CN101008632A - 五味子水煎液的hplc标准指纹图谱及其建立方法 - Google Patents

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CN101008632A CN 200610002306 CN200610002306A CN101008632A CN 101008632 A CN101008632 A CN 101008632A CN 200610002306 CN200610002306 CN 200610002306 CN 200610002306 A CN200610002306 A CN 200610002306A CN 101008632 A CN101008632 A CN 101008632A
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李廷利
都晓伟
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Abstract

本发明公开了五味子水煎液的HPLC标准指纹图谱的建立方法及由该方法建立的指纹图谱，属于中药领域。该方法包括以下步骤：1)取五味子水煎液粉末，加入甲醇超声提取，过滤，滤液用甲醇定容，溶液过微孔滤膜，得标准品溶液；2)取五味子醇甲适量，用流动相稀释，制成对照品溶液；3)分别精密吸取标准品溶液和对照品溶液，分别注入高效液相色谱柱，以对照品色谱峰的保留时间和峰面积积分值为1，计算标准品相对保留时间和相对峰面积，制定得到标准指纹图谱。本发明方法稳定性强、重现性好、精密度高，所建立的标准指纹图谱可用于五味子水煎液所含成分的定性及定量分析；本发明也为五味子水煎液给药后血清中成分的分析奠定了基础。

Description

五味子水煎液的HPLC标准指纹图谱及其建立方法
技术领域
本发明涉及一种中药材的指纹图谱，尤其涉及五味子水煎液的HPLC标准指纹图谱及其建立方法，属于中药领域。
背景技术
五味子(Schisandra chinensis(Turcz)Baill)作为传统药物，具有药理功效，广泛应用于临床。数千年来，在中医临床用于治疗睡眠障碍取得了较好的疗效。药效学研究表明，五味子水煎液能延长戊巴比妥钠所致小鼠睡眠时间，并且能延长自由活动大鼠睡眠时相中的SWS2。说明五味子具有显著改善睡眠作用。但在体内究竟以何种成分以何种形式发挥作用，至今未见明确的研究报道，针对其水煎液的研究更少。
中药指纹图谱是指中药材或中成药中所共有的、具有特征性的活性成分的色谱或光谱图谱，可作为中草药及其提取物的定性和定量分析标准。迄今为止，尚未有关于五味子水煎物的HPLC标准指纹图谱的报道，而建立五味子水煎物的HPLC标准指纹图谱，对于五味子水煎物的质量控制，乃至对进一步从体内研究其药效物质基础都具有重要的意义。
发明内容
本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种五味子水煎液的HPLC标准指纹图谱的建立方法。
本发明首先所要解决的技术问题是通过以下技术途径来实现的：
一种五味子水煎液的HPLC标准指纹图谱的建立方法，包括：
1)、标准品溶液的制备：取五味子水煎液粉末，加入甲醇超声提取，过滤，滤液用甲醇定容，溶液过微孔滤膜，得标准品溶液；
2)、对照品溶液的制备：取五味子醇甲适量，用流动相稀释，制成对照品溶液；
3)、标准指纹图谱的测定：分别精密吸取标准品溶液和对照品溶液，分别注入高效液相色谱柱，以对照品色谱峰的保留时间和峰面积积分值为1，计算标准品相对保留时间和相对峰面积，制定得到标准指纹图谱。
上述方法中，其中，步骤1)中标准品溶液制备方法优选为：取0.1g五味子水煎液粉末，用甲醇超声提取，各2次，每次15分钟，过滤，滤液再用甲醇定容至10ml，溶液过0.45μm微孔滤膜。
步骤3)中优选为分别精密吸取10ul标准品溶液和对照品溶液，分别注入高效液相色谱柱；步骤3)中采用高效液相色谱法分析时，高效液相色谱条件如下：色谱柱采用中科院大连物化所生产的Kromasil C18保护柱为大连衣利特公司C18保护柱；流动相为甲醇与水的混合物；检测波长为254nm。
优选的，由本发明方法所建立的五味子水煎液HPLC标准指纹图谱为说明书附图图1或图2所示，该标准指纹图谱中确立了18个共有峰，其中包括参照物五味子醇甲的色谱峰。
通过本发明方法所建立的五味子水煎液的HPLC指纹图谱，共确立了18个共有峰，18个共有峰的峰面积较大，五味子中所含成分能够被较全面的检出，18个共有峰的存在能够客观的反映五味子水煎液的内在质量，方法学考察结果表明：本发明方法重现性好，各共有峰相对峰面积的RSD小于3％，相对保留时间的RSD小于1％；精密度实验中各共有峰面积的RSD小于3％，相对保留时间的RSD小于1％，样品在24小时内稳定性良好。总之，本发明方法所建立的标准指纹图谱可用于五味子水煎液所含成分的定性及定量分析，也为五味子水煎液给药后血清中成分的分析奠定了基础。
附图说明
图1五味子水煎液提取物HPLC指纹图谱。
图2五味子水煎液十批提取物HPLC指纹图谱。
具体实施方式
以下通过实施例来进一步描述本发明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的范围。
实施例五味子水煎液的HPLC标准指纹图谱的建立
1.实验仪器及材料
Waters高效液相色谱仪2996。
甲醇：HPLC级美国迪马(DIKMA)试剂公司。
水：娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)。
其余试剂为分析纯。
