CN101549081B - 一种菝葜的质量控制方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种菝葜的质量控制方法。本发明菝葜的质量控制方法含量测定：用C18或C8为填充剂；比例为25-45∶55-75的甲醇-0.1％磷酸溶液或比例为10-20∶80-90的乙腈-0.1％磷酸溶液或比例为0-10∶10-30∶60-90的乙腈-甲醇-0.1％磷酸溶液为流动相；检测波长为280-300nm。菝葜含落新妇苷不得少于0.030％，黄杞苷不得少于0.030％。本发明菝葜的质量控制方法有效、稳定、操作方便、准确、专属性强，能够很好的控制菝葜或含有菝葜原料制剂的质量。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药材的质量控制方法，尤其涉及菝葜的质量控制方法，还包括原料含有菝葜的中药制剂的质量控制方法。
背景技术
菝葜为百合科植物菝葜(Smilax china L.)、长托菝葜(S.ferox Wall.ex Kunth)、黑果菝葜(S.glauco-china Warb.)、托柄菝葜(S.discotis Warb.)、小果菝葜(S.davidiana A.DC)、西南菝葜(S.biumbellata Warb.)、柔毛菝葜(S.chingiiWang et Tang)、红果菝葜(S.poiycolea Warb.)等植物的干燥根茎。秋末至次年春采挖，除去须根，洗净，晒干或趁鲜切片，干燥。味甘，微苦涩，性平，归肝肾经。传统医学认为其根茎具有药用价值，具有祛风利湿、解毒散瘀的功效，可用于治疗筋骨酸痛、小便淋漓、带下量多和疔疮痈肿。
菝葜收载于2005年版《中国药典》中，其含量测定方法为以薯蓣皂苷元为质量控制指标，用酸水解法测定其中薯蓣皂苷元的含量。
“气相色谱法测定菝葜中薯蓣皂苷元含量”【参见刘杨、王永庆、邱宁婴等.气相色谱法测定菝葜中薯蓣皂苷元含量[J].江苏药学与临床研究，2004，12(4)：14～15)】报道了一种气相色谱法测定菝葜中薯蓣皂苷元含量的方法，通过测定薯蓣皂苷元的含量对中药材菝葜的质量进行控制。
申请号为200510200269.5的中国专利申请公开了一种中药菝葜提取物的制备方法和质量控制方法，所公开的质量控制方法中是采用液相色谱法测定菝葜中薯蓣皂苷元含量的方法，从而通过测定薯蓣皂苷元的含量对中药材菝葜的质量进行控制。薯蓣皂苷经酸水解生成含有27个碳原子的薯蓣皂苷元，薯蓣皂苷与纤维素结合存在于细胞壁中，由于植物细胞壁比较坚韧，因而经典的酸水解法仅能提取1/4的皂苷元。目前总皂苷水解方法主要采用酸水解，另外还有采用两相溶剂水解法和生物水解法。在酸水解过程中，值得注意的问题是常有副反应发生，一是若用盐酸水解则有可能发生羟基氯代；二是薯蓣皂苷元易脱水转变为Δ3，5-deoxytigogenin，其所得量可随酸的浓度、供试品稀释程度增加而增加，而且苷比苷元更容易形成脱水产物。此外，还可发生25S转25R构型的差向异构化，产生C25-epimer及F环开环的化合物等，因此要注意控制好水解条件(聂凌鸿，林淑英，宁正祥.薯蓣属植物中薯蓣皂苷元的研究进展[J].中国生化药物杂志，2004，25(5)：318～320)。菝葜药材中大量的纤维素和淀粉的存在对水解有干扰作用，因而薯蓣皂苷元的收率低，对于菝葜的含量测定有很大的影响，也影响菝葜含量测定的准确性，同时考虑到薯蓣皂苷元为水解产物，目前药品技术法规也不提倡使用水解产物作为含量测定指标，在实际检验操作中发现，上述方法存在专属性差、操作繁琐、可控性差、含量测定结果稳定性差等不足，影响标准的可推广性。
发明内容
本发明的目的在于克服上述缺陷，提供一种新的质量控制方法，选择菝葜的主要活性成分落新妇苷、黄杞苷为指标同时测定，操作方便、准确、专属性强，能够很好的控制菝葜或含有菝葜原料制剂的质量。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种菝葜的质量控制方法，该方法中含有如下含量测定方法：
