CN1958002B - 一种胆木注射液的质量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种胆木注射液的质量控制方法，以及胆木药材及中间体的质量控制方法。通过本发明获得的是中药不同个体的化学成分信息，用图形或图案方式表达，进行比对和分析，可实现对中药未知物质群整体的质量控制，是实现多种成分整体相关质量评价的关键技术。本发明可以准确反应该品种组分群体的特征图谱，能全面反映中药所含化学成分的种类与数量，进而反映中药材及其产品的质量。
Description
技术领域
本发明涉及一种中草药提取物制剂的质量控制方法，特别是一种胆木注射液的质量控制方法；本发明还涉及一种胆木药材的质量控制方法；本发明还涉及一种胆木中间的质量控制方法。
背景技术
胆木注射液为已有国家标准的上市药品，但其质量标准较为简单，只有一些薄层鉴别方法，不能真实的反映该品种的有效成分和组分的群体特征，难以有效的保证该品种的安全有效性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种胆木药材的质量控制方法。本发明还提供了一种胆木中间体的质量控制方法。本发明还提供了一种胆木注射液的质量控制方法。
本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种胆木注射液的质量控制方法，其特点是，该方法中含有以下含量测定方法，
a、色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；30∶70∶0.1的乙腈-水-磷酸为流动相；检测波长为226nm；理论塔板数按异长春花苷内酰胺计算应不低于5000；
b、对照品溶液的制备：取异长春花苷内酰胺适量，精密称定，加甲醇使溶解，并配制成含对照品100μg/ml和20μg/ml的溶液；
c、供试品溶液的制备：精密量取注射液1.0ml，置10ml量瓶中，以蒸馏水定容即得；
d、测定法：精密吸取两种浓度的对照品溶液和注射液供试品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，测定，计算含量。
本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来进一步实现。本发明是一种胆木注射液的质量控制方法，其特点是，结合高效液相色谱法与指纹图谱进行检测，步骤如下，
(1)建立胆木注射液的标准指纹图谱，
a、色谱条件与系统适用性试验：Agilent 1100系列HPLC色谱仪，含二元高压泵、自动进样系统、在线脱气、柱温箱、DAD检测器等单元；色谱柱：Lichrospher C18，5μm，4.6×250mm；流动相：A为0.1％磷酸溶液，B为0.1％磷酸乙腈溶液，从1％B开始以线性梯度方式经70min达到35％B，再经5min达到95％B，流速：1ml/min；柱温：30℃；检测波长：226nm；记录时间：72min；
理论板数按异长春花苷内酰胺峰C26H30N2O8计算，应不低于5000；
b、对照品溶液的制备：取异长春花苷内酰胺适量，精密称定，加甲醇溶解，制成每ml含1mg的对照品溶液；
c、供试品溶液的制备：精密量取胆木注射液1.0ml置10ml量瓶中，加蒸馏水至刻度，用0.45μm的水系微孔滤膜滤过，取续滤液即得；
d、测定法：精密吸取供试品溶液、对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，得胆木注射液标准指纹图谱或其对照提取物的标准指纹图谱；
(2)以上述相同的方法测定待测胆木注射液样品的指纹图谱，然后将其与上述胆木注射液标准指纹图谱或其对照提取物的标准指纹图谱比较，相似度不得低于0.85。
本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来进一步实现。以上所述的一种胆木注射液的质量控制方法，其特点是，在建立胆木注射液标准指纹图谱时，至少取10批胆木注射液，分别按所供试品溶液的制备方法制得供试溶液，所述的乙腈为色谱纯，磷酸为分析纯，水为超纯水，根据检测所得的至少10批胆木注射液的检测数据，建立胆木注射液HPLC标准图谱，主要确立峰保留时间和峰面积值，然后将检测数据导入计算机软件中，计算各对应峰相对保留时间的平均值和相对峰面积的平均值，分别与参照峰的平均保留时间和平均峰面积相乘，作为标准指纹图谱的峰保留时间和峰面积值，导出计算结果；胆木注射液HPLC的标准指纹图谱数据如下，
胆木注射液HPLC的标准指纹图谱数据
| 峰号 | 保留时间 | 相对保留时间 | 峰面积 | 相对峰面积 |
| 1 | 6.02 | 0.094160 | 711.81 | 0.14887 |
| 2 | 8.40 | 0.131379 | 74.51 | 0.01558 |
| 3 | 18.01 | 0.281788 | 377.30 | 0.07891 |
| 4 | 18.59 | 0.290987 | 1527.47 | 0.31946 |
| 5 | 20.63 | 0.322878 | 690.88 | 0.14449 |
| 6 | 21.93 | 0.343184 | 57.22 | 0.01197 |
| 7 | 24.02 | 0.375959 | 798.90 | 0.16709 |
| 8 | 24.43 | 0.382324 | 842.32 | 0.17617 |
| 9 | 26.08 | 0.408128 | 230.95 | 0.04830 |
| 10 | 27.28 | 0.426848 | 274.16 | 0.05734 |
| 11 | 28.22 | 0.441571 | 714.68 | 0.14947 |
| 12 | 30.27 | 0.473686 | 275.49 | 0.05762 |
| 13 | 30.78 | 0.481708 | 128.72 | 0.02692 |
| 14 | 32.05 | 0.501529 | 289.11 | 0.06047 |
| 15 | 32.70 | 0.511671 | 679.00 | 0.14201 |
| 16 | 34.91 | 0.546313 | 694.46 | 0.14524 |
| 17 | 35.61 | 0.557266 | 205.90 | 0.04306 |
| 18 | 36.56 | 0.572195 | 1424.03 | 0.29783 |
| 19 | 37.69 | 0.589866 | 184.48 | 0.03858 |
| 20 | 39.14 | 0.612489 | 296.64 | 0.06204 |
| 21 | 44.44 | 0.695499 | 1772.53 | 0.37072 |
| 22 | 45.59 | 0.713381 | 573.74 | 0.11999 |
| 23 | 47.59 | 0.744791 | 834.23 | 0.17448 |
| 24 | 57.18 | 0.894835 | 247.64 | 0.05179 |
| 25S | 63.90 | 1 | 4781.38 | 1 |
注：25S为参照峰。
本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来进一步实现。本发明是一种胆木药材的质量控制方法，其特点是，该方法中含有以下含量测定方法，
(1)色谱条件：色谱柱：Lichrospher C18，5μm，4.6mm×250mm；流动相：乙腈-水-磷酸(30∶70∶0.1)；速1ml/min；测定波长：226nm作为测定波长；柱温：30℃；