五味子药材由黑龙江省神树林场提供。
2.实验方法及结果
2.1色谱条件
流动相：甲醇-水梯度洗脱(洗脱程序见表1)。
柱温30℃。
流速1ml/min。
检测波长200-400nm扫描。
表1流动相梯度变化程序表
时间(min)   流速(ml/min)   甲醇(％)     水(％)
Initial   1.00   5     95
15   1.00   56     44
50   1.00   59     41
55   1.00   65     35
65   1.00   67     33
100   1.00   85     15
2.2色谱条件的选择与结果
2.2.1色谱柱的选择与结果
经预实验发现，中药HPLC指纹图谱建立时，不同的色谱柱对试验结果的影响较大。本实验使用同一高效液相色谱仪，考察了中科院大连物化所Kromasil C18色谱柱(4.6×200mm，5μm)和中科院大连物化所Nucleosil C18色谱柱(4.6×200mm，5μm)的分离效果，按拟定的色谱条件使用两种色谱柱对同一样品进行分析，结果以Kromasil C18色谱柱分离的峰数较多，峰形较好，基线平整，故本实验选用中科院大连物化所Kromasil C18色谱柱，保护柱为大连衣利特公司C18保护柱。
2.2.2检测波长的选择及结果
本实验采用二极管阵列检测器，在分析时进行紫外全波长扫描，并在不同波长下获取数据，经比较在254nm下色谱峰的积分面积较大，分离度高，故检测波长定为254nm。
2.3供试品溶液制备的方法及结果
五味子水煎液的制备：取五味子原药材30g，粉碎，加适量水浸泡2h，煮沸30min，过滤，将滤渣再加适量水煎煮20min，合并2次滤液，水浴蒸干(70℃)，碾成细粉，得干膏13g。1g干膏粉相当于原药材2.31g。
取0.1g五味子水煎液粉末2份，分别用水、甲醇超声提取，各2次，每次15分钟，过滤，滤液再分别用水、甲醇定容至10ml，溶液过0.45μm微孔滤膜，分别进行HPLC分析。结果表明甲醇处理的样品溶解效果较好，色谱峰数目较多。
2.4参照物的选择
保留时间为32.05min的色谱峰是HPLC图谱中峰面积较大且出峰时间稳定的一个峰，与其他成分分离度很高，经与对照品核对，认定为五味子醇甲的吸收峰，所以选择五味子醇甲作为参照物。
2.5方法学考察
2.5.1精密度实验
按HPLC样品制备方法制备供试品溶液，连续进样5次，测得共有峰18个，相对保留时间、相对峰面积结果见表2和3，各共有峰相对峰面积的RSD小于3％，相对保留时间的RSD小于1％，
表2精密度实验(相对保留时间)结果
峰号  实验次数 平均值 RSD％
 1   2   3   4   5
1  0.2385   0.2375   0.2373   0.2393   0.2382 0.2382 0.33
2  0.2987   0.2979   0.2981   0.2999   0.2990 0.2987 0.27
3(s)  1   1   1   1   1 1 0
4  1.1668   1.1669   1.1617   1.1626   1.1640 1.1644 0.21
5  1.2671   1.2674   1.2618   1.2627   1.2638 1.2646 0.20
6  1.3856   1.3877   1.3805   1.3827   1.3830 1.3839 0.20
7  1.4510   1.4536   1.4490   1.4483   1.4465 1.4497 0.19
8  1.5306   1.5342   1.5268   1.5267   1.5253 1.5287 0.24
9  1.925   1.9285   1.9265   1.9322   1.9332 1.9291 0.18
10  1.9618   1.9663   1.9642   1.9692   1.9699 1.9663 0.17
11  1.9928   1.9971   1.9954   2.0005   2.0022 1.9976 0.19
12  2.2664   2.2684   2.2663   2.2742   2.2776 2.2706 0.22
13  2.3664   2.3707   2.3737   2.3793   2.3808 2.3742 0.25
14  2.5011   2.5028   2.5059   2.5149   2.5181 2.5086 0.30
15  2.5755   2.5782   2.5835   2.5909   2.5937 2.5843 0.30
16  2.6386   2.6406   2.6474   2.6548   2.6591 2.6481 0.33
17  2.6875   2.6895   2.6965   2.7042   2.7085 2.6972 0.34
18  2.8813   2.8828   2.8919   2.9002   2.9051 2.8922 0.36
表3精密度实验(相对峰面积)结果
峰号     实验次数 平均值 RSD％
    1     2     3     4     5
    1     0.3199     0.3226     0.3193     0.3134     0.3123     0.3175     1.40
    2     0.0173     0.0172     0.0169     0.0166     0.0163     0.0169     2.46
