CN109001307B - 三金制剂的hplc特征图谱及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，具体地说，涉及三金制剂的HPLC特征图谱及其构建方法。所述的HPLC特征图谱包括9个特征峰，其中6号峰为积雪草苷对照峰，其它8个特征峰的相对保留时间为：1号峰0.41，2号峰0.53，3号峰0.13，4号峰0.12，5号峰0.26，7号峰0.14，8号峰0.13，9号峰0.12。本发明首次建立了三金片正丁醇部位特征图谱，可以在简便条件下同步跟踪检测处方4味主要药味的多个主要成分，全面提升三金制剂的质控标准，提升产品核心竞争力，为确保三金片产品质量和临床疗效稳定奠定坚实基础。此外，该HPLC特征图谱的建立方法可操作性强，重现性好，为更好地控制三金制剂的质量提供了科学依据。

Description

三金制剂的HPLC特征图谱及其构建方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体地说，涉及三金制剂的HPLC特征图谱及其构建方法。

背景技术

三金片由金樱根、积雪草等5味中药组成，具有清热解毒，利湿通淋，益肾功效，主要用于治疗急、慢性肾盂肾炎，膀胱炎及尿路感染等症。三金片作为本申请人独家品种，近年来一直是治疗尿路感染同类中成药的第一品牌，其现行《中国药典》标准包括处方4味药材的薄层鉴别和羟基积雪草苷的含量测定，但尚不能对本品主要物质基础进行整体评价。

申请号为200510200471.8的中国专利申请涉及一种治疗泌尿系统等疾病的三金药物制剂及制备方法和质量控制方法。该申请中所涉及的质量控制方法包括(1)金樱根药材、积雪草苷、薯蓣皂苷元的薄层色谱鉴别测试方法；(2)三金制剂中积雪草苷、羟基积雪草苷全部或部分成分的含量测试方法。该方法依旧采用了薄层色谱法(TLCS法)，依旧存在精密度、重现性、稳定性较差，显色不稳定、测定偏差大的不足。

针对上述缺陷，申请人于2004年7月2日提出了申请号为200410050066.8的中国专利申请，并授予了发明专利权。该专利公开了一种三金制剂的新的质量控制方法，该方法包括含量测定项，含量测定采用的是HPLC-ELSD法。

但是，经过系统的分离研究发现，野蔷薇苷与蔷薇苷为金樱根的特征性活性成分，而金樱根又是三金制剂的必须组分，故增加野蔷薇苷与蔷薇苷为控制三金制剂质量的指标成分是十分必要的。而现有的质量标准及质量控制方法均不含野蔷薇苷和/或蔷薇苷含量的测定，可见，现有的质量标准及质量控制方法对三金制剂的质量检测不够全面，对质量控制依旧存在着一定的缺陷，势必存在一定的用药风险。鉴于此，本申请人于2011年1月26日提出了一种新的质量控制方法(申请号为201110028317.2)，该方法在HPLC-ELSD法测定羟基积雪草苷含量的基础上增加了HPLC-ELSD法测定野蔷薇苷和/或蔷薇苷的含量，使三金制剂的质量控制指标更加全面。

而对其成分的检测并不能真正反映药材的质量。近年来，特征图谱作为中成药质量标准整体评价模式，在《中国药典》收载中呈上升趋势。因此，目前存在对于能够全面表征三金制剂成分特征的HPLC特征图谱的需求，三金制剂的质量控制方法和质量控制标准有待于进一步完善，为全面提升三金片的质控标准，提升产品核心竞争力，本发明在系统研究基础上，系统完成了色谱条件的探索、方法学考察，首次建立了三金片正丁醇部位特征图谱，可以在简便条件下同步跟踪检测处方4味主要药味的多个主要成分，为确保三金片产品质量和临床疗效稳定奠定坚实基础，从而完成了本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种三金制剂的HPLC特征图谱。

