CN106596777B - 丹灯通脑制剂的质量控制方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种丹灯通脑制剂的质量控制方法，涉药物分析技术领域。包括葛根素、野黄芩苷、丹酚酸B和丹参酮ⅡA的同时定量测定方法：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相；以乙腈‑磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱：乙腈‑磷酸水溶液梯度洗脱的体积比为10→14%：90→86%，0~15min；14→20%：86→80%，15~35min；20→40%：80→60%，35~55min；40→73%：60→27%，55~60min；73→73%：27→27%，60~80min；紫外检测器检测，波长280nm；制备对照品及供试品溶液；注入液相色谱仪，测定丹灯通脑制剂含量。该方法一次定量测定四种成分，提高了检测效率。
Description
技术领域
本发明涉药物分析技术领域。
背景技术
丹灯通脑胶囊与软胶囊是申请人开发的产品，主要由丹参、灯盏细辛、川芎和粉葛或葛根经提取而成的纯中药（彝药）复方制剂，主要功效为活血化瘀，祛风通络，临床用于瘀血阻络所致的中风，中经络证，治疗脑梗死恢复期康复治疗、慢性头痛、偏头痛等心血管类疾病，具有较好的效果。
丹灯通脑胶囊、丹灯通脑软胶囊为国药准字号药品，其现行国家药品标准编号分别为WS-10751（ZD-0751）-2002-2011Z 和WS-10721（ZD-0721）-2002-2012Z。2009年，国家食品药品监督管理局批准国内3家企业申报的丹灯通脑片改剂型品种上市，标准编号分别为YBZ06112009、YBZ04332009 和YBZ06512009。
丹灯通脑胶囊现行的国家药品标准WS-10751（ZD-0751）-2002-2011Z，仅包括葛根素、阿魏酸及丹酚酸B的鉴别项及野黄芩苷的含量测定；丹灯通脑软胶囊执行的国家药品标准WS-10721（ZD-0721）-2002-2012Z仅包括葛根素及丹酚酸B的鉴别项及野黄芩苷的含量测定。以上均为处方中某些药材的其中一个成分，不具有专属性及代表性，需进一步全面并选择有代表性的指标监测产品的质量。尽可能对处方中所有药材进行质量控制，使本品的质量更全面可控。
CN1823899提供了丹灯通脑口服制剂的质量控制方法，包括以川芎对照药材、葛根素对照品、丹参酮ⅡA对照品、野黄芩苷对照品为对照的薄层鉴别；含量测定为对制剂中葛根素的含量测定。其中四个薄层鉴别为四个供试品溶液，且分别鉴别；含量测定只对葛根素单一成分进行测定。CN101301353丹灯通脑药物制剂的质量控制方法，薄层鉴别是以川芎对照药材、葛根素对照品、野黄芩苷对照品为对照分别鉴别；含量测定为以葛根素、丹参酮ⅡA为指标分别测定。王鼎峰等公开了一种HPLC法同时测定丹灯通脑胶囊中（丹参、灯盏细辛、川芎、葛根）中阿魏酸、丹酚酸B、葛根素与野黄芩苷的方法（中成药，2014，36（12）第2532~2536页）。其中阿魏酸和丹酚酸B同时测定；葛根素、野黄芩苷同时测定。
综上所述，现有技术丹灯通脑组方制剂质量控制时，定量测定各个成分需要进行多次测定，才能完成测定指标，操作繁琐，检测时间长，检测成本高。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种丹灯通脑制剂的质量控制方法，该方法通过高效液相色谱法同时测定葛根素、野黄芩苷、丹酚酸B和丹参酮ⅡA的含量，使原本四次定量测定完成的测定指标，能够用一次定量测定完成，四成分的定量色谱图，波峰分离良好，方法鉴别、快捷、准确、重现，易于普及掌握，有效提高了检测效率，降低了检测成本，减少了环境污染。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：一种丹灯通脑制剂的质量控制方法，丹灯通脑制剂包括下述药材：丹参、灯盏细辛、川芎和粉葛或葛根，按中药制剂方法制得的，该质量控制方法包括葛根素、野黄芩苷、丹酚酸B和丹参酮ⅡA的同时定量测定方法：