    3(s)     1     1     1     1     1     1     0
    4     0.0284     0.0281     0.0287     0.0278     0.0281     0.0282     1.21
    5     0.0743     0.0760     0.0726     0.0746     0.0733     0.0742     1.75
    6     0.2168     0.2213     0.2212     0.2135     0.2166     0.2179     1.53
    7     0.1882     0.1825     0.1778     0.1765     0.1768     0.1803     2.78
    8     0.0430     0.0449     0.0428     0.0417     0.0436     0.0432     2.71
    9     0.0358     0.0355     0.0377     0.0374     0.0360     0.0365     2.74
    10     0.0184     0.0192     0.0183     0.0191     0.0181     0.0186     2.67
    11     0.0376     0.0386     0.0381     0.0382     0.0378     0.0381     1.01
    12     0.0413     0.0427     0.0418     0.0404     0.0401     0.0413     2.55
    13     0.1335     0.1425     0.1360     0.1338     0.1369     0.1365     2.66
    14     0.0846     0.0811     0.0816     0.0791     0.0824     0.0818     2.45
    15     0.0382     0.0394     0.0385     0.0382     0.0394     0.0387     1.59
    16     0.1097     0.1160     0.1175     0.1174     0.1137     0.1146     2.80
    17     0.5201     0.5234     0.5267     0.5174     0.5179     0.5211     0.75
    18     0.0943     0.0948     0.0940     0.0949     0.0943     0.0945     0.40
2.5.2稳定性实验
按样品制备方法制备供试品溶液，在0，6，12，18，24小时进样分析，测定HPLC色谱图，结果见表4和5，各共有峰相对峰面积的RSD小于3％，相对保留时间小于1％，表明样品在24小时稳定。
表4稳定性实验(相对保留时间)结果
峰号     实验次数 平均值 RSD％
1 2 3 4 5
   1     0.2384   0.2381   0.2438   0.2385   0.2373   0.2392   1.09
   2     0.2992   0.2984   0.3029   0.2987   0.2982   0.2995   0.65
   3     1   1   1   1   1   1   0
   4     1.1659   1.1656   1.1620   1.1668   1.1617   1.1644   0.20
   5     1.2641   1.2679   1.2600   1.2672   1.2618   1.2642   0.27
   6     1.3833   1.3867   1.3774   1.3856   1.3805   1.3827   0.27
   7     1.4464   1.4501   1.4434   1.4511   1.4491   1.4480   0.22
   8     1.5270   1.5303   1.5225   1.5306   1.5269   1.5275   0.21
   9     1.9253   1.9309   1.9246   1.9250   1.9266   1.9265   0.13
   10     1.9622   1.9673   1.9620   1.9618   1.9643   1.9635   0.12
   11     1.9944   2.0003   1.9915   1.9928   1.9954   1.9949   0.17
   12     2.2688   2.2773   2.2639   2.2664   2.2663   2.2685   0.23
   13     2.3704   2.3728   2.3703   2.3665   2.3738   2.3708   0.12
   14     2.5055   2.5101   2.5034   2.5011   2.5060   2.5052   0.13
   15     2.5812   2.5828   2.5818   2.5755   2.5835   2.5810   0.12