(2)药材供试品溶液的制备：取胆木药材粗粉0.5g，精密称定，加70％甲醇40ml回流提取70min，滤过，洗涤，洗液滤入同一量瓶中，放冷，定容至50ml；精密量取1ml置5ml量瓶中，加70％甲醇定容，以0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液即得；
(3)含量测定：按上述色谱条件，取药材供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，以外标2点法计算异长春花苷内酰胺的含量。
本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来进一步实现。本发明是一种胆木药材的质量控制方法，其特征在于，结合高效液相色谱法与指纹图谱进行检测，步骤如下
(1)建立胆木注射液的标准指纹图谱，
a、色谱条件与系统适用性试验：同权利要求2之色谱条件与系统适用性试验；
b、对照品溶液的制备：同权利要求2之对照品溶液的制备；
c、供试品溶液的制备：取胆木药材粗粉5g，加50ml水回流提取1hr，抽滤，置50ml量瓶中，放冷，加蒸馏水至刻度，以孔径为0.45μm的水系微孔滤膜过滤，取续滤液即得；
d、测定法：精密吸取供试品溶液、对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，得胆木药材标准指纹图谱或其对照提取物的标准指纹图谱；
(2)以上述相同的方法测定待测胆木药材样品的指纹图谱，然后将其与上述胆木药材标准指纹图谱或其对照提取物的标准指纹图谱比较，相似度不得低于0.85。
本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来进一步实现。以上所述的一种胆木药材的质量控制方法，其特征在于，在建立胆木药材标准指纹图谱时，取至少10批不同产地的胆木药材，分别按所述供试品溶液制备方法制备供试品，根据至少10批胆木药材的检测数据，建立胆木药材HPLC标准指纹图谱，主要是峰保留时间和峰面积值的确立，分别把胆木药材的检测数据导入计算软件中，计算各对应峰相对保留时间的平均值和相对峰面积的平均值，分别与参照峰的平均保留时间和平均峰面积相乘，作为标准指纹图谱的峰保留时间和峰面积值，导出计算结果；胆木药材的标准图谱数据如下，
胆木药材标准指纹图谱数据
| 保留时间 | 相对保留时间 | 峰面积 | 相对峰面积 | |
| 1 | 6.13 | 0.096139 | 46.43 | 0.002100 |
| 2 | 7.88 | 0.123585 | 95.00 | 0.004296 |
| 3 | 17.47 | 0.274031 | 130.60 | 0.005906 |
| 4 | 23.96 | 0.375846 | 127.95 | 0.005786 |
| 5 | 24.60 | 0.386009 | 135.12 | 0.006110 |
| 6 | 27.58 | 0.432703 | 234.95 | 0.010625 |
| 7 | 30.81 | 0.483367 | 1104.09 | 0.049927 |
| 8 | 32.97 | 0.517305 | 132.56 | 0.005994 |
| 9 | 34.85 | 0.546760 | 514.40 | 0.023261 |
| 10 | 36.55 | 0.573406 | 1326.13 | 0.059967 |
| 11 | 37.16 | 0.583056 | 238.73 | 0.010795 |
| 12 | 37.64 | 0.590547 | 290.28 | 0.013126 |
| 13 | 39.73 | 0.623346 | 512.10 | 0.023157 |
| 14 | 43.45 | 0.681613 | 2692.58 | 0.121757 |
| 15 | 44.36 | 0.695923 | 1704.35 | 0.077070 |
| 16 | 45.97 | 0.721205 | 928.26 | 0.041976 |
| 17 | 46.98 | 0.737007 | 1906.94 | 0.086231 |
| 18 | 47.66 | 0.747796 | 632.78 | 0.028614 |
| 19 | 52.87 | 0.829443 | 612.06 | 0.027677 |
| 20 | 55.74 | 0.874542 | 217.63 | 0.009841 |
| 21 | 58.13 | 0.912028 | 373.17 | 0.016874 |
| 22S | 63.74 | 1 | 22114.29 | 1 |
| 23 | 68.22 | 1.070248 | 497.28 | 0.022487 |
| 24 | 69.71 | 1.093605 | 483.49 | 0.021863 |
注：22S为参照峰。
本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来进一步实现。本发明是一种胆木中间体的质量控制方法，其特征在于，该方法中含有以下含量测定方法，
(1)色谱条件：色谱柱：Lichrospher C18，5μm，4.6mm×250mm；流动相：乙腈-水-磷酸30∶70∶0.1；流速1ml/min；测定波长：226nm作为测定波长；柱温：30℃；
(2)中间体供试品溶液的制备：直接以蒸馏水稀释中间体水溶液，精密量取1.0ml，置100ml量瓶中，以蒸馏水定容，以0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液即得；
(3)含量测定：按上述色谱条件，取中间体供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，以外标2点法计算异长春花苷内酰胺的含量。
本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来进一步实现。本发明是一种胆木中间体的质量控制方法，其特征在于，结合高效液相色谱法与指纹图谱进行检测，步骤如下，
(1)建立胆木中间体的标准指纹图谱，
a、色谱条件与系统适用性试验：同权利要求2之色谱条件与系统适用性试验；
b、对照品溶液的制备：同权利要求2之对照品溶液的制备；
c、供试品溶液的制备：精密量取胆木中间体1.0ml置25ml量瓶中，加蒸馏水至刻度，用0.45μm的水系微孔滤膜滤过，取续滤液即得；
d、测定法：精密吸取供试品溶液、对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，得胆木中间体标准指纹图谱或其对照提取物的标准指纹图谱；
(2)以上述相同的方法测定待测胆木中间体样品的指纹图谱，然后将其与上述胆木中间体
标准指纹图谱或其对照提取物的标准指纹图谱比较，相似度不得低于0.85。
本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来进一步实现。以上所述的一种胆木中间体的质量控制方法，其特征在于，在建立胆木中间体标准指纹图谱时，取至少10批胆木中间体，分别按所述供试品溶液制备方法制备供试品，根据10批胆木中间体的检测数据，建立胆木中间体HPLC指纹图谱标准，主要是峰保留时间和峰面积值的确立，分别把10批胆木中间体的检测数据导入计算软件中，计算各对应峰相对保留时间的平均值和相对峰面积的平均值，分别与参照峰的平均保留时间和平均峰面积相乘，作为标准指纹图谱的峰保留时间和峰面积值，导出计算结果；胆木中间体的标准图谱数据如下，
胆木中间体标准指纹图谱数据
| 峰号 | 保留时间 | 相对保留时间 | 峰面积 | 相对峰面积 |
