CN103884785A - 一种硒的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种硒形态及单质硒、总硒的检测方法，选用了不同仪器生产厂家的色谱分离系统和原子荧光分光光度计组合成HPLC-HG-AFS联用系统，可进行形态硒分析、单质硒及样品中无机硒、总硒的测定方法：测定结果准确；通过总硒、无机硒的测定，采用总硒减去无机硒的方法可间接得到有机硒含量，可形成形态分析法测定总硒、无机硒、有机硒的新技术。该方法可移植性强，使用方便灵活，具有推广应用价值。

Description

一种硒的检测方法

技术领域

本发明涉及一种硒的检测方法。 

背景技术

目前，硒的形态分析方法是硒检测技术发展的必然趋势，国内外研究者以HPLC-ICP-MS、HPLC-MS-MS、GC-MS等联用技术为基础，对硒代氨基酸和无机硒的形态分析方法做了大量的研究工作，但没有形成标准。近些年来，在我国发展起来的HPLC-HG-AFS联用技术，采用高效液相色谱分离-在线氢化物发生-原子荧光检测法进行形态分析，结合了HPLC高效分离和AFS高灵敏度的优势，对能够形成氢化物的元素形态进行分析，是现阶段元素形态发展的主要方向。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种使用方便的硒的检测方法。 

本发明的技术方案是：一种硒的检测方法，其特征在于包含以下步骤：a.分析仪器系统配置：将色谱分离系统、原子荧光分光光度计及硒形态预处理装置组合成HPLC-HG-AFS联用系统；色谱柱要能够对SeO₃ ⁴⁺、SeO₄ ⁶⁺、硒代氨基酸及衍生物、二甲基硒、硒脲小分子物质有保留的C₁₈柱或阴离子交换柱；所述的硒形态预处理装置为能够与色谱分离系统连接，将色谱系统分离的待测样品中含硒成分转化为氢化物的硒形态预处理装置； 

b.仪器分析方法：流动相为不同浓度的（NH₄）₂HPO₄缓冲液或添加有机试剂的溶液；洗脱方式采用30mM-150mM的pH3-9磷酸氢二铵缓冲液配制成一种流动相等度洗脱或改变流速进行梯度洗脱，也可配制成2种以上不同浓度的流动相，通过改变流动相的比例进行梯度洗脱；进样可采用手动或自动2种方式，进样体积在0.1μL-100μL之间；其它参数按照仪器设备使用说明书推荐设定；所述的添加有机试剂的溶液为添加甲醇或其它有机试剂的溶液； 

c.硒形态的检测方法：提取溶剂为0.1-1N的HCl、HClO₄、NaOH、胃蛋白酶K水溶液和50%-100%的CH₃OH溶液，用HCl和HClO₄提取的溶液，用NaOH溶液调节pH 值到5-6；用NaOH提取的溶液用盐酸调节pH值到8-9；胃蛋白酶K水提取液和50%-100%的CH₃OH提取液不调节pH值；提取液均经0.45μm滤膜过滤后上机硒的形态，对有标准物质的成分可以定性定量测定，没有标准物质的成分可为进一步研究提供依据；根据色谱图中峰的分离状况和峰高可确定最佳的提取方法； 

d.单质硒的测定：采用少量HNO₃、王水或HNO₃+HClO₄溶解后，用NaOH溶液调节pH值到5-6，经0.45μm滤膜过滤后上机测定，用外标法计算SeO₃ ⁴⁺的含量，计算硒的回收率，以确定方法的可行性； 

e.无机硒的测定：定性定量测定样品浸提液中的SeO₃ ⁴⁺和SeO₄ ⁶⁺的含量，和为无机硒总量，采用总硒减无机硒的方法可得有机硒含量； 

f.总硒含量的测定：按照GB方法进行样品消化，消化时可不加盐酸还原，再用NaOH溶液调节pH值至5-6，定容后上机测定，用外标法计算SeO₃ ⁴⁺和SeO₄ ⁶⁺的含量，和为总硒含量。 