   16     2.6454   2.6474   2.6462   2.6387   2.6474   2.6450   0.14
   17     2.6945   2.6969   2.6957   2.6875   2.6966   2.6942   0.14
   18     2.8891   2.8924   2.8910   2.8813   2.8919   2.8891   0.16
表5稳定性实验(相对峰面积)结果
峰号     实验次数 平均值 RSD％
1   2   3   4   5
    1     0.2965   0.2976   0.2982   0.3077   0.3030   0.3006   1.56
    2     0.0159   0.0168   0.0157   0.0160   0.0160   0.0161   2.61
    3     1   1   1   1   1   1   0
    4     0.0279   0.0291   0.0282   0.0282   0.0272   0.0281   2.43
    5     0.0720   0.0733   0.0699   0.0715   0.0689   0.0711   2.44
    6     0.2135   0.2133   0.2111   0.2085   0.2099   0.2113   1.02
    7     0.1771   0.1756   0.1665   0.1699   0.1688   0.1716   2.65
    8     0.0421   0.0434   0.0411   0.0424   0.0417   0.0421   2.02
    9     0.0349   0.0339   0.0348   0.0344   0.0358   0.0348   2.02
    10     0.0199   0.0200   0.0195   0.0198   0.0197   0.0198   0.97
    11     0.0366   0.0385   0.0379   0.0381   0.0362   0.0375   2.67
    12     0.0409   0.0403   0.0400   0.0397   0.0397   0.0401   1.25
    13     0.1398   0.1430   0.1442   0.1401   0.1397   0.1414   1.48
    14     0.0826   0.0829   0.0835   0.0814   0.0830   0.0827   0.94
    15     0.0403   0.0408   0.0396   0.0402   0.0397   0.0401   1.21
    16     0.1136   0.1134   0.1161   0.1169   0.1115   0.1143   1.91
    17     0.5214   0.5227   0.5141   0.5003   0.4999   0.5117   2.16
    18     0.0941   0.0923   0.0913   0.0907   0.0893   0.0915   1.96
2.5.3重现性实验
取同一批五味子水煎液粉末，按样品制备方法制备供试品溶液5分，测定HPLC色谱图，结果见表6和7，各共有峰相对峰面积的RSD小于3％，相对保留时间小于1％，表明方法重现性良好。
表6重现性实验(相对保留时间)结果
峰号     实验次数 平均值 RSD％
    1   2   3   4   5
    1     0.2383   0.2382   0.2390   0.2414   0.2385     0.2391     0.56
    2     0.2992   0.2988   0.2994   0.3009   0.2987     0.2994     0.30
    3     1   1   1   1   1     1     0
    4     1.1645   1.1665   1.1637   1.1684   1.1668     1.1660     0.16
    5     1.2650   1.2661   1.2660   1.2682   1.2672     1.2665     0.10
    6     1.3830   1.3853   1.3854   1.3880   1.3856     1.3855     0.13
    7     1.4458   1.4488   1.4495   1.4502   1.4511     1.4491     0.14
    8     1.5249   1.5262   1.5286   1.5298   1.5306     1.5280     0.16
    9     1.9269   1.9263   1.9293   1.9220   1.9250     1.9259     0.14
    10     1.9655   1.9631   1.9692   1.9605   1.9618     1.9640     0.17
    11     1.9968   1.9949   1.9995   1.9914   1.9928     1.9951     0.16
    12     2.2699   2.2703   2.2735   2.2658   2.2664     2.2692     0.14