| 1 | 5.98 | 0.093268 | 437.58 | 0.104884 |
| 2 | 8.23 | 0.128315 | 72.92 | 0.017478 |
| 3 | 17.76 | 0.276965 | 244.84 | 0.058686 |
| 4 | 18.59 | 0.289812 | 1157.85 | 0.277529 |
| 5 | 20.65 | 0.321930 | 451.42 | 0.108203 |
| 6 | 21.86 | 0.340882 | 94.52 | 0.022655 |
| 7 | 24.06 | 0.375117 | 555.82 | 0.133227 |
| 8 | 24.48 | 0.381703 | 560.73 | 0.134404 |
| 9 | 25.83 | 0.402805 | 127.12 | 0.030469 |
| 10 | 27.21 | 0.424314 | 76.09 | 0.018238 |
| 11 | 27.52 | 0.429178 | 37.74 | 0.009047 |
| 12 | 28.28 | 0.440902 | 509.60 | 0.122149 |
| 13 | 30.33 | 0.472912 | 187.98 | 0.045058 |
| 14 | 30.88 | 0.481444 | 169.05 | 0.040520 |
| 15 | 31.59 | 0.492658 | 61.33 | 0.014701 |
| 16 | 32.21 | 0.502215 | 138.09 | 0.033099 |
| 17 | 33.27 | 0.518762 | 80.83 | 0.019373 |
| 18 | 34.99 | 0.545631 | 507.56 | 0.121658 |
| 19 | 35.90 | 0.559801 | 93.68 | 0.022455 |
| 20 | 36.67 | 0.571755 | 1033.66 | 0.247760 |
| 21 | 37.94 | 0.591599 | 140.48 | 0.033672 |
| 22 | 39.30 | 0.612769 | 213.85 | 0.051257 |
| 23 | 44.58 | 0.695093 | 1230.80 | 0.295013 |
| 24 | 47.75 | 0.744611 | 552.55 | 0.132442 |
| 25 | 57.36 | 0.894503 | 207.74 | 0.049795 |
| 26S | 64.13 | 1 | 4172.00 | 1 |
| 27 | 70.06 | 1.092482 | 35.54 | 0.008520 |
注：26S为参照峰。
与现有技术相比，本发明公开了一种新的有效成分异长春花苷内酰胺的含量测定方法，提供该品种原药材、中间体及制剂的指纹图谱的测定方法，并提供该品种原药材、中间体及制剂标准指纹图谱的分析方法，通过本发明，获得的是中药不同个体的化学成分信息，用图形或图案方式表达，进行比对和分析，可实现对中药未知物质群整体的质量控制，是实现多种成分整体相关质量评价的关键技术，也是中药创新、研究开发、质量鉴别、鉴定的必要技术手段。本发明可以准确反应该品种组分群体的特征图谱，能全面反映中药所含化学成分的种类与数量，进而反映中药材及其产品的质量。
附图说明
图1 异长春花苷内酰胺标准曲线。图2 空白实验图谱。图3 Isovincoside lactone(Strictosamide)UV扫描图谱。图4 Isovincoside lactone(Strictosamide)Tof-MS图谱。图5 Isovincoside lactone(Strictosamide)HPLC图谱及归一化法所得纯度。图6～10 蒸馏水、吐温-80(辅料)水溶液与中间体和注射液的图谱比较(210、280、226、242、320nm)。图11 210nm和226nm图谱比较。图12 对照品与药材、中间体、制剂的图谱比较。图13 制剂稳定性试验叠加图谱。图14 胆木注射液精密度试验叠加图谱。图15 胆木注射液指纹图谱重复性试验HPLC叠加图谱。图16 系统梯度滞后时间图谱。图17 10批胆木注射液指纹图谱的对比图。图18 胆木注射液HPLC标准指纹图谱。图19 10批胆木药材的HPLC指纹图谱比较。图20 胆木药材标准指纹图谱。图21 10批胆木中间体的HPLC指纹图谱比较。图22 胆木中间体标准指纹图谱。图23 胆木药材、中间体和制剂的相关性图谱比较。
具体实施方式
实施例1。一种胆木注射液的质量控制方法，该方法中含有以下含量测定方法，
a、色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；30∶70∶0.1的乙腈-水-磷酸为流动相；检测波长为226nm；理论塔板数按异长春花苷内酰胺计算应不低于5000；
b、对照品溶液的制备：取异长春花苷内酰胺适量，精密称定，加甲醇使溶解，并配制成含对照品100μg/ml和20μg/ml的溶液；
c、供试品溶液的制备：精密量取注射液1.0ml，置10ml量瓶中，以蒸馏水定容即得；
d、测定法：精密吸取两种浓度的对照品溶液和注射液供试品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，测定，计算含量。
实施例2。一种胆木注射液的质量控制方法，结合高效液相色谱法与指纹图谱进行检测，步骤如下，
(1)建立胆木注射液的标准指纹图谱，
a、色谱条件与系统适用性试验：Agilent 1100系列HPLC色谱仪，含二元高压泵、自动进样系统、在线脱气、柱温箱、DAD检测器等单元；色谱柱：Lichrospher C18，5μm，4.6×250mm；流动相：A为0.1％磷酸溶液，B为0.1％磷酸乙腈溶液，从1％B开始以线性梯度方式经70min达到35％B，再经5min达到95％B，流速：1ml/min；柱温：30℃；检测波长：226nm；记录时间：72min；
理论板数按异长春花苷内酰胺峰C26H30N2O8计算，应不低于5000；
b、对照品溶液的制备：取异长春花苷内酰胺适量，精密称定，加甲醇溶解，制成每ml含1mg的对照品溶液；
c、供试品溶液的制备：精密量取胆木注射液1.0ml置10ml量瓶中，加蒸馏水至刻度，用0.45μm的水系微孔滤膜滤过，取续滤液即得；
d、测定法：精密吸取供试品溶液、对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，得胆木注射液标准指纹图谱或其对照提取物的标准指纹图谱；
(2)以上述相同的方法测定待测胆木注射液样品的指纹图谱，然后将其与上述胆木注射液标准指纹图谱或其对照提取物的标准指纹图谱比较，相似度不得低于0.85。
实施例3。实施例2的胆木注射液的质量控制方法，在建立胆木注射液标准指纹图谱时，至少取10批胆木注射液，分别按所供试品溶液的制备方法制得供试溶液，所述的乙腈为色谱纯，磷酸为分析纯，水为超纯水，根据检测所得的至少10批胆木注射液的检测数据，建立胆木注射液HPLC标准图谱，主要确立峰保留时间和峰面积值，然后将检测数据导入Excel中，计算各对应峰相对保留时间的平均值和相对峰面积的平均值，分别与参照峰的平均保留时间和平均峰面积相乘，作为标准指纹图谱的峰保留时间和峰面积值，导出计算结果；胆木注射液HPLC的标准指纹图谱数据见表19。
实施例4。一种胆木药材的质量控制方法，该方法中含有以下含量测定方法，
(1)色谱条件：色谱柱：Lichrospher C18，5μm，4.6mm×250mm；流动相：乙腈-水-磷酸(30∶70∶0.1)；速1ml/min；测定波长：226nm作为测定波长；柱温：30℃；