1)照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VID)测定，色谱条件与系统适用性试验，用C18或C8(十八烷基硅烷键合硅胶或八烷基硅烷键合硅胶)为填充剂；比例为30-40∶70-60的甲醇-0.1％磷酸溶液或比例为10-20∶80-90的乙腈-0.1％磷酸溶液或比例为0-10∶10-30∶60-90的乙腈-甲醇-0.1％磷酸溶液为流动相；检测波长为280-300nm；柱温为35℃；理论板数按落新妇苷峰计算应不低于5000；
2)对照品溶液的制备：精密称取落新妇苷对照品2mg和黄杞苷对照品2mg，置100ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得，每1ml分别含落新妇苷20μg和黄杞苷20μg的混合溶液；
3)供试品溶液的制备：精密称取菝葜粉末1g，置100ml具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理30-90分钟或回流提取1-3小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
4)测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；菝葜含落新妇苷不得少于0.030％，黄杞苷不得少于0.030％。
上述含量测定方法中，步骤1)中优选比例为30-40∶70-60的甲醇-0.1％磷酸溶液为流动相，更优选比例为35∶65的甲醇-0.1％磷酸溶液为流动相。本发明对流动相进行了选择，比较了比例为5∶20∶75的乙腈-甲醇-0.1％磷酸溶液、比例为35∶65的甲醇-0.1％磷酸溶液和比例为15∶85的乙腈-0.1％磷酸溶液、比例为52∶48的甲醇-水等不同流动相进行筛选，同时，本发明对流动相中甲醇比例用量进行了考察，发现当流动相中甲醇比例用量在30～40％之间变化时不会对含量测定产生影响，故本发明优选比例为30-40∶70-60的甲醇-0.1％磷酸溶液为流动相。同时，结果表明以比例为35∶65的甲醇-0.1％磷酸溶液所得色谱图的分离度、对称性最好，故本发明更优选比例为35∶65的甲醇-0.1％磷酸溶液为流动相。
上述含量测定方法中，步骤1)中检测波长优选290nm。本发明中对检测波长进行了选择，结果表明，落新妇苷在290.2nm有最大吸收，黄杞苷在292nm有最大吸收，样品在相应的保留时间上具有相同的光谱图。综合考虑，本发明优选290nm为检测波长。
上述含量测定方法中，步骤3)中优选采用超声处理30-90分钟，更优选采用超声处理45分钟。本发明对处理方法进行了选择，结果表明，超声处理与回流提取，落新妇苷和黄杞苷含量基本一致，本发明优选较为简单的超声提取方法。本发明还对处理时间进行了筛选，结果表明，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟后，标示性成分落新妇苷和黄杞苷提取已基本达到平衡，为了保证落新妇苷和黄杞苷提取完全，本发明确定供试品溶液制备过程中超声提取时间为45分钟。
现有技术中以水解产物薯蓣皂苷元为控制指标，但是由于菝葜药材中大量的纤维素和淀粉的存在对水解有干扰作用，因而薯蓣皂苷元的收率低，对于菝葜的含量测定有很大的影响，也影响菝葜含量测定的准确性，同时考虑到薯蓣皂苷元为水解产物，目前药品技术法规也不提倡使用水解产物作为含量测定指标，在实际检验操作中发现，上述方法存在专属性差、操作繁琐、可控性差、含量测定结果稳定性差等不足，影响标准的可推广性。本发明中，将其含量测定指标选定为稳定可控的二氢黄酮醇苷类的活性成分落新妇苷和黄杞苷，落新妇苷和黄杞苷为菝葜代表性的主要成分，含量较高、稳定，作为标示性成分控制菝葜药材质量具有较好的专属性和质量相关性；因此本发明选用高效液相色谱法同时测定落新妇苷和黄杞苷的含量来控制菝葜药材的质量。通过研究表明，本发明测定方法操作方便、稳定，能够更全面更准确地控制菝葜药材的质量。
本发明所述的菝葜的质量控制方法，还含有如下鉴别方法：
1)对照品溶液的制备，精密称取落新妇苷对照品2mg和黄杞苷对照品2mg，置100ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得，每1ml分别含落新妇苷20μg和黄杞苷20μg的混合溶液；