本发明采用不同厂家的高效液相色谱和原子荧光形态分析仪组成HPLC-HG-AFS联用仪，系统地进行了SeCys₂、SeMet、Se(IV)、MeSeCys和Se(VI)等5种硒形态的仪器分析条件、检测限、线性范围及样品中硒形态的提取方法等方面的研究，建立了富硒产品中硒的形态分析方法。 

本发明的有益效果是：该技术采用高效液相色谱分离-在线氢化物发生-原子荧光检测法进行形态分析，结合了HPLC高效分离和AFS高灵敏度的优势，使多种含硒成分可以通过HPLC快速分离后，被原子荧光检测器检测，其检测灵敏度是紫外检测器的1000倍以上，检测限可达0.82～7.47ng，曲线范围达两个数量级，可以满足样品中微量硒形态分析的需求。该技术可作为SeCYs₂、SeMet、Se(IV)、MeSeCys和Se(VI)等5种硒形态的检测方法，也可进行单质硒及样品中无机硒、总硒的测定方法；作为无机硒的检测方法时，Se(IV)和Se(VI)可完全分开，避免了样品中其它成分的干扰，测定结果准确；进行总硒测定时，消化时不需要盐酸还原，不需要加掩蔽剂，可形成标准方法。通过以上总硒、无机硒的测定，采用总硒减去无机硒的方法可间接得到有机硒含量，可形成形态分析法测定总硒、无 机硒、有机硒的新技术。该方法可移植性强，可以选用不同仪器生产厂家的色谱分离系统和原子荧光分光光度计进行组合，具有推广应用价值。 

附图说明

附图1是SeCys₂、SeMet、Se(IV)、MeSeCys(1000μg/L)、Se(VI)(751μg/L)标准样品形态分析图，进样量：20μL；(百分比法单谱图)； 

附图2是SeCys2工作曲线s＝12983.0c+1544.8；R＝0.9996； 

附图3是SeMet工作曲线s＝110725.6c-18528.6；R＝0.9992； 

附图4是Se(IV)工作曲线s＝37088.8c-4825.8；R＝0.9997； 

附图5是MeSeCys工作曲线s＝9641.4c-15961.2；R＝0.9988； 

附图6是Se(IV)工作曲线s＝4292.4c-3407.4；R＝0.9987； 

附图7是0.5N NaOH溶液提取碎米荠样品的色谱图(稀释40倍，进样量20μL，从左到右3个主要峰分别为SeCys₂、t2.99min和Se(IV))；(外标校正单谱图)。 

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。 

实施例1：本发明一种硒的检测方法，包含以下步骤：a.分析仪器系统配置：将色谱分离系统、原子荧光分光光度计及硒形态预处理装置组合成HPLC-HG-AFS联用系统；色谱柱要能够对SeO₃ ⁴⁺、SeO₄ ⁶⁺、硒代氨基酸及衍生物、二甲基硒、硒脲小分子物质有保留的C₁₈柱或阴离子交换柱；所述的硒形态预处理装置为能够与色谱分离系统连接，将色谱系统分离的待测样品中含硒成分转化为氢化物的硒形态预处理装置； 

b.仪器分析方法：流动相为不同浓度的（NH₄）₂HPO₄缓冲液或添加有机试剂的溶液；洗脱方式采用30mM-150mM的pH3-9磷酸氢二铵缓冲液配制成一种流动相等度洗脱或改变流速进行梯度洗脱，也可配制成2种以上不同浓度的流动相，通过改变流动相的比例进行梯度洗脱；进样可采用手动或自动2种方式，进样体积在0.1μL-100μL之间；其它参数按照仪器设备使用说明书推荐设定；所述的添加有机试剂的溶液为添加甲醇或其它有机试剂的溶液； 

c.硒形态的检测方法：提取溶剂为0.1-1N的HCl、HClO₄、NaOH、胃蛋白酶K水溶液和50%-100%的CH₃OH溶液，用HCl和HClO₄提取的溶液，用NaOH溶液调节pH值到5-6；用NaOH提取的溶液用盐酸调节pH值到8-9；胃蛋白酶K水提取液和50%-100%的CH₃OH提取液不调节pH值；提取液均经0.45μm滤膜过滤后上机硒的形态，对有标准物质的成分可以定性定量测定，没有标准物质的成分可为进一步研究提供依据；根据色谱图中峰的分离状况和峰高可确定最佳的提取方法； 