(2)药材供试品溶液的制备：取胆木药材粗粉0.5g，精密称定，加70％甲醇40ml回流提取70min，滤过，洗涤，洗液滤入同一量瓶中，放冷，定容至50ml；精密量取1ml置5ml量瓶中，加70％甲醇定容，以0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液即得；
(3)含量测定：按上述色谱条件，取药材供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，以外标2点法计算异长春花苷内酰胺的含量。
实施例5。一种胆木药材的质量控制方法，结合高效液相色谱法与指纹图谱进行检测，步骤如下，(1)建立胆木注射液的标准指纹图谱，
a、色谱条件与系统适用性试验：同实施例2之色谱条件与系统适用性试验；
b、对照品溶液的制备：同施例2之对照品溶液的制备；
c、供试品溶液的制备：取胆木药材粗粉5g，加50ml水回流提取1hr，抽滤，置50ml量瓶中，放冷，加蒸馏水至刻度，以孔径为0.45μm的水系微孔滤膜过滤，取续滤液即得；
d、测定法：精密吸取供试品溶液、对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，得胆木药材标准指纹图谱或其对照提取物的标准指纹图谱；
(2)以上述相同的方法测定待测胆木药材样品的指纹图谱，然后将其与上述胆木药材标准指纹图谱或其对照提取物的标准指纹图谱比较，相似度不得低于0.85。
实施例6。实施例5中的胆木药材的质量控制方法，在建立胆木药材标准指纹图谱时，取至少10批不同产地的胆木药材，分别按所述供试品溶液制备方法制备供试品，根据至少10批胆木药材的检测数据，建立胆木药材HPLC标准指纹图谱，主要是峰保留时间和峰面积值的确立，分别把胆木药材的检测数据导入《中药指纹图谱相似度计算软件》中，计算各对应峰相对保留时间的平均值和相对峰面积的平均值，分别与参照峰的平均保留时间和平均峰面积相乘，作为标准指纹图谱的峰保留时间和峰面积值，导出计算结果；胆木药材的标准图谱数据见表23。
实施例7。一种胆木中间体的质量控制方法，该方法中含有以下含量测定方法，
(1)色谱条件：色谱柱：Lichrospher C18，5μm，4.6mm×250mm；流动相：乙腈-水-磷酸30∶70∶0.1；流速1ml/min；测定波长：226nm作为测定波长；柱温：30℃；
(2)中间体供试品溶液的制备：直接以蒸馏水稀释中间体水溶液，精密量取1.0ml，置100ml量瓶中，以蒸馏水定容，以0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液即得；
(3)含量测定：按上述色谱条件，取中间体供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，以外标2点法计算异长春花苷内酰胺的含量。
实施例8。一种胆木中间体的质量控制方法，结合高效液相色谱法与指纹图谱进行检测，步骤如下，
(1)建立胆木中间体的标准指纹图谱，
a、色谱条件与系统适用性试验：同施例2之色谱条件与系统适用性试验；
b、对照品溶液的制备：同施例2之对照品溶液的制备；
c、供试品溶液的制备：精密量取胆木中间体1.0ml置25ml量瓶中，加蒸馏水至刻度，用0.45μm的水系微孔滤膜滤过，取续滤液即得；
d、测定法：精密吸取供试品溶液、对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，得胆木中间体标准指纹图谱或其对照提取物的标准指纹图谱；
(2)以上述相同的方法测定待测胆木中间体样品的指纹图谱，然后将其与上述胆木中间体标准指纹图谱或其对照提取物的标准指纹图谱比较，相似度不得低于0.85。
实施例9。实施例8所述的胆木中间体的质量控制方法，在建立胆木中间体标准指纹图谱时，取至少10批胆木中间体，分别按所述供试品溶液制备方法制备供试品，根据10批胆木中间体的检测数据，建立胆木中间体HPLC指纹图谱标准，主要是峰保留时间和峰面积值的确立，分别把10批胆木中间体的检测数据导入《中药指纹图谱相似度计算软件》中，计算各对应峰相对保留时间的平均值和相对峰面积的平均值，分别与参照峰的平均保留时间和平均峰面积相乘，作为标准指纹图谱的峰保留时间和峰面积值，导出计算结果；胆木中间体的标准图谱数据见表27。
实施例10。胆木注射液质量标准。
【名称】胆木注射液；【汉语拼音】Danmu Zhusheye
【处方】胆木提取物溶液适量(含生物碱以异长春花苷内酰胺计不少于0.2g)聚山梨酯-802ml，制成1000ml
【制法】取胆木提取物溶液适量，加聚山梨酯-802ml和活性炭2g，搅匀，加热煮沸10分钟，过滤脱炭，滤液加氢氧化钠溶液调pH值至7.5～8.0，加注射用水至规定量，搅匀，过滤，灌封，灭菌，即得。
【性状】本品为棕黄色澄明液体。
【鉴别】取本品2ml，加水8ml与浓氨试液0.25ml，摇匀，用氯仿振摇提取3次，每次10ml，合并氯仿液，蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取胆木对照药材6g，加水煎煮30min，滤过，滤液浓缩至20ml，加浓氨试液0.5ml，摇匀，用氯仿振摇提取3次，每次20ml，合并氯仿液，蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为对照药材溶液。照薄层色谱法(中国2000年版一部附录VI B)实验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-醋酸乙酯(8∶1∶3)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
【检查】pH值应为5.0～7.0(中国2000年版一部附录VII G)。
其他应符合注射剂及注射剂有关物质检查法项下有关的各项规定(中国2000年版一部附录I U及IX S)
【含量测定】照高效液相色谱法(中国药典2000版一部附录VI D)测定。
色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-水-磷酸(30∶70∶0.1)为流动相；检测波长为226nm。理论塔板数按异长春花苷内酰胺计算应不低于5000。
对照品溶液的制备取异长春花苷内酰胺适量，精密称定，加甲醇使溶解，并配制成含对照品100μg/ml和20μg/ml的溶液。
供试品溶液的制备 精密量取本品1.0ml，置10ml量瓶中，以蒸馏水定容即得。
测定法精密吸取两种浓度的对照品溶液和制剂供试品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，测定，计算含量。本品1ml含异长春花苷内酰胺(C26H30N2O8)不得少于0.2mg。
【功能与主治】清热解毒。用于急性扁桃体炎，急性咽喉炎，急性结膜炎及上呼吸道感染。【用法与用量】肌注，一次2ml，一日2次。【规格】每支装2ml。【贮藏】密闭，避光。
实施例11。胆木注射液的质量控制方法。
1、鉴别。同原标准。2、检查。同原标准。
3、含量测定。胆木注射液具有清热解毒的作用，有效成分为生物碱及其苷类，异长春花苷内酰胺(isovinciside lactone，C26H30N2O8)是胆木注射液中所含的一种生物碱苷，含量较高，且具有抗癌活性，故选择其作为含量测定的指标成分。
3.1、仪器和试剂。Agilent高效液相色谱仪，含四元泵，柱温箱，VWD检测器；MettlerAE 240电子天平(十万分之一)。乙腈为色谱纯，水是高纯水，其他试剂为分析纯。
3.2、对照品来源及纯度。异长春花苷内酰胺，自制，纯度：98.56％。