    13     2.3747   2.3695   2.3747   2.3621   2.3665     2.3695     0.23
    14     2.5109   2.5057   2.5108   2.4994   2.5011     2.5056     0.21
    15     2.5875   2.5802   2.5870   2.5710   2.5755     2.5802     0.28
    16     2.6515   2.6450   2.6505   2.6355   2.6387     2.6442     0.27
    17     2.7004   2.6944   2.6998   2.6845   2.6875     2.6933     0.27
    18     2.8951   2.8889   2.8940   2.8782   2.8813     2.8875     0.26
表7重现性实验(相对峰面积)结果
峰号     实验次数 平均值 RSD％
    1  2  3  4  5
    1     0.3059  0.3201  0.3227  0.3139  0.3154   0.3156   2.05
    2     0.0162  0.0166  0.0168  0.0162  0.0165   0.0165   1.58
    3     1  1  1  1  1   1   0
    4     0.0236  0.0250  0.0242  0.0249  0.0235   0.0242   2.90
    5     0.0729  0.0728  0.0735  0.0734  0.0729   0.0731   0.45
    6     0.2078  0.2037  0.2007  0.2017  0.2066   0.2041   1.50
    7     0.1719  0.1739  0.1784  0.1746  0.1689   0.1735   2.02
    8     0.0460  0.0453  0.0459  0.0451  0.0462   0.0457   1.04
    9     0.0357  0.0351  0.0354  0.0353  0.0347   0.0352   1.06
    10     0.0187  0.0191  0.0195  0.0197  0.0186   0.0191   2.52
    11     0.0372  0.0374  0.0373  0.0368  0.0368   0.0371   0.76
    12     0.0413  0.0412  0.0412  0.0416  0.0410   0.0413   0.53
    13     0.1365  0.1366  0.1378  0.1361  0.1377   0.1369   0.56
    14     0.0825  0.0835  0.0848  0.0836  0.0807   0.0830   1.85
    15     0.0403  0.0403  0.0415  0.0409  0.0396   0.0405   1.77
    16     0.1063  0.1117  0.1061  0.1084  0.1046   0.1074   2.56
    17     0.4977  0.4950  0.5026  0.5149  0.4957   0.5012   1.64
    18     0.0963  0.0964  0.0967  0.0962  0.0941   0.0959   1.09
2.6指纹图谱的测定及结果
2.6.1指纹图谱的测定
制备五味子水煎液供试品10批，液相色谱仪自动进样10ul进行分析，记录100分钟的色谱图，见图1。以五味子醇甲色谱峰的保留时间和峰面积积分值为1，计算相对保留时间和相对峰面积，结果见表8和9，各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均在3％以内。
2.6.2指纹图谱相似度计算
选取色谱图中的18个强峰，由色谱工作站辅助自动进行峰匹配，确定共有指纹峰18个，其中包括作为参照物的五味子醇甲峰，以18个共有峰峰面积的均值作为模板，利用“相关系数”法和“夹角余弦”法计算指纹图谱的相似度，结果见表9，两种方法计算的相似度结果均在0.99以上。
表8五味子水煎液指纹图谱共有指纹峰相对保留时间
峰号   样品 平均值 RSD(％)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
   1   0.2381   0.2371   0.2372   0.2393   0.2382   0.2385   0.2382   0.2374   0.2379   0.2397 0.2382   0.36
   2   0.2986   0.2979   0.2982   0.2999   0.2989   0.2988   0.2991   0.2980   0 2979   0.2999 0.2987   0.25
   3   1   1   1   1   1   1   1   1   1   1 1   0