2)精密称取菝葜粉末1g，置100ml具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理30-90分钟或回流提取1-3小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
3)按高效液相色谱法测定，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，供试品色谱中应呈现与对照品色谱保留时间相同的色谱峰。
上述鉴别方法，步骤2)中优选采用超声处理30-90分钟，更优选采用超声处理45分钟。
2005版《中国药典》收载菝葜的质量质量控制方法采用酸水解法检测其中水解产物的薯蓣皂苷元，由于薯蓣皂苷在酸水解条件下，由于药材含有大量纤维素及淀粉，影响提取率，同时由于薯蓣皂苷在酸水解的条件下，也会产生副反应，导致薯蓣皂苷元含量除低，而影响鉴别的稳定性。系统的植化分离研究发现二氢黄酮类化合物为菝葜乙酸乙酯提取物的主要成分之一，其中以落新妇苷和黄杞苷含量较高，稳定，作为标示性成分控制菝葜药材质量具有较好专属性和质量相关性，为菝葜药材的主要成分，故本发明用落新妇苷和黄杞苷作为菝葜药材的鉴别。用HPLC进行测定，供试品溶液与落新妇苷、黄杞苷对照品溶液在不同的ODS柱、不同的流动显示相同的保留时间，同时在996二极管阵列检测器对峰进行光谱扫描(210～400nm)显示，供试品溶液与对照品溶液光谱一致。
以上所述的落新妇苷对照品为白色至淡黄色结晶性粉末，含量为98.0％以上，桂林三金药业股份公司提供，化学名：3，5，7，3`，4`-五羟基二氢黄酮-3-O-鼠李糖苷，英文名：Astilbin，分子式：C21H22O11，分子量：450，化学结构式如下：
所述的黄杞苷对照品为白色至灰白色结晶性粉末，含量为98.0％以上，桂林三金药业股份公司提供，化学名：3，5，7，4`-四羟基二氢黄酮-3-O-鼠李糖苷((2R，3R)-3，5，7，4`-tetrahydroxydihydroflavone-3-O-rhamnopyanoside)，英文名：engeletin，分子式：C21H22O10，分子量：434，化学结构式如下：
与现有技术相比，本发明所提供的菝葜的质量控制方法具有如下优点：
(1)本发明将其含量测定指标选定为稳定可控的二氢黄酮醇苷类的活性成分落新妇苷和黄杞苷，落新妇苷和黄杞苷为菝葜代表性的主要成分，含量较高、稳定，作为标示性成分控制菝葜药材质量具有较好的专属性和质量相关性；
(2)本发明选用高效液相色谱法同时测定落新妇苷和黄杞苷的含量来控制菝葜药材的质量，测定方法操作方便、稳定，能够更全面更准确地控制菝葜药材的质量。
附图说明
图1为落新妇苷标准曲线；
图2为黄杞苷标准曲线。
具体实施方式
以下为本发明的具体实施方式，所述的实施例是为了进一步描述本发明，而不是限制本发明。
[实施例1]菝葜的含量测定
(1)照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VID)测定，色谱条件与系统适用性试验，用C18或C8(十八烷基硅烷键合硅胶或八烷基硅烷键合硅胶)为填充剂；比例为35∶65的甲醇-0.1％磷酸溶液为流动相；检测波长为290nm；柱温为35℃；理论板数按落新妇苷峰计算应不低于5000；
(2)对照品溶液的制备，精密称取落新妇苷对照品2mg和黄杞苷对照品2mg，置100ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得，每1ml分别含落新妇苷20μg和黄杞苷20μg的混合溶液；
(3)精密称取菝葜粉末1g，置100ml具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理提取(功率250W，频率40kHz)45分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
(4)测定法，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；菝葜含落新妇苷不得少于0.030％，黄杞苷不得少于0.030％。