3.3、色谱条件。色谱柱：Lichrospher C18(5μm，4.6mm×250mm)，江苏淮阴汉邦科技公司。流动相：经比较不同体系流动相的色谱行为，结果表明，以乙腈-水-磷酸(30∶70∶0.1)分离效果为佳。流速1ml/min。测定波长：根据对照品的紫外扫描光谱图选择226nm作为测定波长。柱温：30℃。在上述条件下，异长春花苷内酰胺和样品中其它组分色谱峰可达到基线分离，异长春花苷内酰胺与其它相邻组分色谱峰的分离度大于1.5。按异长春花苷内酰胺峰计算，理论板数应不低于5000。
3.4、供试品溶液的制备。因注射液本身为水溶液，故可直接以蒸馏水稀释。精密量取本品1.0ml，置10ml量瓶中，以蒸馏水定容，以0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液即得。
3.5、线性关系考察。精密称取异长春花苷内酰胺约10mg加甲醇制成每1ml含异长春花苷内酰胺0.9960mg的溶液，摇匀，即得标准储备液。量取标准储备液2.0，4.0，6.0，8.0，10.0ml置10ml量瓶内，分别加流动相制成浓度为19.92、39.84、59.76、79.68、99.60μg/ml的系列标准液。吸取上述溶液各10μl进样，测定，以峰面积为横坐标，对照品进样量(μg)为纵坐标绘制标准曲线，计算回归方程。结果表明异长春花苷内酰胺在19.92～99.6μg/ml(0.1992μg～0.996μg)范围内呈良好的线性关系(见表1、图1)。
表1 线性关系考察
3.6、空白实验。原制剂配方中去掉胆木提取物，按制剂工艺进行制备，得空白样品，依含量测定法处理样品并进行分析，空白样品色谱在与异长春花苷内酰胺相应保留时间上没有干扰峰(见图2)。
3.7、精密度实验。取供试品溶液，连续进样5次，测定异长春花苷内酰胺峰面积值，结果表明仪器精密度良好(见表2)。
表2精密度实验结果
3.8、稳定性实验。同一份供试品溶液，分别在0、1、2、4、8、14、26hr测定异长春花苷内酰胺峰面积值，结果表明供试品在26hr内稳定性良好(见表3)。
表3稳定性实验结果
3.9、重复性实验。取同一批胆木注射液(批号为20030910)，照3.4项“供试品制备方法”平行制备6份供试品溶液，分别测定其中异长春花苷内酰胺的峰面积值，结果表明，拟订测定方法重复性良好(见表4)。
表4 重复性实验结果
3.10、加样回收实验。取已知异长春花苷内酰胺含量的同一批胆木注射液(批号为20030910)，按照3.4项“供试品制备方法”制备供试品溶液，精密加入一定量的异长春花苷内酰胺，以3.3项“色谱条件”进行测定，用外标2点法计算异长春花苷内酰胺的含量和加样回收率，结果表明本法具有良好的回收率(见表5)。
表5 样品同收率实验结果
注*：
3.11、样品测定和含量限度。按上述方法测定10批胆木注射液，用外标2点法计算样品含量(见表6)。
根据上述试验结果，考虑到胆木的原料来源、贮藏、制剂生产过程等因素，应积累多批样品数据后最终制订限度，暂定本品每ml含异长春花苷内酰胺(C26H30N2O8)不得低于0.2mg(即每支含量不低于0.4mg)。
表6 胆木注射液中异长春花苷内酰胺含量测定结果
实施例12。胆木药材的含量测定。
1、药材。胆木，本品为茜草科植物乌檀Nauclea officinalis Pierre.ex Pitard的干燥茎干及根。本品应符合《中国药典》1977年版一部第424页胆木项下有关要求。
2、含量测定
2.1、药材供试品的制备方法考察
2.1.1、提取溶剂的考察。拟用回流法考察胆木药材的提取溶剂，实验方法：平行精密称取胆木药材粗粉5份，每份1.0g，分别用水、30％、50％、70％、100％甲醇40ml回流提取0.5hr，滤过，用少量溶剂洗涤容器和药渣3次，洗液滤入同一量瓶中，放冷，定容至50ml。按胆木注射液的质量控制方法(标准)中含量测定方法测定其含量(见表7)。
表7 不同溶剂提取的比较(回流法)
结果表明70％的甲醇提取效果较好。
2.1.2提、取方法的考察
平行精密称取胆木药材粗粉2份，每份1.0g，分别用70％甲醇40ml超声和回流0.5hr，滤过，洗涤，洗液滤入同一量瓶中，放冷，定容至50ml，进样测定其含量(见表8)。表8不同提取方法的比较(70％甲醇)
结果表明回流法的提取效果比超声法好。
2.1.3、提取时间的考察
精密称取胆木药材粗粉0.5g 3份，分别用70％甲醇40ml回流30、50、70min，过滤，洗涤，洗涤液滤入同一量瓶中，放冷，定容至50ml，进样测定其含量(见表9)。
表9 提取时间的比较
结果表明随提取时间延长，提取率稍有增加，但增加的趋势平缓，因此确定提取时间为 70min。
2.2、药材供试品溶液的制备取胆木药材粗粉0.5g，精密称定，加70％甲醇40ml回流提取70min，滤过，洗涤，洗液滤入同一量瓶中，放冷，定容至50ml；精密量取1ml置5ml量瓶中，加70％甲醇定容，以0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液即得。
2.3、含量测定按“注射液质量标准”中3.3项色谱条件，取药材供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，以外标2点法计算异长春花苷内酰胺的含量(见表10)。
表10 药材含量测定结果
根据上述试验结果，考虑到胆木的原料来源和贮藏等因素，应积累多批样品数据后最终制订限度，故暂定本品中异长春花苷内酰胺(C26H30N2O8)的含量不低于0.8％。
实施例13。胆木中间体的质量标准。
1、鉴别。同注射液的“鉴别”。2、含量测定。
2.1、中间体供试品的制备
因中间体本身即水溶液，故可直接以蒸馏水稀释。精密量取本品1.0ml，置100ml量瓶中，以蒸馏水定容，以0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液即得。
2.2、含量测定。按“注射液质量标准”中3.3项色谱条件，取中间体供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，以外标2点法计算异长春花苷内酰胺的含量(见表11)。表11胆木中间体中异长春花苷内酰胺的含量测定
注*：批号同注射液
根据上述试验结果，暂定中间体中异长春花苷内酰胺(C26H30N2O8)的含量不低于0.4mg/ml(内控指标)。
实施例14。异长春花苷内酰胺的有关研究。
由于含量测定用的对照品在药典中未收载，因此我们对其结构进行了理化鉴定。
【中文名】异长春花苷内酰胺。【英文名】Isovincoside lactone；Strictosamide
【结构式】
【分子式及分子量】C26H30N2O8；498.20
【制备方法】取胆木中间体用氨水调pH至9，氯仿萃取，弃去氯仿层，将水液调中性，水浴除去氯仿，经聚酰胺柱层析，先以水洗脱，弃去水洗脱液，再以30％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩蒸干，硅胶拌样，通过硅胶柱层析分离，以氯仿-甲醇梯度洗脱，TLC跟踪检测。将氯仿-甲醇90：10洗脱部分以氯仿-甲醇重结晶，得到对照品针状结晶。
【理化特性】本品为淡黄色针状结晶，熔点196～198℃。本品在甲醇中易溶，能溶于氯仿，在水中微溶。碘化铋钾反应阴性，遇三氯化铁-铁氰化钾试剂显蓝色。
【结构确证】
UVλmax MeOHnm：202，226.5，282sh，290sh。
并参照图3。
1HNMR(DMSO-D6，TMS，AV-500)δppm：显示有30个氢的峰，归属见表12，图11。
13CNMR(DMSO-D6，TMS，AV-500)δppm：显示有26个碳的峰，归属见表12，图12。
表12 13CNMR、1HNMR数据
Tof-MS m/z：499.2080(M+H+)，分子式为C26H30N2O8。
并参照图4。