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相；以乙腈-磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱：其中，乙腈-磷酸水溶液梯度洗脱的体积比为10%→14%：90%→86%，0~15min；14%→20%：86%→80%，15~35min；20%→40%：80%→60%，35~55min；40%→73%：60%→27%，55~60min；73%→73%：27%→27%，60~80min；紫外检测器检测，检测波长为280nm；
对照品溶液的制备：称取葛根素、野黄芩苷、丹酚酸B和丹参酮ⅡA对照品适量，加无水甲醇或甲醇水溶液制成对照品混合溶液，作为对照品溶液；
供试品溶液的制备：取丹灯通脑制剂内容物，加入无水甲醇或甲醇水溶液溶解，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
测定方法：分别吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定丹灯通脑制剂中葛根素、野黄芩苷、丹酚酸B和丹参酮ⅡA的含量。
优选的，供试品溶液的制备：取丹灯通脑制剂内容物0.1~1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 ml，密塞，称定重量，超声处理20分钟（超声处理功率为50~600W、频率为20~50 KHz），放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。微孔滤膜的过滤孔径为：0.40~0.50μm。
优选的，流动相中磷酸水溶液体积百分比浓度为：0.1%～0.4%。
流速为：0.8ml/min～1.2ml/min。
柱温为：25℃～35℃。
优选的，对照品溶液中葛根素的浓度为40μg/ml，野黄芩苷的浓度为60μg/ml，丹酚酸B的浓度为110μg/ml，丹参酮ⅡA的浓度为20μg/ml。
优选的，甲醇水溶液的体积百分比浓度为：75%≤甲醇水溶液的体积百分比浓度＜100%。
丹灯通脑制剂的质量控制方法，还包括川芎的薄层鉴别方法、丹参的薄层鉴别方法、灯盏细辛及葛根素的薄层鉴别方法；
川芎、丹参、灯盏细辛及葛根素的薄层鉴别供试品溶液的制备方法为：
取丹灯通脑制剂内容物，研细，加水，超声提取，放冷，离心，上清液用滤纸过滤，滤液用氨试液调节pH值至9~10，用乙酸乙酯萃取，蒸干，残渣加甲醇溶解，作为薄层鉴别供试品溶液。
川芎的薄层鉴别方法为：
取川芎对照药材，加水，加热回流，放冷，离心，上清液用滤纸过滤，滤液用氨试液调节pH值至9~10，用乙酸乙酯萃取，蒸干，残渣加甲醇溶解，作为川芎对照药材溶液；
按照丹灯通脑制剂配比称取除川芎以外的其他药材，按丹灯通脑制剂方法制得不含川芎的阴性对照样品，按照所述薄层鉴别供试品溶液的制备方法制备成川芎阴性对照样品溶液；
照薄层色谱法试验，吸取上述薄层鉴别供试品溶液、川芎对照药材溶液和川芎阴性对照样品溶液各5~10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比6：2：0.5的沸程30~60℃石油醚－三氯甲烷－三乙胺为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加热5分钟，置365nm紫外光灯下检视；
薄层鉴别供试品色谱中，在川芎对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，川芎阴性对照样品色谱中，在与川芎对照药材色谱相应位置上，未见对应的斑点，表明薄层鉴别供试品中含有川芎成分。
丹参的薄层鉴别方法为：
取丹参对照药材，加甲醇，超声处理，放冷，滤过，滤液作为丹参对照药材溶液；
按照丹灯通脑制剂配比称取除丹参以外的其他药材，按丹灯通脑制剂方法制得不含丹参的阴性对照样品，按照所述薄层鉴别供试品溶液的制备方法制备成丹参阴性对照样品溶液；
照薄层色谱法试验，吸取上述薄层鉴别供试品溶液、丹参对照药材溶液和丹参阴性对照样品溶液各5~10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比18：1：1的甲苯－乙酸乙酯－冰醋酸为展开剂，展开，取出，晾干，置日光下检视；