本发明的另一个目的在于提供一种三金制剂的质量检测方法。

本发明的又一目的在于提供上述HPLC特征图谱的建立方法。

本发明的再一目的在于提供上述三金制剂的HPLC特征图谱在三金制剂的鉴定、检测中的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一方面，本发明提供了一种三金制剂的HPLC特征图谱，其中，所述的HPLC特征图谱包括9个特征峰，其中6号峰为积雪草苷对照峰，其它8个特征峰的相对保留时间为：1号峰0.41，2号峰0.53，3号峰0.13，4号峰0.12，5号峰0.26，7号峰0.14，8号峰0.13，9号峰0.12。

另一方面，本发明提供一种三金制剂的质量检测方法，其中，所述的质量检测方法包括将待检测三金制剂的HPLC特征图谱与上述三金制剂的HPLC特征图谱进行比较。

具体地说，所述的质量检测方法包括如下步骤：

1)使用HPLC法得到待检测三金制剂的HPLC特征图谱，并使用积雪草苷为对照峰，计算各色谱峰的相对保留时间；

2)将步骤1)得到的相对保留时间与本发明所述的三金制剂的HPLC特征图谱中特征峰相对保留时间比较；

3)根据步骤2)的比较结果判断所述待检测三金制剂的质量是否符合标准。

又一方面，本发明提供所述的三金制剂的HPLC特征图谱的构建方法，其中，所述的HPLC特征图谱的构建方法包括如下步骤：

1)色谱条件：C₁₈色谱柱，流动相：乙腈-水-冰醋酸-三乙胺，其中水∶冰醋酸∶三乙胺的体积比为100∶0.1∶0.05，进行梯度洗脱；流速1ml/mim；柱温：23℃；检测波长：210nm；进样量20μl；

2)对照品溶液的制备：取积雪草苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.6mg的溶液；

3)供试品溶液的制备：取三金制剂，研细，加人甲醇，超声处理，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过；量取续滤液回收溶剂至干，残渣加水溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取，合并正丁醇提取液，用氨试液和水依次洗涤，取正丁醇液，回收溶剂至干，残渣用甲醇溶解，转移至量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

4)特征图谱构建：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，即得三金制剂的HPLC特征图谱。

三金片正丁醇部位中所含成分较多，曾采用不同浓度的甲醇超声或回流提取再用正丁醇萃取的方式来制备供试品溶液，效果均不佳，最终根据《中国药典》2015年版中三金片供试品溶液制备项下的处理方法以及一系列选择性试验，确定甲醇超声，在正丁醇萃取，正丁醇层用5％氨试液和水各洗涤一次；曾分别用甲醇-水、乙腈-水、乙腈-甲醇-0.5％醋酸铵、乙腈-甲醇-0.5％冰醋酸、乙腈-甲醇-0.2％甲酸、甲醇-水-冰醋酸-三乙胺作为流动相进行梯度洗脱，结果表明甲醇-水-冰醋酸-三乙胺效果最佳；对不同柱温23℃、25℃、30℃、35℃进行筛选，结果表明，低温有助于色谱峰分离(见图8)。最终优化得到本发明的色谱条件，在此条件下，各色谱峰分离效果较好，可用于三金片正丁醇部位特征图谱分析。

其中，步骤1)中，所述的梯度洗脱按如下程序进行：0min→35min→40min→70min，流动相中乙腈体积浓度变化为20％→26％→28％→34％，流动相中水溶液体积浓度变化为80％→72％→72％→66％。

本发明采用HPLC梯度洗脱法对三金片正丁醇部位进行研究，建立了三金片正丁醇部位特征图谱，以相对保留时间标定了9个共有峰，用于定性鉴别，实验证明该方法稳定、可靠，为三金片提供一种鉴别样品真伪以及生产企业的质量标准，也对三金片持续的系统基础研究，有较好的技术积累，为确保三金片产品质量和临床疗效稳定奠定坚实基础。

上述构建方法中，步骤2)中，对照品溶液的制备为：取积雪草苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.6mg的溶液，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得。

上述构建方法中，步骤3)中，供试品溶液的制备为：取三金制剂大片20片或小片30片，精密称定，研细，取3g，精密称定，精密加人甲醇30ml，称定重量，超声处理45分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过；精密量取续滤液20ml回收溶剂至干，残渣加水20ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次15ml，合并正丁醇提取液，用5％氨试液洗涤1次，每次45ml，再用水洗涤1次，每次45ml，取正丁醇液，减压回收溶剂至干，残渣用甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