d.单质硒的测定：采用少量HNO₃、王水或HNO₃+HClO₄溶解后，用NaOH溶液调节pH值到5-6，经0.45μm滤膜过滤后上机测定，用外标法计算SeO₃ ⁴⁺的含量，计算硒的回收率，以确定方法的可行性； 

e.无机硒的测定：定性定量测定样品浸提液中的SeO₃ ⁴⁺和SeO₄ ⁶⁺的含量，和为无机硒总量，采用总硒减无机硒的方法可得有机硒含量； 

f.总硒含量的测定：按照GB方法进行样品消化，消化时可不加盐酸还原，再用NaOH溶液调节pH值至5-6，定容后上机测定，用外标法计算SeO₃ ⁴⁺和SeO₄ ⁶⁺的含量，和为总硒含量。 

实施例2：本发明一种硒的检测方法， 

1、仪器与试剂 

硒形态分离系统采用高效液相色谱仪（美国Waters2695分离单元），氢化物发生采用SAP-10形态分析预处理系统、检测系统和数据采集、处理系统采用AFS-913d原子荧光分光光度计及相关软件（北京吉天仪器有限公司）、样品消解采用海能SH230石墨消解仪、硒形态提取采用TMS-200超级恒温混匀仪（杭州奥盛仪器有限公司）。 

盐酸（GR）、硝酸（GR）为优级纯，高氯酸（AR）、氢氧化钠和甲醇为分析纯。 

胃蛋白酶K（Merck公司）、硒代蛋氨酸（SeMet，Sigma公司）、硒代胱氨酸（SeCys，Sigma公司），硒甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys，Sigma公司）配制成100μg.mL^-1的贮备液；硒酸根标准溶液（GBW10033：国家标准物质中心， 75.1μg.mL^-1）、亚硒酸根标准溶液（GBW10032，国家标准物质中心，68.9μg.mL^-1）为原液。 

混合标准溶液配制：取硒代蛋氨酸（贮备液）、硒代胱氨酸（贮备液）、亚硒酸根（原液）、硒甲基硒代半胱氨酸（贮备液）、硒酸根（原液）100μL、100μL、50μL、200μL、200μL于10mL容量瓶中，用水定容，各组分浓度分别为1μg.mL^-1、1μg.mL^-1、0.3445μg.mL^-1和2μg.mL^-1和1.52μg.mL^-1，既1ng.μL^-1、1ng.μL^-1、0.3445ng.μL^-1和2ng.μL^-1和1.52ng.μL^-1。此混标溶液作为标准待测液。 

2、材料与方法 

2.1 材料 

微生物硒肥（恩施州硒资源开发与应用技术研究院课题组研制），硒虫草胶囊（湖北圣峰药业有限公司），碎米荠（恩施莲花池大棚）。 

2.2 方法 

2.2.1 SeCYs2、SeMet、Se(IV)、MeSeCys和Se(VI)分离的仪器方法见表1。 

表1 硒形态分析仪器条件 

在氢化物发生参数和AFS参数相对固定的情况下，通过对流动相浓度、梯度等条件进行优化，为使5个硒形态峰完全分离且时间相对较短，采用表1的仪器条件，测定标准混合溶液，进样量为20μL，色谱图见图1。 

从图1可看出，5种硒形态均达到基线分离，检测周期为13min。 

2.2.2 检测限和线性范围 

连续测定SeCys₂、SeMet、Se(IV)、MeSeCys及Se(VI)标准混合液10次，进样量20μL，以峰面积为准计算标准偏差（SD），结果见表2。 

分别进混合标准溶液1μL、5μL、10μL、20μL、50μL、100μL，以质量分数（浓度ng.μL^-1×进样体积μL，单位为ng）为横坐标，峰面积为纵坐标，作标准曲线（图2～图6），得曲线斜率（S）和相关系数（R²）；以R²>0.99为准确定标准曲线范围；检测限LOD=3S/SD，结果见表2。 