   4   1.1667   1.1668   1.1616   1.1626   1.1641   1.1669   1.1639   1.1618   1.1670   1.1626 11644   0.19
   5   1.2672   1.2674   1.2617   1.2627   1.2637   1.2670   1.2639   1.2619   1.2674   1.2627 1.2646   0.19
   6   1.3857   1.3878   1.3804   1.3827   1.3830   1.3855   1.3830   1.3806   1.3877   1.3827 1.3839   0.19
   7   1.4511   1.4535   1.4489   1.4483   1.4463   1.4509   1.4467   1.4491   1.4536   1.4483 1.4497   0.18
   8   1.5308   1.5343   1.5269   1.5267   1.5252   1.5304   1.5254   1.5267   1.5341   1.5267 1.5287   0.22
   9   1.9249   1.9284   1.9264   1.9322   1.9331   1.9251   1.9333   1.9266   1.9286   1.9322 1.9291   0.17
   10   1.9617   1.9664   1.9643   1.9692   1.9699   1.9619   1.9699   1.9641   1.9662   1.9692 1.9663   0.16
   11   1.9929   1.9970   1.9955   2.0005   2.0022   1.9927   2.0022   1.9953   1.9972   2.0005 1.9976   0.18
   12   2.2663   2.2687   2.2662   2.2742   2.2774   2.2665   2.2776   2.2664   2.2681   2.2742 2.2706   0.21
   13   2.3667   2.706   2.3736   2.37793   2.3809   2.3661   2.3807   2.3738   2.3708   2.3793 2.3742   0.24
   14   2.5010   2.5027   2.5060   2.5150   2.5180   2.5012   2.5182   2.5059   2.5029   2.5148 2.5086   0.28
   15   2.5753   2.5783   2.5834   2.5909   2 5936   2.5757   2.5938   2.5836   2.5781   2.5909 2.5844   0.29
   16   2.6385   2.6405   2.6476   2.6547   2.6590   2.6387   2.6592   2.6472   2.6407   2.6549 2.6481   0.32
   17   2.6872   2.6898   2.6965   2.7041   2.7084   2.6878   2.7085   2.6966   2.6892   2.7043 2.6972   0.32
   18   2.8812   2.8827   2.8920   2.9003   2.9050   2.8814   2.9052   2.8919   2.8829   2.9001 2.8923   0.34
表9五味子水煎液指纹图谱共有指纹峰相对峰面积
峰号 样品 平均值 RSD(％)
 1 2  3  4  5  6  7  8  9  10
    1  0.3059 0.3201  0.3227  0.3139  0.3154  0.3059  0.3201  0.3227  0.3139  0.3154 0.3156 1.93
    2  0.0162 0.0166  0.0168  0.0162  0.0165  0.0162  0.0166  0.0168  0.0162  0.0165 0.0165 1.49
    3  1 1  1  1  1  1  1  1  1  1 1 0
    4  0.0246 0.0251  0.0242  0.0249  0.0245  0.0246  0.0251  0.0242  0.0249  0.0245 0.0245 1.35
    5  0.0729 0.0728  0.0737  0.0734  0.0729  0.0729  0.0728  0.0737  0.0734  0.0729 0.0731 0.5
    6  0.2078 0.2037  0.2007  0.2017  0.2066  0.2078  0.2037  0.2007  0.2017  0.2066 0.2041 1.41
    7  0.1719 0.1739  0 1783  0.1746  0.1689  0.1719  0.1739  0.1783  0.1746  0.1689 0.1735 1.88
    8  0.0460 0.0453  0.0459  0.0451  0.0462  0.0460  0.0453  0.0459  0.0451  0.0462 0.0457 0.98