以上UV、1HNMR、13CNMR、MS数据与文献记载基本一致，证实了该化合物的结构与Isovincoside lactone(Strictosamide)相同。
HPLC：色谱柱：Lichrospher C18(5μm，4.6mm×250mm)，江苏淮阴汉邦科技公司。
流动相：O.1％磷酸-30％乙腈-70％水。流速：1ml/min。
测定波长：226nm。柱温：30℃。理论板数：按对照品峰计算，应不低于5000。
并参照图5。
实施例15。胆木注射液指纹图谱标准。
参照高效液相色谱法(中华人民共和国2000年版一部附录VI D)，结合指纹图谱的要求检测。
【色谱条件与系统适用性试验】Agilent 1100系列HPLC色谱仪，含二元高压泵、自动进样系统、在线脱气、柱温箱、DAD检测器等单元。
色谱柱：Lichrospher C18，5μm，4.6×250mm；流动相：A为0.1％磷酸溶液，B为O.1％磷酸乙腈溶液，从1％B开始以线性梯度方式经70min达到35％B，再经5min达到95％B，流速：1ml/min；柱温：30℃；检测波长：226nm；记录时间：72min。
理论板数按异长春花苷内酰胺峰(C26H30N2O8)计算，应不低于5000。
【对照品溶液的制备】取异长春花苷内酰胺适量，精密称定，加甲醇溶解，制成每ml含1mg的对照品溶液。
【供试品溶液的制备】精密量取胆木注射液1.0ml置10ml量瓶中，加蒸馏水至刻度，用0.45μm的水系微孔滤膜滤过，取续滤液即得。
【测定法】精密吸取供试品溶液、对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，所得供试品指纹图谱与胆木注射液标准指纹图谱或其对照提取物的指纹图谱比较，相似度不得低于0.85。
实施例16。胆木药材指纹图谱标准。
参照高效液相色谱法(中华人民共和国2000年版一部附录VI D)，结合指纹图谱的要求检测。
【色谱条件与系统适用性试验】同实施例15。【对照品溶液的制备】同实施例15。
【供试品溶液的制备】取胆木药材粗粉5g，加50ml水回流提取1hr，抽滤，置50ml量瓶中，放冷，加蒸馏水至刻度，以孔径为0.45μm的水系微孔滤膜过滤，取续滤液即得。
【测定法】精密吸取供试品溶液、对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，所得供试品指纹图谱与胆木药材标准指纹图谱或其对照提取物的指纹图谱比较，相似度不得低于0.85。
实施例17。胆木中间体指纹图谱标准。
参照高效液相色谱法(中华人民共和国2000年版一部附录VI D)，结合指纹图谱的要求检测。
【色谱条件与系统适用性试验】同实施例15。【对照品溶液的制备】同实施例15。
【供试品溶液的制备】精密量取胆木中间体1.0ml置25ml量瓶中，加蒸馏水至刻度，用0.45μm的水系微孔滤膜滤过，取续滤液即得。
【测定法】精密吸取供试品溶液、对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，所得供试品指纹图谱与胆木中间体标准指纹图谱或其对照提取物的指纹图谱比较，相似度不得低于0.85。
实施例18。胆木注射液的标准指纹图谱的建立。
1、名称、汉语拼音：名称：胆木注射液；汉语拼音：Danmu Zhusheye。
2、供试品来源：由海南制药厂提供。
3、供试品溶液的制备：因制剂本身为水溶液，可以直接以蒸馏水稀释。精密量取胆木注射液1.0ml置10ml量瓶中，加蒸馏水至刻度，用0.45μm的水系微孔滤膜滤过，取续滤液即得。
4、对照品溶液的制备：取异长春花苷内酰胺适量，精密称定，加甲醇溶解，制成每ml含1mg的对照品溶液。
5、检测方法及验证
5.1、仪器、试剂、色谱条件：Agilent 1100系列HPLC色谱仪，含二元高压泵、自动进样系统、在线脱气、柱温箱、DAD检测器等单元。
乙腈为色谱纯，磷酸为分析纯，水为超纯水。
色谱柱：Linchrospher C18，5μm，4.6×250mm；流动相：A为0.1％磷酸溶液，B为0.1％磷酸乙腈溶液，从1％B开始以线性梯度方式经70min达到35％B，再经5min达到95％B；流速：1ml/min；柱温：30℃；检测波长：226nm；记录时间：72min。
异长春花苷内酰胺：自制，其结构鉴定和纯度检查详见实施例5。
5.2、方法验证
5.2.1、专属性试验。按照“5.1、仪器、试剂、色谱条件”项下方法，进样蒸馏水、吐温 -80(辅料)水溶液、对照品溶液与中间体和注射液的供试品比较，结果见图6～12，其中图6～10为210、280、226、242、320nm 5个检测波长的图谱比较。在5个波长下蒸馏水和吐温-80(辅料)水溶液在各时刻都没有干扰，证明本方法专属性较强。280、、320nm的图谱峰面积小，242nm出峰较少，210nm和226nm较好。但226nm是对照品的最大吸收波长，而且在此波长下出峰较多，峰面积适中，且210nm的图谱基线不太平，所以选择226nm作为指纹图谱的检测波长(见图11)。
5.2.2、供试品稳定性实验。取批号为20030910的胆木注射液，按“3、供试品溶液的制备”项下方法制备供试品溶液，分别于0、1.5、3、6、9、12、18、24、36hr考察稳定性(见图13、表13)，结果表明供试品溶液在36小时内稳定。
表13制剂稳定性试验结果
*：与“表19胆木注射液HPLC指纹图谱的标准图谱数据”中峰号一致，25S为参照峰
5.2.3、仪器精密度试验。取“5.2.2、供试品稳定性试验”项下的供试品溶液，连续进样5针(见图14、表14)，检测结果表明仪器精密度符合要求。
表14 胆木注射液精密度试验结果
*：与“表19胆木注射液HPLC指纹图谱的标准图谱数据”中峰号一致，S为参照峰
5.2.4、方法重复性试验。取批号为20030910的胆木注射液，按“3、供试品溶液的制备”项下方法平行制备5份供试品溶液，分别进行检测(见图15、表15)，结果表明本试验方法的重复性符合要求。
表15 胆木注射液重复性试验结果
注*：与“表19胆木注射液HPLC指纹图谱的标准图谱数据”中峰号一致，S为参照峰5.2.5、系统适应性试验。不同的仪器，由于梯度曲线质量和滞后时间的不同，可能影响方法的重现性及选择性，通常可通过调整进样和梯度起始时间减少这种影响，必要时可调整梯度程序。所以我们测定了系统梯度滞后时间，检测结果为1min，见图16。
6、指纹图谱及技术参数
6.1、10批胆木注射液样品的测定。10批胆木注射液，分别按“3、供试品溶液的制备”项下方法制备供试溶液，按照“5.1、仪器、试剂、色谱条件”项下方法检测，结果见图17和表16、17。胆木注射液的标准图谱为10批胆木注射液指纹图谱的共有模式(模板，详见“6.3、胆木注射液指纹图谱标准的建立”)。
6.2、计算方法
6.2.1、峰匹配，将数据导入Excel表中，手工进行峰匹配。
6.2.2、模板确定。有两种方法，第一种是选其中一组有代表性的谱峰数据作为模板，第二种是取所有对应峰的峰面积平均值作为模板，一般建议采用第二种方法。本文采用第二种方法(详见“6.3、胆木注射液指纹图谱标准的建立”)。
6.2.3、相似度计算。有两种方法：夹角余弦法、相关系数法，其中相关系数法灵敏度较高。本文同时采用这两种方法，结果详见表18。根据结果确定以相关系数法计算相对峰面积比值的相似度，十批注射液的相似度大于0.85。
6.3、胆木注射液指纹图谱标准的建立
根据10批胆木注射液的检测数据，建立胆木注射液HPLC标准指纹图谱，主要是峰保留时间和峰面积值的确立。分别把10批胆木注射液的检测数据导入Excel中，计算各对应峰相对保留时间的平均值和相对峰面积的平均值，分别与参照峰的平均保留时间和平均峰面积相乘，作为标准指纹图谱的峰保留时间和峰面积值，导出计算结果。胆木注射液的标准图谱数据见图18和表19。
表19胆木注射液HPLC的标准指纹图谱数据
