CN109490437B - 白芍的指纹图谱检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了白芍的指纹图谱检测方法，该方法包括以下步骤：步骤1、白芍供试品溶液的制备；步骤2、混合对照品溶液的制备：步骤3、分别精密吸取供试品溶液和混合对照品溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图；步骤4，将步骤3中获得的白芍指纹图谱仪器导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，选择不同批次白芍的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成白芍的对照指纹图谱；计算各共有峰的相对保留时间、相对峰面积。本发明所提供的白芍指纹图谱检测方法，稳定性好、精密度高、重现性好，能全面，客观地表征白芍的质量。

Description

白芍的指纹图谱检测方法

技术领域

本发明属于中药检测技术领域，具体地说，涉及一种白芍的指纹图谱检测方法。

背景技术

白芍(Paeonia lactiflora Pall.)养血敛阴，柔肝止痛，平肝阳。平肝止痛，养血调经，敛阴止汗。用于头痛眩晕、胁痛、腹痛、四肢挛痛、血虚萎黄、月经不调、自汗、盗汗。白芍根含芍药甙、牡丹酚、芍药花甙，苯甲酸、挥发油、脂肪油、树脂、鞣质、糖、淀粉、粘液质、蛋白质、β-谷甾醇和三萜类。另四川产者含一种酸性物质，对金黄色葡萄球菌有抑制作用。花含黄芪甙、山柰酚3，7-二葡萄糖甙，多量没食子鞣质、除虫菊素、13-基十四烷酸、β-谷甾醇、廿五碳烷等。目前白芍仅仅是对单个或少数几个有效成分的含量测定，未能客观、真实反映白芍的质量。

因此，很有必要在现有技术的基础上，建立白芍高效液相色谱指纹特征图谱，并通过中药色谱特征图谱相似度评价系统对其进行分析，建立对照指纹图谱，从而为区别其它品种，为白芍的质量控制提供依据，具有重要的意义。

发明内容

发明目的：本发明的目的是克服现有技术的不足，研发一种白芍的指纹图谱检测方法，通过本发明的方法可以客观、全面、准确的评价白芍的质量，对控制白芍的质量和保证临床疗效具有重要意义。

技术方案：为实现以上目的，本发明采用的技术方案为：

一种白芍的指纹图谱检测方法，包括以下步骤：

(1)供试品溶液制备

精密称定白芍饮片粉末，置具塞锥形瓶中，加入体积浓度50～80％乙醇，提取30～60min，取出，取续滤液，用0.22μm微孔滤膜滤过，即得白芍饮片供试品溶液；

(2)混合对照品溶液的制备

精密称取芍药苷、1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖、没食子甲酯、没食子酸、苯甲酰芍药苷、苯甲酸、氧化芍药苷、芍药苷和芍药内酯苷对照品，置于容量瓶中，加甲醇溶解并定容摇匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，得混合对照品溶液；

(3)高效液相色谱法测定白芍的指纹图谱

将按步骤(1)方法制备得到的10个批次的白芍饮片供试品溶液和混合对照品溶液分别注入高效液相色谱仪，测定指纹图谱；

(4)将步骤3中获得的10批白芍供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A；选择10批次白芍的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成白芍的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；并根据混合对照品溶液色谱图的保留时间标注对照指纹图谱中峰的化学成分。

作为优选方案，以上所述的白芍的指纹图谱检测方法，步骤(1)供试品溶液制备：精密称定白芍饮片粉末，置具塞锥形瓶中，加入60倍量体积浓度80％乙醇，超声提取30min，取出，取续滤液，用0.22μm微孔滤膜滤过，即得白芍饮片供试品溶液。

作为优选方案，以上所述的白芍的指纹图谱检测方法，步骤(2)混合对照品溶液的制备：精密称取芍药苷对照品5.25mg，1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖对照品5.25mg，没食子甲酯对照品5.03mg，没食子酸对照品5.27mg，苯甲酰芍药苷对照品5.14mg，苯甲酸对照品5.25mg，氧化芍药苷对照品5.22mg和芍药内酯苷对照品5.27mg置于10mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容摇匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，得到浓度分别为0.525mg/mL、0.525mg/mL、0.503mg/mL、0.527mg/mL、0.514mg/mL、0.525mg/mL、0.522mg/mL和0.527mg/mL的芍药苷、1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖、没食子甲酯、没食子酸、苯甲酰芍药苷、苯甲酸、氧化芍药苷和芍药内酯苷的混合对照品溶液。