表2 SeCys₂、SeMet、Se(IV)、MeSeCys及Se(VI)测定的标准差（SD）、斜率（S）、相关系数（R²）、检测限（LOD）和线性范围 

2.2.3 富硒产品中硒形态的提取和测定 

称取微生物硒肥、碎米荠、硒虫草各5份，每份0.25g左右于10mL塑料小试管中，分别加入(1)10mL70%CH₃OH、(2)10mL0.5N HCl、(3)10mL0.5NNaOH、(4)10mL0.5N HClO₄及(5)10mL H₂O+20mg胃蛋白酶K，其中(1)(2)(3)(4) 在超级恒温混匀仪上90℃、1500rmp下提取60min，(5)在45℃、1500rmp下提取60min，用0.45μM滤膜过滤于进样小瓶中，用NaOH提取的溶液用水稀释4倍，按表1的仪器分析条件测定。 

分析结果：采用10mL H₂O、10mL0.5N HCl、10mL0.5N NaOH、10mL0.5N HClO₄及10mL H₂O+20mg胃蛋白酶K等5种方法提取碎米荠、硒虫草、生物有机硒肥等样品中的形态硒，其中0.5N NaOH提取的碎米荠硒形态色谱图见图7。 

图7 0.5N NaOH溶液提取碎米荠样品的色谱图（稀释40倍，进样量20μL，从左到右3个主要峰分别为SeCys₂、t2.99min和Se(IV)） 

不同提取液提取碎米荠的硒形态峰面积见表3。 

表3 不同溶剂提取碎米荠中硒形态的效果（峰面积） 

碎米荠用0.5N HCl提取液出现8个峰，其中5个峰较为明显，与标样对比，以保留时间定性，分别为SeCys₂、t2.99min、Se(IV)、MeSeCys和Se(VI)；HClO₄提取峰与HCl基本一致；NaOH提取液峰较高，需稀释4倍后测定，主要为SeCys₂ 和t2.99min；70%CH3OH提取液有5个峰，酶法提取液有6个峰。不同的提取液提取的成分和含量均不相同，但均提出了SeCys₂和Se(VI)、Se(VI),其中提取液中各成分的总量以0.5N NaOH最高，其次是HCl和HClO₄，70%CH₃OH提取率最低，酶解法没有优势；提取SeCys₂也以0.5N NaOH最好，但提取Se(IV)以0.5N HClO₄最好，其次是HCl和NaOH。 

硒虫草的HCl、HClO₄、CH₃OH提取液均无峰，NaOH提取液有SeMet和Se(IV)，分别为14.88μg/L和3.2μg/L；酶解提取液在MeSeCys前有一未知峰，t=6.29min。 

生物有机硒肥样品中只提出Se(IV)，峰高度：NaOH>HCl>CH₃OH>HClO₄>胃蛋白酶K，说明用NaOH提取效果最好。 

2.2.4 单质硒的测定 

分别称取99.95%Se粉7份，每份0.1g，分别按以下方法处理：(1)加入HNO₃2mL溶解，不加热；(2)加入HNO₃2mL溶解，160℃加热至发烟；(3)加入HNO₃2mL+HCl4mL，不加热；(4)加入HNO₃2mL+HCl4mL，加热至黄棕色消失；(5)加入HNO₃2mL+HClO₄1mL，160℃加热至溶液清亮；(6)加入Na₂CO₃0.5g，160℃加热30min，然后加水至约30mL，继续加热至蒸干，(1)～(5)用NaOH调节至PH5～6，(6)用HCl调节至pH8～9，定容至50mL，取100μL用水稀释定容至10mL，用0.45μM滤膜过滤至进样小瓶中测定，进样量为1μL，与标准图谱对比，用保留时间定性，外标法定量。 

试验采用6种不同的提取方法测定单质硒的回收率，结果见表4. 

