔻酸和硬脂酸，置于同一50 mL 容量瓶中，加少许甲醇超声溶解后取出，冷却至室温，用甲醇定容至50 mL，配制成标准储备液。用10 mL的容量瓶分别将标准储备液稀释2、2.5、4、5倍，用甲醇定容至10 mL，得到不同浓度的高级脂肪酸标准工作液。计算其浓度如表三。

表三 6种高级脂肪酸标准工作液的浓度

以下步骤与实施例1相同。

5. 检测

称取步骤2中的后谷咖啡样品0.0800g于125 mL圆底烧瓶中，加入60 mL 3mol/L的KOH-甲醇溶液，于55℃水浴中回流皂化50 min，冷却至室温，过滤至具塞三角锥形瓶中，加入20 mL蒸馏水，混匀，用30％（质量分数）盐酸调节滤液的pH至<7，用15 mL二氯甲烷萃取3次，合并3次萃取的二氯甲烷层，用25 mL蒸馏水洗涤二氯甲烷层，二氯甲烷层用氮吹自动浓缩仪蒸干，残余物用甲醇溶解并定容至10 mL。以下步骤与实施例1相同。后谷咖啡样品中含有高级脂肪酸的种类如表五所示。

实施例3：

1．仪器与试剂

该步骤与实施例1相同。

2．样品准备

在高速万能粉碎机中加入20g的未处理过的雀巢咖啡样品，打磨至40-60目粉末后，待称量和测试分析。

3. 色谱条件及检测器条件

超高效液相色谱条件：色谱柱与实施例1中相同；流动相：2％(体积分数)的乙酸水溶液(A)、乙腈(B)，流速0.4 mL·min^-1；梯度洗脱方式进行；柱温：40℃；进样量：4uL；

蒸发光散射检测器条件：ELSD的漂移管温度：80 ℃；ELSD的载气：氮气（纯度＞99.9％），流速为4.5 L/min；气体压力：60.0psi；喷雾器模式：冷却；增益值：800。

4.标准曲线的建立

分别称取30.0、40.0、40.0、30.0、20.0、30.0 mg的亚麻酸、亚油酸、棕榈酸、油酸、肉豆蔻酸和硬脂酸，置于同一50 mL 容量瓶中，加少许甲醇超声溶解后取出，冷却至室温，用甲醇定容至50 mL，配制成标准储备液。用10 mL的容量瓶分别将标准储备液稀释2、2.5、4、5倍，用甲醇定容至10 mL，得到不同浓度的高级脂肪酸标准工作液。计算其浓度如表四。

表四 6种高级脂肪酸标准工作液的浓度

以下步骤与实施例1相同。

5. 检测

称取步骤2中的雀巢咖啡样品0.1000g于150 mL圆底烧瓶中，加入80 mL 4 mol/L的KOH-甲醇溶液，于70℃水浴中回流皂化80 min，冷却至室温，过滤至具塞三角锥形瓶中，加入30 mL蒸馏水，混匀，用36％（质量分数）盐酸调节滤液的pH至<7，用20 mL二氯甲烷萃取3次，合并3次萃取的二氯甲烷层，用40 mL蒸馏水洗涤二氯甲烷层，二氯甲烷层用氮吹自动浓缩仪蒸干，残余物用甲醇溶解并定容至15 mL。以下步骤与实施例1相同。雀巢咖啡样品中含有高级脂肪酸的种类如表五所示。

表五 3种咖啡中含有高级脂肪酸的种类

Figure 2012103705607100002DEST_PATH_IMAGE009

注：-表示在该种咖啡种未检测到该种高级脂肪酸。

Claims

1.一种检测咖啡中高级脂肪酸的方法，其特征在于按以下步骤进行：

1）制备6种高级脂肪酸的标准溶液：

分析柱：C₁₈柱，100 mm×2.3 mm i.d.,1.7 um

洗脱方式：梯度洗脱

3）用外标法定量分析计算

[lgA_试样-b]/a= lg C_试样

A_试样：试样色谱图中高级脂肪酸的峰面积；

C_试样：试样中高级脂肪酸的浓度；

a为标准曲线方程中一次方系数；

b为标准曲线方程中零次项系数。

2.根据权利要求1所说的检测咖啡中高级脂肪酸的方法，其特征在于所述的乙酸水溶液的浓度是体积百分比1-2%。

3.根据权利要求1所说的检测咖啡中高级脂肪酸的方法，其特征在于检测器条件中氮气纯度不小于99.9％。