薄层鉴别供试品色谱中，在与丹参对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，丹参阴性对照样品色谱中，在与丹参对照药材色谱相应位置上，未见对应的斑点，表明薄层鉴别供试品中含有丹参成分。
灯盏细辛及葛根素的薄层鉴别方法为：
取灯盏细辛对照药材，加甲醇，超声处理，放冷，滤过，滤液作为灯盏细辛对照药材溶液；
另取葛根素对照品，加甲醇溶解，作为葛根素对照品溶液；
按照丹灯通脑制剂配比称取除灯盏细辛以外的其他药材，按丹灯通脑制剂方法制得不含灯盏细辛的阴性对照样品，按照所述薄层鉴别供试品溶液的制备方法制备成灯盏细辛阴性对照样品溶液；
按照丹灯通脑制剂配比称取除粉葛或葛根以外的其他药材，按丹灯通脑制剂方法制得不含粉葛或葛根的阴性对照样品，按照所述薄层鉴别供试品溶液的制备方法制备成粉葛或葛根阴性对照样品溶液；
照薄层色谱法试验，吸取上述薄层鉴别供试品溶液、灯盏细辛对照药材溶液、葛根素对照品溶液、灯盏细辛阴性对照样品溶液和粉葛或葛根阴性对照样品溶液各2~10μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以体积比5：4：1：0.5的乙酸乙酯－丁酮－甲酸－水为展开剂，展开，取出，晾干；
置254nm紫外光灯下检视，薄层鉴别供试品色谱中，在葛根素对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，粉葛或葛根阴性对照样品色谱中，在与葛根素对照品色谱相应位置上，未见对应的斑点，表明薄层鉴别供试品中含有葛根素成分；
喷以5%三氯化铝乙醇溶液，105℃加热1~5分钟，置365nm紫外光灯下检视，薄层鉴别供试品色谱中，在灯盏细辛对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，灯盏细辛阴性对照样品色谱中，在与灯盏细辛对照药材色谱相应位置上，未见对应的斑点，表明薄层鉴别供试品中含有灯盏细辛成分。
本丹灯通脑制剂质量控制方法适用于丹灯通脑胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂或丸剂。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于：
（1）本发明的丹灯通脑制剂质量控制方法，提供了处方中全部药味的薄层鉴别方法，并且四味药材的薄层鉴别为同一薄层鉴别供试品溶液，其中灯盏细辛与葛根素为同一薄层板鉴别，简化操作步骤，节省实验用溶剂、保护环境；
（2）本发明还提供了高效液相色谱法同时测定药物中葛根素、野黄芩苷、丹酚酸B和丹参酮ⅡA四个成分的含量测定方法，该方法对处方中三味药材同时进行了定量测定，并且同时测定了工艺中由乙醇提取的丹参药材中水溶性成分丹酚酸B及醇溶性成分丹参酮ⅡA的含量，使原本四次定量测定完成的测定指标，能够用一次定量测定完成。经试验研究，本发明测定方法准确度试验、精密度试验、专属性试验、线性试验、耐用性试验均符合国家药典相关规定要求，提高了丹灯通脑胶囊的质量控制标准，从而确保了该制剂的临床疗效，真正体现了药品安全有效、质量可控。
附图说明
图1是本发明实施例1中川芎鉴别薄层板色谱图；
图2是本发明实施例2中丹参鉴别薄层板色谱图；
图3是本发明实施例3中粉葛或葛根鉴别薄层板色谱图；
图4是本发明实施例3中灯盏细辛鉴别薄层板色谱图；
图5是本发明实施例4中葛根素、野黄芩苷、丹酚酸B和丹参酮ⅡA对照品高效液相色谱图；
图6是本发明实施例4中丹灯通脑制剂供试品高效液相色谱图。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明做进一步解释和说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。在不脱离本发明上述思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换或变更，均应包括在本发明的范围内。
实施例1，川芎的鉴别
取丹灯通脑制剂的内容物2~5g，研细，加水30ml，超声提取30分钟，放冷，离心（转速为每分钟4000转）10分钟，上清液用滤纸过滤，滤液用氨试液调节pH值至9~10，用乙酸乙酯萃取2次，每次25ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为薄层鉴别供试品溶液；
