CN106841450A - 一种同时测定芍药中9种单体化合物的hplc方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种同时测定芍药中9种单体化合物的HPLC方法，所述方法测定的9种单体化合物分别为芍药苷、氧化芍药苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷、苯甲酸、儿茶素、丹皮酚、没食子酸、1,2,3,4,6‑0‑没食子酰葡萄糖，测定样品范围包括含有上述活性物质中1种以上的赤芍、白芍及其制剂，具体测定步骤如下：(1)标准品溶液的制备；(2)样品溶液的制备；(3)9种芍药中单体化合物含量测定标准曲线的建立；(4)样品中单体化合物含量的测定。本发明同时测定的芍药单体化合物种类多达9种，提高了检测效率，操作简单方便，具有很大的实用价值。

Description

一种同时测定芍药中9种单体化合物的HPLC方法
技术领域
本发明属于中药材及其制剂质量控制技术领域，涉及一种同时测定赤芍、白芍及其制剂中芍药苷、氧化芍药苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷、苯甲酸、儿茶素、丹皮酚、没食子酸、1,2,3,4,6-0-没食子酰葡萄糖9种单体化合物含量的方法。
背景技术
赤芍和白芍是我国传统中药材。赤芍为毛茛科芍药(Paeonia lactiflora Pall.)或川赤芍(Paeonia veitchii Lynch.)的干燥根，味苦，微寒，归肝经，具有清热凉血、散瘀止痛之功效；白芍为植物芍药水煮去皮后使用的干燥根，气微，味微苦、酸，归肝、脾经，具养血调经、敛阴止汗、柔肝止痛、平抑肝阳之功效。
赤芍和白芍中含有芍药苷、芍药内酯苷、儿茶素、没食子酰葡萄糖、丹皮酚、没食子酸等活性成分。其中，芍药苷含量最大，药典中也以芍药苷作为两种药材含量测定的目标检测成分。近几年研究发现，芍药苷具有扩张血管、镇静镇痛、抗炎、抗溃疡、解热、利尿的作用；芍药内酯苷具有镇痛、抗惊厥作用、抗炎、护肝的功效；儿茶素具有抗凝血、保护肝脏、清除自由基等活性；没食子酰葡萄糖具有抗炎、抗癌、抗血管生成、抗糖尿病等生物学活性；丹皮酚在心血管疾病防治方面也显示出良好的药理活性。因此仅以芍药苷作为赤芍、白芍药材唯一检测指标不够全面，已经不能满足社会发展对药品质量控制越来越高的要求。因此建立同时、多种、快捷、方便、可靠的芍药活性成分检测方法对赤芍、白芍及其制剂的质量控制具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种同时测定芍药中9种单体化合物的HPLC方法，该方法同时测定的芍药单体化合物种类多达9种，提高了检测效率，操作简单方便，具有很大的实用价值。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种同时测定芍药中9种单体化合物的HPLC方法，所述方法所测定的9种单体化合物分别为芍药苷、氧化芍药苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷、苯甲酸、儿茶素、丹皮酚、没食子酸、1,2,3,4,6-0-没食子酰葡萄糖，测定样品范围包括含有上述活性物质中1种以上的赤芍、白芍及其制剂，具体测定步骤如下：
(1)标准品溶液的制备：分别精密称取9种芍药中单体化合物标准品芍药苷、氧化芍药苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷、苯甲酸、儿茶素、丹皮酚、没食子酸、1,2,3,4,6-0-没食子酰葡萄糖2mg，至于1ml量瓶中，用乙腈溶解并定容，制得2mg/ml的溶液；
(2)样品溶液的制备：如果待测样品为固体，则精密称取固体粉末样品1g，放置于具塞三角瓶中，加乙醇溶液，超声提取，提取液经离心，取上清液加入样品瓶备用；如果待测样品为液体，则直接取待测液离心，取上清液加入样品瓶备用；
(3)9种芍药中单体化合物含量测定标准曲线的建立：色谱条件为C18色谱柱；流动相为A：乙腈和B：0.1～1.0％磷酸水溶液，流动相梯度洗脱条件为：0min为0％乙腈，40min为50％乙腈，42min为0％乙腈，50min为0％乙腈；流速1.0～2.0mL/min；检测波长200～275nm；柱温20～35℃；进样量为2～20uL；将2.0mg/ml的标准品溶液稀释成不同浓度，建立标准曲线，计算每个单体化合物线性回归方程；
(4)样品中单体化合物含量的测定：按上述标准曲线色谱条件对制备的样品溶液进行测定，利用线性回归方程，计算样品中9种单体化合物含量。