[实施例2]菝葜的含量测定
具体操作步骤同实施例1，不同的是步骤(1)中以比例为30∶70的甲醇-0.1％磷酸溶液为流动相；检测波长为280nm；步骤(3)中采用超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟。
[实施例3]菝葜的含量测定
具体操作步骤同实施例1，不同的是步骤(1)中以比例为40∶60的甲醇-0.1％磷酸溶液为流动相。
[实施例4]菝葜的含量测定
具体操作步骤同实施例1，不同的是步骤(1)中以比例为30∶70的甲醇-0.1％磷酸溶液为流动相；检测波长为300nm；步骤(3)中采用超声处理(功率250W，频率40kHz)90分钟。
[实施例5]菝葜的含量测定
具体操作步骤同实施例1，不同的是步骤(1)中以比例10∶90的乙腈-0.1％磷酸溶液为流动相。
[实施例6]菝葜的含量测定
具体操作步骤同实施例1，不同的是步骤(1)中以比例为20∶80的乙腈-0.1％磷酸溶液为流动相；检测波长为280nm；步骤(3)中采用回流提取1小时。
[实施例7]菝葜的含量测定
具体操作步骤同实施例1，不同的是步骤(1)中以比例为0∶10∶90的乙腈-甲醇-0.1％磷酸溶液为流动相；步骤(3)中采用回流提取3小时。
[实施例8]菝葜的含量测定
具体操作步骤同实施例1，不同的是步骤(1)中以比例为10∶30∶60的乙腈-甲醇-0.1％磷酸溶液为流动相。
[实施例9]菝葜的含量测定
具体操作步骤同实施例1，不同的是步骤(1)中以比例为5∶25∶70的乙腈-甲醇-0.1％磷酸溶液为流动相。
[实施例10]菝葜的鉴别
(1)对照品溶液的制备，精密称取落新妇苷对照品2mg和黄杞苷对照品2mg，置100ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得，每1ml分别含落新妇苷20μg和黄杞苷20μg的混合溶液；
(2)精密称取菝葜粉末1g，置100ml具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)45分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
(3)测定法，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，供试品色谱中应呈现与对照品色谱保留时间相同的色谱峰。
[实施例11]菝葜的鉴别
具体操作步骤同实施例9，所不同的是步骤(2)中超声处理时间为30分钟。
[实施例12]菝葜的鉴别
具体操作步骤同实施例9，所不同的是步骤(2)中超声处理时间为90分钟。
[实施例13]菝葜的鉴别
具体操作步骤同实施例9，所不同的是步骤(2)中采用回流提取1小时。
[实施例14]菝葜的鉴别
具体操作步骤同实施例9，所不同的是步骤(2)中采用回流提取3小时。
[实施例15]菝葜的鉴别
具体操作步骤同实施例9，所不同的是步骤(2)中采用回流提取2小时。
以下为本发明的试验例，所述试验例为本发明的含量测定方法提供依据。
[试验例1]
1、仪器、药品与试剂
1.1仪器名称及检测器种类
SHIMADZU LC-2010A色谱仪，VP UV-VIS检测器，CLAS-VP液相色谱工作站及Waters2695高效液相色谱仪，Waters996二极管距阵检测仪，Empower色谱工作站。
1.2对照品落新妇苷和黄杞苷的来源和纯度检查
落新妇苷和黄杞苷对照品为桂林三金药业股份有限公司提供，批号均为070108。
精密称取置五氧化二磷干燥器中干燥至恒重的落新妇苷和黄杞苷对照品各10.0mg，分别置10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1ml含1.0mg的落新妇苷(实际为1.203mg/ml)和黄杞苷(实际为1.275mg/ml)对照品溶液，精密吸取10μl，分别注入液相色谱仪，连续测定3次，用归一化法计算落新妇苷平均含量为98.95％，黄杞苷平均含量为99.97％，符合含量测定用对照品纯度要求，考虑到实际测定方便，测定中对照品含量以100％计。结果见表1。