优选，超声处理功率为250W，频率为40kHz。

再一方面，本发明提供所述的三金制剂的HPLC特征图谱在三金制剂的质量检测中的应用。

本发明中，所述的三金制剂包括但不限于三金片。

本发明在全面、系统研究的基础上，系统完成了色谱条件的探索、方法学考察，首次建立了三金片正丁醇部位特征图谱，可以在简便条件下同步跟踪检测处方4味主要药味的多个主要成分，全面提升三金片的质控标准，提升产品核心竞争力，为确保三金片产品质量和临床疗效稳定奠定坚实基础。此外，该HPLC特征图谱的建立方法可操作性强，重现性好，为更好地控制三金制剂的质量提供了科学依据。

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述。

附图说明

图1为积雪草苷对照品HPLC图谱；

图2为三金片HPLC特征图谱(6：积雪草苷)；

图3为十五批三金片HPLC图谱(R：对照图谱)；

图4为三金片、金沙藤对比HPLC图；

图5为三金片、积雪草对比HPLC图；

图6为三金片、菝葜对比HPLC图；

图7为三金片、金樱根对比HPLC图。

图8为不同柱温下三金片HPLC色谱图。

需要说明的是，这些附图和文字描述并不旨在以任何方式限制本发明的构思范围，而是通过参考特定实施例为本领域技术人员说明本发明的概念。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1、三金制剂HPLC特征图谱的高效液相色谱法的建立

1、仪器与试药

1.1仪器

Waters2695型高效液相色谱仪，Waters2998检测器；METTLER TTOLEDO XP404S电子天平；BRANSON S7500超声清洗器。

1.2试药

对照品积雪草苷(批号：110892-201505，纯度：91.2％)均由中国食品药品检定研究院提供。15批三金片为桂林三金药业股份有限公司生产，批号分别为1602001、1604011、1606001、1608001、1610001、1503002、1505001、1507002、1509003、1512002、170227、170308、170320、1307044、1305044。乙腈为进口色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2、方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱：CAPCELL PAK AQ C18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈-水-冰醋酸-三乙胺，其中水∶冰醋酸∶三乙胺(100∶0.1∶0.05)，进行梯度洗脱(程序见表1)；流速1ml/mim；柱温：23℃；检测波长：210nm；进样量20μl。

表1、梯度洗脱程序

时间(min)	乙腈(％)	水溶液(％)
			0	20	80
35	26	74
			40	28	72
70	34	66

2.2溶液制备

2.2.1对照品溶液的制备：

取积雪草苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.6mg的溶液，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得。

2.2.2供试品溶液的制备：

取本品20片(大片)或30片(小片)，精密称定，研细，取约3g，精密称定，精密加人甲醇30ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)，45分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液20ml回收溶剂至干，残渣加水20ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次15ml，合并正丁醇提取液，用5％氨试液洗涤1次，每次45ml，再用水洗涤1次，每次45ml，取正丁醇液，减压回收溶剂至干，残渣用甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3特征图谱

2.3.1特征图谱的建立

精密吸取对照品溶液20μl，按“2.1”项色谱条件下进样分析，记录色谱图，得到对照品HPLC图谱；取15批三金片样品适量，分别按“2.1”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样分析，建立特征图谱，图谱见图1和图2。

2.3.2特征图谱共有色谱峰的标定

取15批三金片样品适量，分别按“2.1”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样分析，记录色谱图，可见6号峰为对照品积雪草苷，出峰时间居中，周围干扰较小，含量相对较高，故选择以积雪草苷峰为对照峰S，分别对共有峰的相对保留时间进行考察。结果表明，15批样品共有峰相对保留时间的RSD均小于0.6％，将15批色谱图按照“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(V2.0)”进行分析，选择稳定性、重复性好以及特征明显的色谱峰为共有峰，共标定9个共有峰，选定这9个峰进行峰匹配，设定标准模板，并以此共有模式为标准，建立了三金片HPLC特征图谱，进行整体相似度评价，结果表明，其相似度均为0.95以上，各共有峰相对保留时间RSD均小于0.3％。结果见表2和表3，图3。