本发明具有如下优点：
1、同时测定的芍药中单体化合物种类多达9种，检测时间仅为50min，提高了检测效率，而且方法快捷简便、稳定可靠。
2、色谱柱为普通色谱柱，便于购买，降低了成本。
3、9种单体化合物在一定范围内均呈良好的线性关系，线性范围广，快捷简便、稳定可靠。
4、能够更好地分析芍药单体化合物的含量，为赤芍、白芍等药用植物及其制剂的质量控制提供理论依据。
附图说明
图1为混合标准品溶液色谱图，图中：1-没食子酸，2-氧化芍药苷，3-儿茶素，4-芍药内酯苷，5-芍药苷，6-没食子酰葡萄糖，7-苯甲酸，8-苯甲酰芍药苷，9-丹皮酚。
图2为野生赤芍提取物色谱图。
图3为白芍饮片提取物色谱图。
图4为通心络胶囊提取物色谱图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
本发明提供了一种同时测定芍药中芍药苷、氧化芍药苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷、苯甲酸、儿茶素、丹皮酚、没食子酸、1,2,3,4,6-0-没食子酰葡萄糖9种单体化合物的HPLC方法，具体实施步骤如下：
1、仪器与试剂
Waters高效液相色谱仪e2695-2998液相检测系统；C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm，waters公司)；KQ3200DE超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Milli-Q超纯水仪(法国默克化工技术有限公司)；minispin型离心机(德国Eppendorf公司)；BS210S电子天平(北京Sartorious有限公司)；手提式中药粉碎机(温岭市大德中药机械有限公司)。
标准品芍药苷(23180-57-6)、芍药内酯苷(39011-90-0)、氧化芍药苷(39011-91-1)、苯甲酰芍药苷(38642-49-8)、苯甲酸(65-85-0)、儿茶素(154-23-4)、丹皮酚(552-41-0)、没食子酸(149-91-7)、1,2,3,4,6-0-没食子酰葡萄糖(14937-32-7)购自于上海源叶生物科技有限公司，芍药内酯苷含量≥91.4％，其余标准品含量≥98％；乙腈为色谱纯(美国sigma公司)；赤芍药材采集于内蒙古莫力达瓦旗。
2、方法
2.1标准品溶液的制备：分别称取9种芍药中单体化合物标准品芍药苷、氧化芍药苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷、苯甲酸、儿茶素、丹皮酚、没食子酸、1,2,3,4,6-0-没食子酰葡萄糖标准品适量，用体积浓度为50％的乙腈溶解并定容，制得标准品溶液；
2.2样品溶液的制备：如果待测样品为固体，则精密称取固体粉末样品1g，放置于100ml具塞三角瓶中，加60％乙醇溶液20ml，40℃超声提取1h，提取液经12000r/min离心10min，取上清液加入HPLC样品瓶备用；如果待测样品为液体，则直接取待测液12000r/min离心10min，取上清液加入HPLC样品瓶备用；
2.3 9种芍药中单体化合物含量测定标准曲线的建立：色谱条件为C18色谱柱；流动相为A：乙腈和B：0.1％磷酸水溶液，流动相梯度洗脱条件为：0min为0％乙腈，40min为50％乙腈，42min为0％乙腈，50min为0％乙腈；流速1.0mL/min；检测波长230nm；柱温30℃；进样量为10uL；将标准品溶液逐级稀释，建立标准曲线，计算每个单体化合物线性回归方程；
2.4野生赤芍、白芍饮片和通心络胶囊样品中单体化合物含量的测定按上述标准曲线色谱条件对制备的样品溶液进行测定，利用线性回归方程，计算样品中9种单体化合物含量。
3结果
3.1色谱峰的归属
图1中标准品从左至右1～9号峰分别为：没食子酸(8.680min)、氧化芍药苷(14.804min)、儿茶素(15.495min)、芍药内酯苷(18.171min)、芍药苷(19.212min)、没食子酰葡萄糖(22.065min)、苯甲酸(26.020min)、苯甲酰芍药苷(31.918min)、丹皮酚(37.645min)，各标准品分离度良好。
3.2线性关系考察
分别将不同浓度的9种标准品溶液10uL进样，以峰面积为纵坐标，标准品浓度为横坐标，计算每个单体化合物线性回归方程见表1。
表1 9种成分线性回归方程及范围
标准品名称 回归方程 线性范围
没食子酸 0.9999 0.004～1.2