表1落新妇苷、黄杞苷对照品纯度检查
1.3色谱条件与系统适用性试验
以C18或C8(十八烷基硅烷键合硅胶或八烷基硅烷键合硅胶)为填充剂；以甲醇-0.1％磷酸溶液(35±10∶65±5)为流动相(也可以用乙腈-磷酸溶液或乙腈-甲醇-磷酸溶液)；检测波长为290nm；柱温为35℃。理论板数按落新妇苷峰计算应不低于5000。
1.4药品及试剂
落新妇苷和黄杞苷对照品为桂林三金药业股份有限公司提供。
菝葜药材来源于桂林药材公司，并经该公司质检处鉴定。甲醇、乙腈为色谱纯；水为超纯水；磷酸为分析纯。
2、实验条件的选择
2.1液相条件的选择
2.1.1测定波长的选择
取落新妇苷对照品溶液(0.1203mg/ml)、黄杞苷对照品溶液(0.1275mg/ml)各5μl和菝葜供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。用996二极管阵列管检测器进行了扫描检测(210～400nm)，落新妇苷在290.2nm有最大吸收，黄杞苷在292nm有最大吸收，样品在相应的保留时间上具有相同的光谱图。综合考虑，选择290nm为检测波长。
2.1.2流动相的选择
流动相选择中，比较比例为5∶20∶75的乙腈-甲醇-0.1％磷酸溶液、比例为35∶65的甲醇-0.1％磷酸溶液和比例为15∶85的乙腈-0.1％磷酸溶液、比例52∶48的甲醇-水等不同流动相进行筛选，结果表明以比例为35∶65的甲醇-0.1％磷酸溶液所得色谱图的分度度、对称性最好，故本发明优选比例为35∶65的甲醇-0.1％磷酸溶液为流动相。
2.1.3色谱柱的选择
在选择的流动相基础上，选择了色谱柱1(Waters SUNfireTM ODS 250×4.60mm5μm)、柱2(Agilent Extend-C18 4.6×250mm 5μm)、柱3(YMC-pack ODS-AQ-302150×4.60mm 5μm)、柱4(依利特YWG C18柱250×4.60mm 10μm)和柱5phenomenex PRODIGY C18柱(250×4.60mm 100A)其中以Agilent Extend-C184.6×250mm 5μm分度度和对称因子都较好，故选用Agilent Extend-C18 4.6×250mm5μm为研究分析柱。研究结果见表2：
表2落新妇苷、黄杞苷峰理论塔板数和分离度结果
根据试验结果，综合考虑到仪器、色谱柱、流动相的配制和温度等系统因素的影响，其柱效和分离度都有一定的影响，因而在确保落新妇苷和黄杞苷与杂质达到分离的前提下，规定理论板数按落新妇苷峰计算应不低于5000，按黄杞苷峰计算应不低于5000。综合文献及本发明研究结果，确定本发明的色谱条件如下：
色谱柱：Agilent Extend-C18 4.6×250mm 5μm
流动相：甲醇-0.1％磷酸溶液(35∶65)
灵敏度1.2AU
检测波长：290nm
柱温：35℃
流速：1.0ml/min
2.2供试品处理方法的选择
2.2.1提取溶剂的选择
取菝葜(批号：20051213)粉末约0.5g(过2号筛)，精密称定，共3份，分别置具塞三角烧瓶中，分别加75％乙醇、乙醇、甲醇50ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)45分钟，放冷，再称定重量，加甲醇补足减失的重量，即得。滤过，取续滤液进样，测定其含量，结果见表3：
表3不同提取溶剂提取效果比较
结果表明，甲醇的提取效果最好，故选择甲醇作为提取溶剂。
2.2.2处理方法的选择
取菝葜(批号：20051213)粉末(过2号筛)约0.5g，精密称定，共2份，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，摇匀，称定重量，一份采用超声(功率250W，频率40kHz)提取45分钟，另一份采用回流提取3小时。提取完毕，分别放冷，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。照含量测定项下方法进行测定，计算落新妇苷和黄杞苷的平均含量，见表4。
表4不同提取方法含量测定结果比较