表2、共有峰相对保留时间RSD结果

峰编号	1	2	3	4	5	S6	7	8	9
										RSD％	0.41	0.53	0.13	0.12	0.26	0	0.14	0.13	0.12

表3、相似度评价结果

编号	1批	2批	3批	4批	5批	6批	7批	8批
									相似度(参照)	1	0.996	0.986	0.956	0.977	0.983	0.989	0.992
相似度(对照)	0.995	0.996	0.992	0.960	0.986	0.985	0.996	0.995

表3、相似度评价结果(续)

编号	9批	10批	11批	12批	13批	14批	15批
								相似度(参照)	0.967	0.982	0.984	0.990	0.988	0.985	0.986
相似度(对照)	0.985	0.993	0.980	0.986	0.981	0.997	0.997

(注：1批：1602001、2批：1604011、3批：1606001、4批：1608001、5批：1610001、6批：1503002、7批：1505001、8批：1507002、9批：1509003、10批：1512002、11批：1702007、12批：170308、13批：170320、14批：1307043、15批：1309003)

2.3.3色谱峰归属分析

取本品(批号170227)、金樱根药材、金沙藤药材、菝葜药材、积雪草药材、羊开口药材适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样分析，通过各峰的保留时间和紫外光谱对比分析，确定了部分峰的归属。在图谱中指认了8个峰，其中1号峰来自金沙藤，3、4、6号峰来自积雪草，5、8、9号峰来自金樱根，10号峰来自菝葜。色谱图见图4至图7。

实施例2、用于建立三金制剂HPLC特征图谱的高效液相色谱法的方法学考察

对实施例1中建立的三金制剂HPLC特征图谱的高效液相色谱法进行了以下几个方面的考察。

1、精密度试验

取同一批样品(批号170227)，按实施例1中供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，在实施例1中色谱条件下进行测试，连续进样6次，记录色谱图，可见6号峰为对照品积雪草苷，出峰时间居中，周围干扰较小，含量相对较高，故选择以积雪草苷峰为对照峰S，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(V2.0)”进行评价。结果表明，其相似度均大于0.990，各共有峰相对保留时间RSD均小于0.3％，表明该仪器精密度良好，结果见表4至表5。

表4、共有峰相对保留时间RSD结果

峰编号	1	2	3	4	5	S6	7	8	9
										RSD％	0.19	0.13	0.28	0.18	0.11	0	0.22	0.21	0.28

表5、相似度评价结果

编号	1	2	3	4	5	6
							相似度(参照)	1	0.999	0.999	0.999	1	0.999
相似度(对照)	1	1	1	0.999	1	1

2、稳定性试验

取同一批样品(批号170227)，按实施例1中供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，在实施例1中色谱条件下于0、2、4、6、8、10、12、24h进样测定，记录色谱图，并对其相似度进行评价。结果表明，其相似度均大于0.990，各共有峰相对保留时间RSD均小于0.3％，表明供试品溶液在24h内稳定性良好，结果见表6至表7。

表6、共有峰相对保留时间RSD结果

峰编号	1	2	3	4	5	S6	7	8	9
										RSD％	0.25	0.15	0.18	0.17	0.11	0	0.14	0.15	0.19

表7、相似度评价结果

编号	0	2	4	6	8	10	12	24
									相似度(参照)	1	0.999	0.999	0.999	1	0.999	0.999	1
相似度(对照)	1	1	0.999	1	1	1	1	1

3、重复性试验

取本品适量(批号170227)，平行6份，分别按实施例1中供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，在实施例1中色谱条件下进行测试，记录色谱图，并对其相似度进行评价。结果表明，其相似度均为0.990以上，各共有峰相对保留时间RSD均小于0.2％，表明该方法重复性良好，结果见表8至表9。