    9  0.0357 0.0351  0.0354  0.0353  0.0347  0.0357  0.0351  0.0354  0.0353  0.0347 0.0352 0.99
    10  0.0187 0.0191  0.0195  0.0197  0.0186  0.0187  0.0191  0.0195  0.0197  0.0186 0.0191 2.38
    11  0.0372 0.0373  0.0374  0.0368  0.0368  0.0372  0.0373  0.0374  0.0368  0.0368 0.0371 0.72
    12  0.0413 0.0412  0.0412  0.0416  0.0410  0.0413  0.0412  0.0412  0.0416  0.0410 0.0413 0.5
    13  0.1365 0.1366  0.1378  0.1361  0.1377  0.1365  0.1366  0.1378  0.1361  0.1377 0.1369 0.53
    14  0.0825 0.0835  0.0848  0.0836  0.0807  0.0825  0.0835  0.0848  0.0836  0.0807 0.0830 1.74
    15  0.0403 0.0403  0.0415  0.0409  0.0396  0.0403  0.0403  0.0415  0.0409  0.0396 0.0405 1.67
    16  0.1063 0.1117  0.1061  0.1084  0.1046  0.1063  0.1117  0.1061  0.1084  0.1046 0.1074 2.41
    17  0.4977 0.4950  0.5026  0.5149  0.4957  0.4977  0.4950  0.5026  0.5149  0.4957 0.5012 1.55
    18  0.0963 0.0964  0.0967  0.0962  0.0941  0.0963  0.0964  0.0967  0.0962  0.0941 0.0959 1.03
    相关系数  0.9994 0.9995  0.9997  0.9989  0.9997  0.9997  0.9987  0.9967  0.9967  0.9987 1
    夹角余弦  0.9993 0.9996  0.9955  0.9998  0.997  0.9996  0.9997  0.9996  0.9996  0.9996 1
3实验小结
3.1本实验建立了五味子水煎液的HPLC指纹图谱，确立了18个共有峰，其中包括参照物五味子醇甲的色谱峰，方法学考察结果表明：该实验方法重现性好，各共有峰相对峰面积的RSD小于3％，相对保留时间的RSD小于1％；精密度实验中各共有峰面积的RSD小于3％，相对保留时间的RSD小于1％，样品在24小时内稳定性良好。
3.2以五味子醇甲色谱峰的保留时间和峰面积积分值为1，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3％。表明五味子醇甲的18个共有色谱峰在10批样品中稳定，重现性好，说明18个共有峰的存在与否能够客观的反映五味子水煎液的内在质量，可作为五味子水煎液的定性指标。
3.3以18个共有峰峰面积的均值作为模板，利用相关系数法和夹角余弦法计算指纹图谱的相似度，结果十批样品指纹图谱的相似度均在0.99以上。表明，五味子水煎液的提取制备方法稳定，能够保证所制五味子水煎液的质量均匀可靠，为下一步实验提供合格的药品。通过指纹图谱相似度的计算，也为五味子水煎液的质量控制提供了一个宏观的定量指标。
3.4在所确定的HPLC条件下，五味子水煎液的HPLC色谱图中吸收峰的数量较多，峰面积较大，五味子中所含成分能够被较全面的检出，表明该检测方法有效，可用于五味子水煎液所含成分的定性及定量分析，而且也为五味子水煎液给药后血清中成分的分析奠定了基础。

Claims (7)

1.一种五味子水煎液的HPLC标准指纹图谱的建立方法，包括：
1)、标准品溶液的制备：取五味子水煎液粉末，加入甲醇超声提取，过滤，滤液用甲醇定容，溶液过微孔滤膜，得标准品溶液；
2)、对照品溶液的制备：取五味子醇甲适量，用流动相稀释，制成对照品溶液；
3)、标准指纹图谱的测定：分别精密吸取标准品溶液和对照品溶液，分别注入高效液相色谱柱，以对照品色谱峰的保留时间和峰面积积分值为1，计算标准品相对保留时间和相对峰面积，制定得到标准指纹图谱。
2.按照权利要求1的建立方法，其特征是步骤1)中标准品溶液制备方法为：取0.1g五味子水煎液粉末，用甲醇超声提取2次，每次15分钟，过滤，滤液再用甲醇定容至10ml，溶液过0.45μm微孔滤膜，备用。
3.按照权利要求1的建立方法，其特征是步骤3)中分别精密吸取10ul标准品溶液和对照品溶液，分别注入高效液相色谱柱。
4.按照权利要求1的建立方法，其特征是步骤3)中采用高效液相色谱法分析时，高效液相色谱条件如下：色谱柱采用中科院大连物化所生产的Kromasil C18；保护柱为大连衣利特公司C18保护柱；流动相为甲醇与水的混合物；检测波长为254nm。
5.一种五味子水煎液的的HPLC标准指纹图谱，其特征是由权利要求1-4任意一项建立方法所得到的指纹图谱。
6.按照权利要求5的标准指纹图谱，其特征是所述的标准指纹图谱的共有峰为18个。
7.按照权利要求5的标准指纹图谱，其特征是所述的标准指纹图谱为说明书附图中图1或图2所示。
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