结果表明，超声45分钟与回流提取3小时，落新妇苷和黄杞苷含量基本一致，故采用较为简便的超声提取方法。
2.2.3超声提取时间的考察
取菝葜(批号：20051213)粉末(过2号筛)约0.5g，精密称定，共3份，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，摇匀，称定重量，分别超声(功率250W，频率40kHz)提取15min、30min、45min，放冷，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。照含量测定项下方法进行测定，不同超声时间含量测定结果见表5。
表5不同提取时间含量测定结果比较
结果表明，超声(功率250W，频率40kHz)提取30分钟后，标示性成分落新妇苷和黄杞苷提取已基本达到平衡，为了保证落新妇苷和黄杞苷提取完全，故确定供试品溶液制备过程中超声提取时间为45分钟。
综上研究，供试品溶液制备方法确定为：取本品粉末(过2号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，摇匀，称定重量，超声(功率250W，频率40kHz)提取45分钟，放冷，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.3落新妇苷和黄杞苷对照品溶液的制备
精密称取置五氧化二磷干燥器中干燥至恒重的落新妇苷、黄杞苷对照品10mg、15mg(实际称样量为落新妇苷10.80mg，黄杞苷15.88mg)，置100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备溶液；精密吸取对照品储备溶液1ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
在完成十批样品含量检测后，发现有些批次菝葜中落新妇苷和黄杞苷含量较低，同时由于不同检测器灵敏度的原因，有时目标峰面积值较小，为了更好地确保含量测定的准确性将对照品和供试品制备方法调整如下：
对照品溶液的制备：精密称取落新妇苷对照品、黄杞苷对照品，加甲醇制成每1ml分别含20μg的混合溶液，即得。
供试品溶液的制备：取菝葜粉末(过二号筛)约1g，精密称定，置100ml具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)45分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
3、方法学验证
3.1准确度试验
称取菝葜9份(批号为20051213，其中落新妇苷含量为0.123％，黄杞苷含量为0.276％)，每份约0.25g，分别置具塞锥形瓶中，每3份一组，分别精密加入浓度为0.2484mg/ml、0.3105mg/ml、0.3726mg/ml的落新妇苷对照品溶液各1.0ml；再分别依次加入精密计量的浓度为0.4328mg/ml、0.5410mg/ml、0.6492mg/ml黄杞苷对照品溶液各1.0ml。挥干甲醇，按【含量测定】项下的操作制备供试品溶液测定含量，计算回收率。本方法中落新妇苷对照品平均加样回收率为100.90％，RSD＝1.47％，黄杞苷对照品平均加样回收率为98.71％，RSD＝0.095％，回收率良好，符合规定要求。结果见表6-1和6-2。
表6-1落新妇苷加样回收率实验数据
表6-2黄杞苷加样回收率实验数据
3.2精密度的考察
取批号20051213样品，制备供试品溶液，连续进样6次，测定峰面积，结果见表7，结果表明精密度较好。
表7精密度试验结果
3.3重复性试验
精密称取批号为20051213的菝葜样品5份，按供试品溶液制备方法制备供试品，测定含量，结果见表8，结果表明样品测定重复性较好。
表8重复性试验结果
3.4落新妇苷及黄杞苷检测限和定量限的考察
精密取含量测定项下对照品溶液(落新妇苷浓度0.01028mg/ml，黄杞苷浓度0.01428mg/ml)，用甲醇稀释1000倍，所得溶液精密取10μl，按含量测定项下的色谱条件和方法注入色谱仪测定。