表4 不同处理方法测定的单质硒的回收率 

从以上结果看出：处理(1)、(2)、(3)、(5)的回收率均在90%-110%之间，其中以(2)和(3)最接近100%，说明单质硒采用少量HNO₃溶解，160℃加热至发烟或用王水溶解，但不加热两种方法均能获得理想的回收率；用王水溶解后加热会使硒大量损失，而单质硒不溶于Na₂CO₃。 

2.2.5 总硒的测定 

表5 不同样品国标法测定（GB）总硒和形态分析方法测定总硒结果比较（μg/kg） 

从以上结果可以看出，用形态分析方法测定总硒结果与GB法基本一致，可以代替GB测定总硒，其优点是SeO₃ ⁴⁺和SeO₄ ⁶⁺可完全分开，避免了样品中其它成分的干扰，不需要加掩蔽剂，测定结果准确；且消化时不需要盐酸还原，可形成标准方法。 

2.2.6 方法的适用性 

该方法由北京吉天科技仪器公司建立的硒形态分析方法发展而来，原方法采用SAP-10或SAP-20形态分析预处理系统，配置AFS-830、AFS-930系列不同型号的原子荧光分光光度计进行硒、砷等元素的形态分析，以同一种流动相改变流量进行梯度分析，能够较好地分离SeCys₂、SeMet、Se(IV)和Se(VI)等4个峰。本 试验采用Waters公司的2965分离单元作为样品分离系统，配置SAP-10形态分析预处理系统和AFS-930d原子荧光分光光度计，通过改变流动相配比、梯度、进样量等色谱条件，定性定量了检测5种硒形态。该方法还可用于总硒和无机硒的检测，用于无机硒的检测时，避免了其它成分的干扰，结果更为准确；也可根据实验室的具体情况优化配置不同厂家的色谱系统和原子荧光检测器，方法移植性强，使用方便灵活，便于推广应用。 

Claims (1)

1.一种硒的检测方法，其特征在于包含以下步骤：a.分析仪器系统配置：将色谱分离系统、原子荧光分光光度计及硒形态预处理装置组合成HPLC-HG-AFS联用系统；色谱柱要能够对SeO₃ ⁴⁺、SeO₄ ⁶⁺、硒代氨基酸及衍生物、二甲基硒、硒脲小分子物质有保留的C₁₈柱或阴离子交换柱；所述的硒形态预处理装置为能够与色谱分离系统连接，将色谱系统分离的待测样品中含硒成分转化为氢化物的硒形态预处理装置；

b.仪器分析方法：流动相为不同浓度的（NH₄）₂HPO₄缓冲液或添加有机试剂的溶液；洗脱方式采用30mM-150mM的pH3-9磷酸氢二铵缓冲液配制成一种流动相等度洗脱或改变流速进行梯度洗脱，也可配制成2种以上不同浓度的流动相，通过改变流动相的比例进行梯度洗脱；进样可采用手动或自动2种方式，进样体积在0.1μL-100μL之间；其它参数按照仪器设备使用说明书推荐设定；所述的添加有机试剂的溶液为添加甲醇或其它有机试剂的溶液；

c.硒形态的检测方法：提取溶剂为0.1-1N的HCl、HClO₄、NaOH、胃蛋白酶K水溶液和50%-100%的CH₃OH溶液，用HCl和HClO₄提取的溶液，用NaOH溶液调节pH值到5-6；用NaOH提取的溶液用盐酸调节pH值到8-9；胃蛋白酶K水提取液和50%-100%的CH₃OH提取液不调节pH值；提取液均经0.45μm滤膜过滤后上机硒的形态，对有标准物质的成分可以定性定量测定，没有标准物质的成分可为进一步研究提供依据；根据色谱图中峰的分离状况和峰高可确定最佳的提取方法；

d.单质硒的测定：采用少量HNO₃、王水或HNO₃+HClO₄溶解后，用NaOH溶液调节pH值到5-6，经0.45μm滤膜过滤后上机测定，用外标法计算SeO₃ ⁴⁺的含量，计算硒的回收率，以确定方法的可行性；

e.无机硒的测定：定性定量测定样品浸提液中的SeO₃ ⁴⁺和SeO₄ ⁶⁺的含量，和为无机硒总量，采用总硒减无机硒的方法可得有机硒含量；

f.总硒含量的测定：按照GB方法进行样品消化，消化时可不加盐酸还原，再用NaOH溶液调节pH值至5-6，定容后上机测定，用外标法计算SeO₃ ⁴⁺和SeO₄ ⁶⁺的含量，和为总硒含量。

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