另取川芎对照药材1g，加水30ml，加热回流30分钟，放冷，离心（转速为每分钟4000转）10分钟，上清液用滤纸过滤，滤液用氨试液调节pH值至9~10，用乙酸乙酯萃取2次，每次25ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为川芎对照药材溶液；
按照丹灯通脑制剂配比称取除川芎以外的其他药材，按丹灯通脑制剂方法制得不含川芎的阴性对照样品，按照上述薄层鉴别供试品溶液的制备方法制备成川芎阴性对照样品溶液；
照薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各5~10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比6：2：0.5的石油醚（30~60℃）－三氯甲烷－三乙胺为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加热5分钟，置紫外光灯（365nm）下检视；
结果如图1所示，图中，从左到右，第1排为川芎对照药材，第2-11排为薄层鉴别供试品，第12排为川芎阴性对照样品。图中薄层鉴别供试品色谱中，在于川芎对照药材色谱相应的位置，显相同颜色的荧光斑点；川芎阴性对照样品色谱中，在与川芎对照药材色谱相应位置上，未见对应的斑点，表明薄层鉴别供试品中含有川芎成分。
实施例2，丹参的鉴别
取丹灯通脑制剂的内容物2~5g，研细，加水30ml，超声提取30分钟，放冷，离心（转速为每分钟4000转）10分钟，上清液用滤纸过滤，滤液用氨试液调节pH值至9~10，用乙酸乙酯萃取2次，每次25ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为薄层鉴别供试品溶液；
另取丹参对照药材0.5g，加甲醇5ml，超声处理20分钟，放冷，滤过，滤液作为丹参对照药材溶液；
按照丹灯通脑制剂配比称取除丹参以外的其他药材，按丹灯通脑制剂方法制得不含丹参的阴性对照样品，按照上述薄层鉴别供试品溶液的制备方法制备成丹参阴性对照样品溶液；
照薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各5~10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比18：1：1的甲苯－乙酸乙酯－冰醋酸为展开剂，展开，取出，晾干，置日光下检视；
结果如图2所示，图中，从左到右，第1排为丹参对照药材，第2-11排为薄层鉴别供试品，第12排为丹参阴性对照样品。图中薄层鉴别供试品色谱中，在于丹参对照药材色谱相应的位置，显相同颜色的斑点；丹参阴性对照样品色谱中，在与丹参对照药材色谱相应位置上，未见对应的斑点，表明薄层鉴别供试品中含有丹参成分。
薄层鉴别供试品色谱中，在与丹参对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，丹参阴性对照样品色谱中，在与丹参对照药材色谱相应位置上，未见对应的斑点，表明薄层鉴别供试品中含有丹参成分。
实施例3，灯盏细辛、粉葛或葛根的鉴别
取丹灯通脑制剂的内容物2~5g，研细，加水30ml，超声提取30分钟，放冷，离心（转速为每分钟4000转）10分钟，上清液用滤纸过滤，滤液用氨试液调节pH值至9~10，用乙酸乙酯萃取2次，每次25ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为薄层鉴别供试品溶液；
取灯盏细辛对照药材0.5g，加甲醇5ml，超声处理20分钟，放冷，滤过，滤液作为灯盏细辛对照药材溶液；
另取葛根素对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为葛根素对照品溶液；
按照丹灯通脑制剂配比称取除灯盏细辛以外的其他药材，按丹灯通脑制剂方法制得不含灯盏细辛的阴性对照样品，按照上述薄层鉴别供试品溶液的制备方法制备成灯盏细辛阴性对照样品溶液；
按照丹灯通脑制剂配比称取除粉葛或葛根以外的其他药材，按丹灯通脑制剂方法制得不含粉葛或葛根的阴性对照样品，按照上述薄层鉴别供试品溶液的制备方法制备成粉葛或葛根阴性对照样品溶液；