| 峰号 | 保留时间 | 相对保留时间 | 峰面积 | 相对峰面积 |
| 1 | 6.02 | 0.094160 | 711.81 | 0.14887 |
| 2 | 8.40 | 0.131379 | 74.51 | 0.01558 |
| 3 | 18.01 | 0.281788 | 377.30 | 0.07891 |
| 4 | 18.59 | 0.290987 | 1527.47 | 0.31946 |
| 5 | 20.63 | 0.322878 | 690.88 | 0.14449 |
| 6 | 21.93 | 0.343184 | 57.22 | 0.01197 |
| 7 | 24.02 | 0.375959 | 798.90 | 0.16709 |
| 8 | 24.43 | 0.382324 | 842.32 | 0.17617 |
| 9 | 26.08 | 0.408128 | 230.95 | 0.04830 |
| 10 | 27.28 | 0.426848 | 274.16 | 0.05734 |
| 11 | 28.22 | 0.441571 | 714.68 | 0.14947 |
| 12 | 30.27 | 0.473686 | 275.49 | 0.05762 |
| 13 | 30.78 | 0.481708 | 128.72 | 0.02692 |
| 14 | 32.05 | 0.501529 | 289.11 | 0.06047 |
| 15 | 32.70 | 0.511671 | 679.00 | 0.14201 |
| 16 | 34.91 | 0.546313 | 694.46 | 0.14524 |
| 17 | 35.61 | 0.557266 | 205.90 | 0.04306 |
| 18 | 36.56 | 0.572195 | 1424.03 | 0.29783 |
| 19 | 37.69 | 0.589866 | 184.48 | 0.03858 |
| 20 | 39.14 | 0.612489 | 296.64 | 0.06204 |
| 21 | 44.44 | 0.695499 | 1772.53 | 0.37072 |
| 22 | 45.59 | 0.713381 | 573.74 | 0.11999 |
| 23 | 47.59 | 0.744791 | 834.23 | 0.17448 |
| 24 | 57.18 | 0.894835 | 247.64 | 0.05179 |
| 25S | 63.90 | 1 | 4781.38 | 1 |
注：25S为参照峰
7、结果与讨论
7.1、10批胆木注射液的相似度均超过0.85，说明胆木注射液的生产工艺较稳定。
7.2、在指纹图谱相似度计算中使用的是相对峰面积比值，相似性代表的是图谱中对应峰比例的一致性，基本不受整体浓度的影响，因此评价药材、中间体和制剂的质量是否合格，还应该参考质量标准中的含量测定项。
7.3、在指纹图谱的检测中，为避免实验室条件不同对检测结果产生的影响，可采用对照提取物作为标准指纹图谱，本品对照提取物可用以上十批注射液等量勾兑而成。
实施例19。药材的指纹图谱标准的建立。
1、名称、汉语拼音，名称：胆木汉语拼音：Danmu。
2、来源。本品为茜草科植物乌檀Nauclea officinalis Pierre.ex Pitard的干燥茎干和根，全年均可采收，砍成块片，晒干。由海南制药厂提供，产地：白沙黎族自治县：白沙镇，五指山市：番阳镇、南圣镇，保亭黎族苗族自治县：毛感镇、什岭镇、响水镇，琼中黎族苗族自治县：红毛镇、乌石镇、长征镇、和平镇。
3、供试品溶液的制备，因胆木制剂的提取方法为水提，且制剂为注射液水针，所以选择水提的方法制备药材供试品更能体现制剂的质量。取胆木药材粗粉5g，加50ml水回流提取1hr，抽滤，置50ml量瓶中，放冷，加蒸馏水至刻度，以孔径为0.45μm的水系微孔滤膜过滤，取续滤液即得。
4、对照品溶液的制备。取异长春花苷内酰胺适量，精密称定，加甲醇溶解，制成每ml含1mg的对照品溶液。
5、检测方法及验证。因胆木注射液为单味药材提取制成的制剂，所以药材、中间体和制剂选用的检测方法均与注射液的指纹图谱相同。方法验证等详见注射液的指纹图谱。
6、指纹图谱及技术参数
6.1、10批胆木药材样品的测定。取不同产地的胆木药材10批，按注射液指纹图谱中供试品溶液制备分别制备供试品，按注射液指纹图谱中“5.1、仪器、试剂、色谱条件”进行HPLC检测，结果见图19和表20、21。
6.2、计算方法。同“注射液指纹图谱”。结果见表22。
表22 10批胆木药材指纹图谱相似度计算结果
根据结果确定以相关系数法计算相对峰面积比值的相似度，十批药材的相似度大于0.85。
6.3、胆木药材指纹图谱标准的建立
根据10批胆木药材的检测数据，建立胆木药材HPLC标准指纹图谱，主要是峰保留时间和峰面积值的确立。分别把10批胆木药材的检测数据导入《中药指纹图谱相似度计算软件》中，计算各对应峰相对保留时间的平均值和相对峰面积的平均值，分别与参照峰的平均保留时间和平均峰面积相乘，作为标准指纹图谱的峰保留时间和峰面积值，导出计算结果。胆木药材的标准图谱数据见图20和表23。本品的对照提取物可用以上十批药材等量均匀混合提取，以减少或避免实验室条件不同对检测结果产生的影响。
表23 胆木药材标准指纹图谱数据
| 保留时间 | 相对保留时间 | 峰面积 | 相对峰面积 | |
| 1 | 6.13 | 0.096139 | 46.43 | 0.002100 |
| 2 | 7.88 | 0.123585 | 95.00 | 0.004296 |
| 3 | 17.47 | 0.274031 | 130.60 | 0.005906 |
| 4 | 23.96 | 0.375846 | 127.95 | 0.005786 |
| 5 | 24.60 | 0.386009 | 135.12 | 0.006110 |
| 6 | 27.58 | 0.432703 | 234.95 | 0.010625 |
| 7 | 30.81 | 0.483367 | 1104.09 | 0.049927 |
| 8 | 32.97 | 0.517305 | 132.56 | 0.005994 |
| 9 | 34.85 | 0.546760 | 514.40 | 0.023261 |
| 10 | 36.55 | 0.573406 | 1326.13 | 0.059967 |
| 11 | 37.16 | 0.583056 | 238.73 | 0.010795 |
| 12 | 37.64 | 0.590547 | 290.28 | 0.013126 |
| 13 | 39.73 | 0.623346 | 512.10 | 0.023157 |
| 14 | 43.45 | 0.681613 | 2692.58 | 0.121757 |
| 15 | 44.36 | 0.695923 | 1704.35 | 0.077070 |
| 16 | 45.97 | 0.721205 | 928.26 | 0.041976 |
| 17 | 46.98 | 0.737007 | 1906.94 | 0.086231 |
| 18 | 47.66 | 0.747796 | 632.78 | 0.028614 |
| 19 | 52.87 | 0.829443 | 612.06 | 0.027677 |
| 20 | 55.74 | 0.874542 | 217.63 | 0.009841 |
| 21 | 58.13 | 0.912028 | 373.17 | 0.016874 |
| 22S | 63.74 | 1 | 22114.29 | 1 |