根据色谱分析，落新妇苷和黄杞苷对照溶液稀释1000倍后其色谱峰高度约为空白试验中色谱图基线噪声的2～3倍，根据样品检出限的规定，样品峰高度为仪器噪声高度2或3倍时，该检测值即为样品的最低检出限。样品峰高度低于该值即视为噪声。因此，本品中落新妇苷和黄杞苷的检出限分别为0.1ng和0.14ng。
根据定量限的规定，样品峰高度为仪器噪声高度10倍时，该检测值即为样品的定量限。根据色谱分析，落新妇苷对照溶液稀释200倍及黄杞苷对照品溶液稀释300倍，其色谱峰高度分别约为空白试验中色谱图基线噪声的10倍，样品峰高度低于该值即视为噪声。因此，本品中落新妇苷和黄杞苷的检出限分别为0.5ng和0.48ng。
3.5落新妇苷和黄杞苷线性关系考察
取落新妇苷(0.1020mg/ml)及黄杞苷(0.1160mg/ml)的对照品混合溶液，吸取上述混合溶液0.5ml、1ml、2ml、3ml、5ml置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。吸取上述各溶液分别进样10μl，按含量测定项下的方法对该标准溶液进行测定，记录落新妇苷和黄杞苷的峰面积，以进样量为纵坐标，其峰面积为横坐标，分别绘制标准曲线。落新妇苷进样量在0.0510～1.020μg的范围内标准曲线回归方程为：Y＝4.469×10-7X+0.03191(r＝0.9997)，黄杞苷进样量在0.0580～1.160μg的范围内标准曲线回归方程为：Y＝5.906×10-7X-0.00222(r＝0.9997)，线性良好，符合要求。结果见表9。
表9落新妇苷及黄杞苷标准曲线实验数据
以上结果表明，落新妇苷进样量在0.0510～1.020μg的范围内、黄杞苷进样量在0.0580～1.160μg的范围内，落新妇苷与黄杞苷峰面积与进样量呈现良好的线性关系。
3.6耐用性试验
3.6.1供试品稳定性考察试验
取批号为20051213样品，制备供试品溶液，分别在0、160、320、480、640、800、960分钟内测定，结果见表10，结果表明供试品在16小时内稳定。
表10稳定性试验结果
3.6.2流动相组成比例的考察
取批号为20051213样品，按【含量测定】项下方法，制备供试品溶液，以甲醇-0.1％磷酸溶液(35∶65)的流动相甲醇用量变化对保留时间、分离度含量测定的影响。结果见表11。
表11甲醇量变化对测定的影响
综合上述数据，流动相中甲醇比例用量在30～40％之间变化，不会对含量测定产生影响。
3.6.3不同厂家色谱柱的考察
取批号为20051213样品，按【含量测定】项下方法，制备供试品溶液，用不同品牌的色谱柱对其进行含量测定。色谱柱1(Waters SUNfireTM ODS 250×4.60mm 5μm)、柱2(Agilent Extend-C18 4.6×250mm 5μm)、柱3(YMC-pack ODS-AQ-302 150×4.60mm5μm)。结果见表12。
表12落新妇苷、黄杞苷峰理论塔板数和分离度结果
考察表明，在柱效和分离度达到要求(分离度＞1.5)情况下，不同品牌的柱子对含量测定没有影响。
3.6.4不同检测波长的考察
分别在288、290nm、292nm条件下测定样品(批号20051213)含量，检测结果见表13
表13不同检测波长的含量测定结果
结果表明，波长在290nm附近微小波动对落新妇苷和黄杞苷含量测定影响很小。
3.6.5柱温变化的考察
分别在30℃、35℃、40℃条件下测定样品(批号20051213)含量，测定结果见表14。
表14测定温度的选择
结果表明，柱温在较小范围内变化不会对供试品含量测定产生影响。
3.6.6流速变化的考察
分别考察流速为0.98ml/min、1.0ml/min、1.02ml/min条件下样品(批号20051213)测定的保留时间、分离度和含量的变化，测定结果见表15。
表15测定流速的选择
结果表明，流速的微小变化对含量测定没有影响。
3.6.7流动相pH变化的考察
分别考察磷酸溶液浓度为0.05％、0.1％、0.15％条件样品(批号20051213)测定结果的变化，测定结果见表16。
表16磷酸浓度的选择
结果表明，流动相pH的微小变化对含量测定结果影响较小。由于0.05％的磷酸溶液图谱中目标峰的对称因子欠佳，故选择浓度为0.1％的磷酸溶液。
4、含量限度的制定