氧化芍药苷 0.9993 0.01～1.5
儿茶素 0.9991 0.044～0.66
芍药内酯苷 0.9994 0.038～1.14
芍药苷 0.9991 0.042～2.1
没食子酰葡萄糖 0.9993 0.05～1.25
苯甲酸 0.9994 0.04～0.6
苯甲酰芍药苷 0.9993 0.042～1.26
丹皮酚 0.9999 0.004～1.08
3.3精密度试验
9种标准品溶液分别进样10uL，重复进样6次，没食子酸、氧化芍药苷、儿茶素、芍药内酯苷、芍药苷、没食子酰葡萄糖、苯甲酸、苯甲酰芍药苷、丹皮酚峰面积的RSD分别为0.18％、0.35％、0.27％、0.30％、0.91％、0.16％、0.35％、0.37％、0.18％，可见精密度良好。
3.4稳定性试验
在0、2、4、8、24h分别进样10uL，没食子酸、氧化芍药苷、儿茶素、芍药内酯苷、芍药苷、没食子酰葡萄糖、苯甲酸、苯甲酰芍药苷、丹皮酚峰面积的RSD分别为0.48％、0.60％、0.52％、0.62％、0.57％、0.59％、0.54％、0.85％、0.39％，说明供试品溶液在24h内稳定。
3.5重复性试验
取同一批样品，按样品制备方法制备6份，分别进样10uL，没食子酸、氧化芍药苷、儿茶素、芍药内酯苷、芍药苷、没食子酰葡萄糖、苯甲酸、苯甲酰芍药苷、丹皮酚含量的RSD分别为1.79％、2.09％、2.18％、2.58％、2.31％、2.85％、1.61％、2.56％、2.78％，重复性较好。
3.6回收率试验
按照上述液相色谱条件，将一定量的标准品溶液移取加入到样品溶液中，与样品溶液同时测定。没食子酸、氧化芍药苷、儿茶素、芍药内酯苷、芍药苷、没食子酰葡萄糖、苯甲酸、苯甲酰芍药苷、丹皮酚回收率分别为99.56％、98.71％、98.37％、99.68％、99.13％、100.21％、98.7％、99.42％、100.06％，RSD分别为0.86％、1.35％、1.44％、1.75％、1.28％、0.97％、1.61％、1.04％、0.93％。
3.7样品含量测定
取野生赤芍、白芍饮片和通心络胶囊样品溶液按上述高效液相色谱条件进样分析，根据线性回归方程计算9种单体化合物的含量，见表2。
表2样品中9中单体化合物百分含量
化合物名称 野生赤芍(％) 白芍饮片(％) 通心络胶囊(％)
没食子酸 0.061 0.049 0.059
氧化芍药苷 0.828 0.123 0.039
儿茶素 0.134 0.036 -
芍药内酯苷 0.324 0.406 0.043
芍药苷 3.217 1.197 0.323
没食子酰葡萄糖 0.703 0.165 0.011
苯甲酸 0.075 0.007 -
苯甲酰芍药苷 0.077 0.025 0.008
丹皮酚 0.006 - -

Claims (3)

1.一种同时测定芍药中9种单体化合物的HPLC方法，其特征在于所述方法步骤如下：
(1)标准品溶液的制备：分别精密称取9种芍药中单体化合物标准品芍药苷、氧化芍药苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷、苯甲酸、儿茶素、丹皮酚、没食子酸、1,2,3,4,6-0-没食子酰葡萄糖2mg，至于1ml量瓶中，用乙腈溶解并定容，制得2mg/ml的溶液；
(2)样品溶液的制备：如果待测样品为固体，则精密称取固体粉末样品1g，放置于具塞三角瓶中，加乙醇溶液，超声提取，提取液经离心，取上清液加入样品瓶备用；如果待测样品为液体，则直接取待测液离心，取上清液加入样品瓶备用；
(3)9种芍药中单体化合物含量测定标准曲线的建立：色谱条件为C18色谱柱；流动相为A：乙腈和B：磷酸水溶液，流动相梯度洗脱条件为：0min为0％乙腈，40min为50％乙腈，42min为0％乙腈，50min为0％乙腈；流速1.0～2.0mL/min；检测波长200～275nm；柱温20～35℃；进样量为2～20uL；将2.0mg/ml的标准品溶液稀释成不同浓度，建立标准曲线，计算每个单体化合物线性回归方程；
(4)样品中单体化合物含量的测定：按上述标准曲线色谱条件对制备的样品溶液进行测定，利用线性回归方程，计算样品中9种单体化合物含量。
2.根据权利要求1所述的同时测定芍药中9种单体化合物的HPLC方法，其特征在于所述磷酸水溶液的体积浓度为0.1～1.0％。
3.根据权利要求1所述的同时测定芍药中9种单体化合物的HPLC方法，其特征在于所述待测样品为含有9种活性物质中1种以上的赤芍、白芍及其制剂中的一种。
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