作为优选方案，以上所述的白芍的指纹图谱检测方法，步骤(3)高效液相色谱测定的色谱条件为：

色谱柱为Merck C₁₈，规格为250mm×4.6mm，5μm，流动相：A相为乙腈，B相为含0.1％体积磷酸的水溶液；梯度洗脱；体积流量：1.0mL·min-1，柱温：35℃，进样量10μL，检测波长：225nm。

作为优选方案，以上所述的白芍的指纹图谱检测方法，其特征在于，梯度洗脱程序为：0～ 5min，95％～95％A；5至23min，95-87％A；23～28min，87％～87％A；28～40min，87-80％A； 40～45min，80％～80％A；45～70min，80-75％A；70～85min，75％～55％A；85至90min， 55～0A％；90～100min，0％～95％A。

本发明所述的白芍的指纹图谱检测方法，对照指纹图谱中有22个共有指纹峰。其中没食子酸为1号峰，保留时间为8.345min，没食子甲酯为2号峰，保留时间为24.372min，氧化芍药苷为3号峰，保留时间为26.227Min，芍药内酯苷为4号峰，保留时间为36.302min，芍药苷为5号峰，保留时间为39.303min，苯甲酸为6号峰，保留时间为47.571min，1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖为7号峰，保留时间为50.214min，苯甲酰芍药苷为8号峰，保留时间为82.281min。

本发明所述的白芍的指纹图谱检测方法，依据相似度数值，应用于白芍的质量控制，以指纹图谱相似度应大于0.90为检验质控标准。

本发明提供的白芍指纹图谱检测方法的最佳条件筛选过程：

1、样品提取条件的考察

(1)本发明提取溶剂分别采用了水、乙醇、正丁醇、甲醇、乙酸乙酯、石油醚进行了考察，结果表明，采用体积浓度为80％乙醇提取得到的图谱的峰的信息最为丰富，所以选择体积浓度80％乙醇作为提取溶剂。

(2)本发明通过比较超声提取、回流提取、索氏提取方法，考察结果表明，超声提取得到的指纹色谱峰的响应值较大、分离度好，并且在30min基本上能够提取完全，故选择超声30min 提取作为白芍样品的提取方法。

2、流动相的选择

本发明考察了以0.1％甲酸-甲醇、0.1％甲酸-乙腈、水-甲醇、水-乙腈、0.1％磷酸-甲醇以及0.1％磷酸-乙腈为流动相，对比结果表明以0.1％甲酸-甲醇、0.1％甲酸-乙腈为流动相时分离基线不平，0.1％磷酸-甲醇、水-甲醇及水-乙腈为流动相时色谱图有拖尾峰，而以乙腈-0.1％磷酸水为流动相时，色谱峰分离效果最佳。因此本发明优选乙腈-0.1％磷酸水为流动相。

3、检测波长的选择

本发明通过全波长扫描和3D等高线筛选，确定225nm为最佳波长，化学成分信息量最大，故选择245nm为最佳检测波长。

4、柱温的选择

本发明分别在25℃、30℃、35℃和40℃柱温下分析白芍，实验结果表明，在35℃柱温条件下，色谱峰分离情况最好，柱压也较低，因此，将35℃为最佳柱温条件。

5、色谱柱的选择

本发明通过大量实验筛选了不同的色谱柱，采用以下型号的色谱柱进行测定：

①Merck C18，规格为250mm×4.6mm，5μm

②Alltech C18柱，5μm，4.6mm×250mm

③SUPELCO 25cm×4.6mm，5μm，Col:50497154938-02

④CAPCELLPAK C18M.G 5u 250mm×4.6mm Cat.No:90104Col.No.03169

⑤Agilent ZORBAX*80AExtend－C184.6×250mm 5μPN:770450-902SN:USHR003183

筛选实验结果表明，由于白芍化学成分复杂，选用Merck C18，规格为250mm×4.6mm，5μm色谱峰分离良好，重现性最好。

有益效果：本发明提供的白芍指纹图谱检测方法具有以下优点：

本发明根据白芍中所含的活性成分，包括苷类、黄酮类、甾体类、鞣质、有机酸、生物碱等的结构性质特点，通过大量实验筛选出最佳的流动相组成，检测波长、色谱柱，柱温等色谱分析条件，经多次实验验证表明，本发明提供的白芍指纹图谱检测方法可以全面、客观、准确的检测和评价白芍的质量，为保证其临床疗效具有重要意义。

附图说明

图1为白芍混合对照品溶液的色图谱；

图2为10批生白芍样品特征指纹图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

实施例1白芍对照指纹图谱的建立及应用

1、仪器与试药

Shimadzu LC-20AD高效液相色谱系统(日本岛津公司)，包括岛津LC-Solusion工作站、在线脱气机、SIL-20A自动进样器、SPD-20A紫外-可见光检测器、CTO-20A柱温箱；BS2242S 电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；KQ5200DA型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