按样品【含量测定】项下方法先后测定了十批菝葜药材中落新妇苷和黄杞苷的含量，结果见表17。
表17十批样品中落新妇苷和黄杞苷的含量测定结果
表18检测2007年样品中落新妇苷和黄杞苷的含量测定结果
含量限度的制定：菝葜药材中所含的落新妇苷和黄杞苷含量波动较大，其中每批药材所含的落新妇苷含量与黄杞苷含量没有明确的相关性，本发明对申请人2007年的二十批药材进行了含量测定研究，测定结果见表18，发现落新妇苷和黄杞苷的含量波动仍然较大，为了避免由于药材受产地、采收季节影响、操作、贮藏及运输等因素造成的含量波动，按菝葜药材中落新妇苷和黄杞苷的含量最低值下浮10％为其限度，其中落新妇苷最低值为0.030％，下浮10％即为0.027％，黄杞苷的含量最低值为0.032％，下浮10％即为0.029％，据此规定本品按干燥品计算，含落新妇苷(C21H22O11)不得少于0.030％，黄杞苷(C21H22O10)不得少于0.030％。
Claims (9)
1.一种菝葜的检测方法，其特征在于该方法中含有如下含量测定方法：
1)照高效液相色谱法测定，色谱条件与系统适用性试验，用C18或C8为填充剂；比例为30-40∶70-60的甲醇-0.1％磷酸溶液或比例为10-20∶80-90的乙腈-0.1％磷酸溶液或比例为0-10∶10-30∶60-90的乙腈-甲醇-0.1％磷酸溶液为流动相；检测波长为280-300nm；柱温为35℃；理论板数按落新妇苷峰计算不低于5000；
2)对照品溶液的制备：精密称取落新妇苷对照品2mg和黄杞苷对照品2mg，置100ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得，每1ml分别含落新妇苷20μg和黄杞苷20μg的混合溶液；
3)供试品溶液的制备：精密称取菝葜粉末1g，置100ml具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理30-90分钟或回流提取1-3小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
4)测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；菝葜含落新妇苷≥0.030％，黄杞苷≥0.030％。
2.根据权利要求1所述的菝葜的检测方法，其特征在于步骤1)中以比例为30-40∶70-60的甲醇-0.1％磷酸溶液为流动相。
3.根据权利要求2所述的菝葜的检测方法，其特征在于步骤1)中以比例为35∶65的甲醇-0.1％磷酸溶液为流动相。
4.根据权利要求1所述的菝葜的检测方法，其特征在于步骤1)中检测波长为290nm。
5.根据权利要求1所述的菝葜的检测方法，其特征在于步骤3)中采用超声处理30-90分钟。
6.根据权利要求5所述的菝葜的检测方法，其特征在于步骤3)中采用超声处理45分钟。
7.根据权利要求1-6任意一项所述的菝葜的检测方法，其特征在于该方法中还含有如下鉴别方法：
1)对照品溶液的制备，精密称取落新妇苷对照品2mg和黄杞苷对照品2mg，置100ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得，每1ml分别含落新妇苷20μg和黄杞苷20μg的混合溶液；
2)精密称取菝葜粉末1g，置100ml具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理30-90分钟或回流提取1-3小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
3)按高效液相色谱法测定，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，供试品色谱中呈现与对照品色谱保留时间相同的色谱峰。
8.根据权利要求7所述的菝葜的检测方法，其特征在于步骤2)中采用超声处理30-90分钟。
9.根据权利要求8所述的菝葜的检测方法，其特征在于步骤2)中采用超声处理45分钟。
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