表8、共有峰相对保留时间RSD结果

峰编号	1	2	3	4	5	S6	7	8	9
										RSD％	0.16	0.11	0.11	0.11	0.09	0	0.04	0.07	0.11

表9、相似度评价结果

编号	1-1	1-2	2-1	2-2	3-1	3-1	4-1	4-1	5-1	5-2	6-1	6-2
													相似度(参照)	1	1	1	0.998	1	0.999	0.999	0.996	0.998	0.999	0.998	0.999
相似度(对照)	0.999	0.999	1	1	1	1	1	0.999	1	1	1	1

试验例

三金片正丁醇部位中所含成分较多，曾采用不同浓度的甲醇超声或回流提取再用正丁醇萃取的方式来制备供试品溶液，效果均不佳，最终根据《中国药典》2015年版中三金片供试品溶液制备项下的处理方法以及一系列选择性试验，确定甲醇超声，在正丁醇萃取，正丁醇层用5％氨试液和水各洗涤一次；曾分别用甲醇-水、乙腈-水、乙腈-甲醇-0.5％醋酸铵、乙腈-甲醇-0.5％冰醋酸、乙腈-甲醇-0.2％甲酸、甲醇-水-冰醋酸-三乙胺作为流动相进行梯度洗脱，结果表明甲醇-水-冰醋酸-三乙胺效果最佳；对不同柱温23℃、25℃、30℃、35℃进行筛选，结果表明，低温有助于色谱峰分离(见图8)。最终优化得到实施例1中“2.1”项下的色谱条件，在此条件下，各色谱峰分离效果较好，可用于三金片正丁醇部位特征图谱分析。

以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本发明的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许变动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。

Claims (6)

1.一种三金制剂的HPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，所述的HPLC特征图谱的构建方法包括如下步骤：

1)色谱条件：C₁₈色谱柱，流动相：乙腈-水-冰醋酸-三乙胺，其中水∶冰醋酸∶三乙胺的体积比为100：0.1：0.05，进行梯度洗脱；流速1ml/mim；柱温：23℃；检测波长：210nm；进样量20μl；

所述的梯度洗脱按如下程序进行：0min→35min→40min→70min，流动相中乙腈体积浓度变化为20％→26％→28％→34％，流动相中水溶液体积浓度变化为80％→74％→72％→66％；

2)对照品溶液的制备：取积雪草苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.6mg的溶液；

3)供试品溶液的制备：取三金制剂，研细，加入甲醇，超声处理，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过；量取续滤液回收溶剂至干，残渣加水溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取，合并正丁醇提取液，用氨试液和水依次洗涤，取正丁醇液，回收溶剂至干，残渣用甲醇溶解，转移至量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

4)特征图谱构建：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，即得三金制剂的HPLC特征图谱。

2.根据权利要求1所述的三金制剂的HPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，步骤2)中，对照品溶液的制备为：取积雪草苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.6mg的溶液，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得。

3.根据权利要求1所述的三金制剂的HPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，步骤3)中，供试品溶液的制备为：取三金制剂大片20片或小片30片，精密称定，研细，取3g，精密称定，精密加入甲醇30ml，称定重量，超声处理45分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过；精密量取续滤液20ml回收溶剂至干，残渣加水20ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次15ml，合并正丁醇提取液，用5％氨试液洗涤1次，每次45ml，再用水洗涤1次，每次45ml，取正丁醇液，减压回收溶剂至干，残渣用甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

4.根据权利要求3所述的三金制剂的HPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，超声处理功率为250W，频率为40kHz。

5.一种三金制剂的质量检测方法，其特征在于，所述的质量检测方法包括如下步骤：

1)采用如权利要求1-4任意一项所述的构建方法得到待检测三金制剂的HPLC特征图谱，并使用积雪草苷为对照峰，计算各色谱峰的相对保留时间；

2)将步骤1)得到的相对保留时间与权利要求1-4任意一项所述的构建方法构建得到的三金制剂的HPLC特征图谱中特征峰相对保留时间比较；

3)根据步骤2)的比较结果判断所述待检测三金制剂的质量是否符合标准。

6.如权利要求1-4任意一项所述的构建方法构建得到的三金制剂的HPLC特征图谱在三金制剂的质量检测中的应用。

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