乙醇、磷酸(分析纯，南京维之诚化学试剂有限公司)，乙腈(色谱纯，美国天地公司)，水 (杭州娃哈哈公司)；

10个不同批次白芍药材分别购自安徽尚德中药饮片有限公司，批号170901，生白芍饮片(统货)；铜陵禾田中药饮片股份有限公司，批号20161024生白芍饮片(选片)；苏州市天灵中药饮片有限公司，批号171213，生白芍饮片；

江苏亚邦中药饮片有限公司，批号1706260，生白芍饮片(统货)；

苏州市春晖堂药业有限公司，批号170426，生白芍饮片；

安徽省万生中药饮片有限公司，批号170602，生白芍饮片；

亳州市永刚饮片有限公司，批号170406，生白芍饮片；

毫州市永刚饮片有限公司180223生白芍，安徽；

安徽美誉中药饮片有限公司，批号111708201，生白芍；

安徽谓博中药饮片有限公司，批号180501，生白芍。

2、一种白芍的指纹图谱检测方法，其包括以下步骤：

(1)供试品溶液制备

精密称定以上10个批次的白芍饮片粉末，分别置具塞锥形瓶中，加入60倍量体积浓度 80％乙醇，超声提取30min，取出，取续滤液，用0.22μm微孔滤膜滤过，即得10个批次的白芍饮片供试品溶液。

(2)混合对照品溶液的制备

精密称取芍药苷对照品5.25mg，1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖对照品5.25mg，没食子甲酯对照品5.03mg，没食子酸对照品5.27mg，苯甲酰芍药苷对照品5.14mg，苯甲酸对照品5.25mg，氧化芍药苷对照品5.22mg和芍药内酯苷对照品5.27mg置于10mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容摇匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，得到浓度分别为0.525mg/mL、0.525mg/mL、0.503mg/mL、0.527mg/mL、0.514mg/mL、0.525mg/mL、0.522mg/mL和0.527mg/mL的芍药苷、1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖、没食子甲酯、没食子酸、苯甲酰芍药苷、苯甲酸、氧化芍药苷和芍药内酯苷的混合对照品溶液。

(3)高效液相色谱法测定白芍的指纹图谱

将按步骤(1)方法制备得到的10个批次的白芍饮片供试品溶液和混合对照品溶液分别注入高效液相色谱仪，色谱条件为：色谱柱为Merck C₁₈，规格为250mm×4.6mm，5μm，流动相：A相为乙腈，B相为含0.1％体积磷酸的水溶液；梯度洗脱(0～5min，95％～95％A； 5至23min，95-87％A；23～28min，87％～87％A；28～40min，87-80％A；40～45min，80％～ 80％A；45～70min，80-75％A；70～85min，75％～55％A；85至90min，55～0A％；90～100min， 0％～95％A)；体积流量：1.0mL·min-1，柱温：35℃，进样量10μL，检测波长：225nm)测定指纹图谱；其中对照品的指纹图谱如图1所示(其中没食子酸为1号峰，保留时间为 8.345min，没食子甲酯为2号峰，保留时间为24.372min，氧化芍药苷为3号峰，保留时间为 26.227Min，芍药内酯苷为4号峰，保留时间为36.302min，芍药苷为5号峰，保留时间为 39.303min，苯甲酸为6号峰，保留时间为47.571min，1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖为7号峰，保留时间为50.214min，苯甲酰芍药苷为8号峰，保留时间为82.281min)。另外供试品的指纹图谱如图2所示。

(4)将步骤3中获得的10批白芍供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A；选择10批次白芍的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成白芍的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，对照指纹图谱中有22个共有指纹峰，(10批次供试品溶液的指纹图谱相识度均大于0.99)。

实施例2方法学考察

1、精密度试验

取同一份白芍药材，按上述实施例1的步骤(1)方法制备得到供试品溶液，按上述实施例1 步骤(3)色谱条件重复进样6次，以芍药苷为参照峰，计算出6次色谱峰的各共有峰相对保留时间、相对峰面积的RSD均小于1.3％，采用国家药典委员会“相似度评价软件(2004A)”进行评价，相似度为0.99，表明仪器精密度好。

2、重复性实验

精密称取6份同一批白芍的饮片粉末0.5g，上述实施例1的步骤(1)方法平行制得6份供试品溶液，按上述实施例1的步骤(3)色谱条件进样，以芍药苷为参照峰，计算出6次色谱峰的各共有峰相对保留时间、相对峰面积的RSD均小于1.4％，相似度为0.98，表明该方法重复性好。