| 23 | 68.22 | 1.070248 | 497.28 | 0.022487 |
| 24 | 69.71 | 1.093605 | 483.49 | 0.021863 |
注：22S为参照峰
实施例20。中间体的指纹图谱的建立。
1、名称、汉语拼音：名称：胆木注射液中间体；汉语拼音：Danmu Zhusheye Zhongjianti
2、来源。由海南制药厂提供。
3、供试品溶液的制备。因中间体本身即水溶液，可以用蒸馏水稀释后直接进样。精密量取胆木中间体1.0ml置25ml量瓶中，加蒸馏水至刻度，用0.45μm的水系微孔滤膜滤过，取续滤 液即得。
4、对照品溶液的制备。取异长春花苷内酰胺适量，精密称定，加甲醇溶解，制成每ml含1mg的对照品溶液。
5、检测方法及验证。因胆木注射液为单味药材提取制成的制剂，所以选用的检测方法均与“注射液的指纹图谱”项相同。方法验证等详见“注射液的指纹图谱”。
6、指纹图谱及技术参数
6.1、10批胆木中间体样品的测定。取10批胆木中间体，按“注射液指纹图谱”中“3、供试品溶液制备”项分别制备供试品，按“注射液指纹图谱”中按“5、仪器、时间、色谱条件”进行HPLC检测，结果见图21和表24。6.2、计算方法。同“注射液指纹图谱”。结果见
表26。根据结果确定以相关系数法计算相对峰面积比值的相似度，十批中间体的相似度大于0.85。
6.3、胆木中间体指纹图谱标准的建立。根据10批胆木中间体的检测数据，建立胆木中间体HPLC指纹图谱标准，主要是峰保留时间和峰面积值的确立。分别把10批胆木中间体的检测数据导入《中药指纹图谱相似度计算软件》中，计算各对应峰相对保留时间的平均值和相对峰面积的平均值，分别与参照峰的平均保留时间和平均峰面积相乘，作为标准指纹图谱的峰保留时间和峰面积值，导出计算结果。胆木中间体的标准图谱数据见图22和表25。本品的对照提取物可用以上十批中间体等量勾兑，以减少或避免实验室条件不同对检测结果产生的影响。
表27 胆木中间体标准指纹图谱数据
| 峰号 | 保留时间 | 相对保留时间 | 峰面积 | 相对峰面积 |
| 1 | 5.98 | 0.093268 | 437.58 | 0.104884 |
| 2 | 8.23 | 0.128315 | 72.92 | 0.017478 |
| 3 | 17.76 | 0.276965 | 244.84 | 0.058686 |
| 4 | 18.59 | 0.289812 | 1157.85 | 0.277529 |
| 5 | 20.65 | 0.321930 | 451.42 | 0.108203 |
| 6 | 21.86 | 0.340882 | 94.52 | 0.022655 |
| 7 | 24.06 | 0.375117 | 555.82 | 0.133227 |
| 8 | 24.48 | 0.381703 | 560.73 | 0.134404 |
| 9 | 25.83 | 0.402805 | 127.12 | 0.030469 |
| 10 | 27.21 | 0.424314 | 76.09 | 0.018238 |
| 11 | 27.52 | 0.429178 | 37.74 | 0.009047 |
| 12 | 28.28 | 0.440902 | 509.60 | 0.122149 |
| 13 | 30.33 | 0.472912 | 187.98 | 0.045058 |
| 14 | 30.88 | 0.481444 | 169.05 | 0.040520 |
| 15 | 31.59 | 0.492658 | 61.33 | 0.014701 |
| 16 | 32.21 | 0.502215 | 138.09 | 0.033099 |
| 17 | 33.27 | 0.518762 | 80.83 | 0.019373 |
| 18 | 34.99 | 0.545631 | 507.56 | 0.121658 |
| 19 | 35.90 | 0.559801 | 93.68 | 0.022455 |
| 20 | 36.67 | 0.571755 | 1033.66 | 0.247760 |
| 21 | 37.94 | 0.591599 | 140.48 | 0.033672 |
| 22 | 39.30 | 0.612769 | 213.85 | 0.051257 |
| 23 | 44.58 | 0.695093 | 1230.80 | 0.295013 |
| 24 | 47.75 | 0.744611 | 552.55 | 0.132442 |
| 25 | 57.36 | 0.894503 | 207.74 | 0.049795 |
| 26S | 64.13 | 1 | 4172.00 | 1 |
| 27 | 70.06 | 1.092482 | 35.54 | 0.008520 |
注：26S为参照峰
实施例21。药材、中间体和制剂指纹图谱之间的相关性。
胆木药材按注射液制备工艺制备样品和供试液，按注射液HPLC指纹图谱方法操作，与中间体和注射液的指纹图谱进行比较，计算相似度，见图23和表28，结果表明注射液和中间体的指纹图谱中特征峰和主要色谱峰可以在药材的指纹图谱中追溯，且三者的指纹图谱具有相似性；但药材和制剂、中间体的图谱还存在着一些差别，经过我们的初步考察，发现在胆木注射液的制备工艺中，“加熟石膏搅拌、干燥”一步对此影响较大，因此生产中应该注意这一步的操作。
表28 胆木药材、中间体和制剂相似度
Claims (2)
1.一种胆木注射液的质量检测方法，其特征在于：
(1)建立胆木注射液的标准指纹图谱，
a、色谱条件与系统适用性试验：Agilent 1100系列HPLC色谱仪，含二元高压泵、自动进样系统、在线脱气、柱温箱、DAD检测器单元；色谱柱：Lichrospher C18，5μm，4.6×250mm；流动相：A为0.1％磷酸溶液，B为0.1％磷酸乙腈溶液，从1％B开始以线性梯度方式经70min达到35％B，再经5min达到95％B，流速：1ml/min；柱温：30℃；检测波长：226nm；记录时间：72min；
理论板数按异长春花苷内酰胺峰C26H30N2O8计算，应不低于5000；
b、对照品溶液的制备：取异长春花苷内酰胺适量，精密称定，加甲醇溶解，制成每ml含1mg的对照品溶液；
c、供试品溶液的制备：精密量取胆木注射液1.0ml置10ml量瓶中，加蒸馏水至刻度，用0.45μm的水系微孔滤膜滤过，取续滤液即得；
d、测定法：精密吸取供试品溶液、对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，得胆木注射液标准指纹图谱或其对照提取物的标准指纹图谱；
(2)以上述相同的方法测定待测胆木注射液样品的指纹图谱，然后将其与上述胆木注射液标准指纹图谱或其对照提取物的标准指纹图谱比较，相似度不得低于0.85。
2.根据权利要求1所述的一种胆木注射液的质量检测方法，其特征在于，在建立胆木注射液标准指纹图谱时，至少取10批胆木注射液，分别按所述供试品溶液的制备方法制得供试溶液，所述的乙腈为色谱纯，磷酸为分析纯，水为超纯水，根据检测所得的至少10批胆木注射液的检测数据，建立胆木注射液HPLC标准图谱，主要确立峰保留时间和峰面积值，然后将检测数据导入计算软件中，计算各对应峰相对保留时间的平均值和相对峰面积的平均值，分别与参照峰的平均保留时间和平均峰面积相乘，作为标准指纹图谱的峰保留时间和峰面积值，导出计算结果；胆木注射液HPLC的标准指纹图谱数据如下，
胆木注射液HPLC的标准指纹图谱数据
注：25S为参照峰。
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