3、稳定性试验

取同一份白芍药材供试品溶液，按上述步骤(3)色谱条件于0，2，6，12，18，24h进样，以芍药苷为参照峰，计算出6次色谱峰的各共有峰相对保留时间的RSD小于1.1％，相对峰面积的RSD小于2.1％，相似度为0.99，表明24h内供试品溶液的成分稳定，符合对指纹图谱的要求。

本发明用指纹图谱技术建立了白芍药材的HPLC指纹图谱，应用了《中药色谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统》对白芍饮片的指纹图谱进行数字化评价，分别从分离度、信号强度、均化程度、时间效率、化学信息量、相似度等多方面反映了白芍样品指纹图谱的信息，丰富而且详尽，能够对图谱隐含的定性、定量信息进行多侧面、全方位的数据挖掘。该方法可以更加全面地反映白芍药材所含的化学信息，为白芍饮片的质量控制提供新参考方法。

以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.一种白芍的指纹图谱检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)供试品溶液制备

精密称定白芍饮片粉末，置具塞锥形瓶中，加入体积浓度50～80％乙醇，提取30～60min，取出，取续滤液，用0.22μm微孔滤膜滤过，即得白芍饮片供试品溶液；

(2)混合对照品溶液的制备

精密称取芍药苷、1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖、没食子甲酯、没食子酸、苯甲酰芍药苷、苯甲酸、氧化芍药苷和芍药内酯苷对照品，置于容量瓶中，加甲醇溶解并定容摇匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，得混合对照品溶液；

(3)高效液相色谱法测定白芍的指纹图谱

将按步骤(1)方法制备得到的10个批次的白芍饮片供试品溶液和混合对照品溶液分别注入高效液相色谱仪，测定指纹图谱；色谱条件为：

色谱柱为Merck C₁₈，规格为250mm×4.6mm，5μm，流动相：A相为乙腈，B相为含0.1％体积磷酸的水溶液；梯度洗脱；体积流量：1.0mL·min^-1，柱温：35℃，进样量10μL，检测波长：225nm；梯度洗脱程序为：0～5min，95％～95％A；5至23min，95-87％A；23～28min，87％～87％A；28～40min，87-80％A；40～45min，80％～80％A；45～70min，80-75％A；70～85min，75％～55％A；85至90min，55～0%A；90～100min，0％～95％A；

(4)将步骤3中获得的10批白芍供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A；选择10批次白芍的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成白芍的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；并根据混合对照品溶液色谱图的保留时间标注对照指纹图谱中峰的化学成分。

2.根据权利要求1所述的白芍的指纹图谱检测方法，其特征在于，步骤(1)供试品溶液制备：精密称定白芍饮片粉末，置具塞锥形瓶中，加入60倍量体积浓度80％乙醇，超声提取30min，取出，取续滤液，用0.22μm微孔滤膜滤过，即得白芍饮片供试品溶液。

3.根据权利要求1所述的白芍的指纹图谱检测方法，其特征在于，步骤(2)混合对照品溶液的制备：精密称取芍药苷对照品5.25mg，1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖对照品5.25mg，没食子甲酯对照品5.03mg，没食子酸对照品5.27mg，苯甲酰芍药苷对照品5.14mg，苯甲酸对照品5.25mg，氧化芍药苷对照品5.22mg和芍药内酯苷对照品5.27mg置于10mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容摇匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，得到浓度分别为0.525mg/mL、0.525mg/mL、0.503mg/mL、0.527mg/mL、0.514mg/mL、0.525mg/mL、0.522mg/mL和0.527mg/mL的芍药苷、1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖、没食子甲酯、没食子酸、苯甲酰芍药苷、苯甲酸、氧化芍药苷和芍药内酯苷的混合对照品溶液。

4.根据权利要求1所述的白芍的指纹图谱检测方法，其特征在于，对照指纹图谱中有22个共有指纹峰。

5.根据权利要求4所述的白芍的指纹图谱检测方法，其特征在于，没食子酸为1号峰，保留时间为8.345min，没食子甲酯为2号峰，保留时间为24.372min，氧化芍药苷为3号峰，保留时间为26.227min，芍药内酯苷为4号峰，保留时间为36.302min，芍药苷为5号峰，保留时间为39.303min，苯甲酸为6号峰，保留时间为47.571min，1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖为7号峰，保留时间为50.214min，苯甲酰芍药苷为8号峰，保留时间为82.281min。

6.根据权利要求1所述的白芍的指纹图谱检测方法，其特征在于，依据相似度数值，应用于白芍的质量控制，以指纹图谱相似度应大于0.90为检验质控标准。

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