照薄层色谱法试验，吸取上述薄层鉴别供试品溶液、灯盏细辛对照药材溶液、葛根素对照品溶液及灯盏细辛阴性对照样品溶液、粉葛或葛根阴性对照样品溶液各2~10μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以体积比5：4：1：0.5的乙酸乙酯－丁酮－甲酸－水为展开剂，展开，取出，晾干；
置紫外光灯（254nm）下检视，结果如图3所示，图中，从左到右，第1排为粉葛或葛根阴性对照样品，第2排为葛根素对照品，第3-12排为薄层鉴别供试品，第13排为灯盏细辛对照药材，第14排为灯盏细辛阴性对照样品。图中薄层鉴别供试品色谱中，在葛根素对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，粉葛或葛根阴性对照样品色谱中，在与葛根素对照品色谱相应位置上，未见对应的斑点；
喷以5%三氯化铝乙醇溶液，105℃加热1~5分钟，置紫外光灯（365nm）下检视，结果如图4所示，图中，从左到右，第1排为粉葛或葛根阴性对照样品，第2排为葛根素对照品，第3-12排为薄层鉴别供试品，第13排为灯盏细辛对照药材，第14排为灯盏细辛阴性对照样品。图中薄层鉴别供试品色谱中，在灯盏细辛对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，灯盏细辛阴性对照样品色谱中，在与灯盏细辛对照药材色谱相应位置上，未见对应的斑点。
实施例4：葛根素、野黄芩苷、丹酚酸B和丹参酮ⅡA含量测定
4.1含量测定的方法
本法采用高效液相色谱法对方中丹参以丹酚酸B、丹参酮ⅡA为指标；灯盏细辛以野黄芩苷为指标；粉葛或葛根以葛根素为指标进行含量测定。
色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1%磷酸水溶液为流动相B，按下表进行梯度洗脱；流速：1ml/min；柱温：30℃；检测波长280nm。理论塔板数按野黄芩苷峰计算应不低于5000。
对照品溶液制备：精密称取葛根素、野黄芩苷、丹酚酸B、丹参酮ⅡA对照品适量，加无水甲醇制成每1ml 含葛根素40μg、野黄芩苷60μg、丹酚酸B110μg及丹参酮ⅡA20μg的混合溶液，即得。
供试品溶液制备：取装量差异项下的供试品丹灯通脑制剂内容物，约0.15~ 0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入无水甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理20分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定方法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
测定结果如图5和6，葛根素、野黄芩苷、丹酚酸B和丹参酮ⅡA对照品高效液相色谱图，以及丹灯通脑制剂供试品高效液相色谱图所示。
4.2含量测定的方法学研究
4.2.1仪器与试药
仪器： Agilent 1260高效液相色谱仪，包括自动进样器、二元泵、柱温箱、在线脱气装置和DAD检测器。
溶剂：HPLC分析用乙腈为Merck 试剂公司产品；甲醇为分析纯，国药集团有限公司产品；水为乐百氏双蒸水。
对照品:葛根素、野黄芩苷、丹酚酸B、丹参酮ⅡA购自中国食品药品检定研究院。
供试品：由云南神威施普瑞药业有限公司提供，批号为C1715001、C1715002、C1715006、C1715009、C1715011、16010221、16010321、16010421、16010921及16011021。
4.2.2阴性对照溶液的制备
分别除去丹参、灯盏细辛及粉葛或葛根药材，完全按照本品生产工艺和本品供试品溶液的制备方法制备得到相应的阴性对照溶液。
4.2.3系统适应性试验
在上述色谱条件下，分别取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各进样10ul，记录色谱图，结果：样品中野黄芩苷理论塔板数计算：n＝113316(≥ 5000)；各定量色谱峰与
杂质峰的分离度均大于1.5；葛根素保留时间为17.6min、野黄芩苷保留时间为37.7min、丹酚酸B保留时间为48.9min、丹参酮ⅡA保留时间为69.3min；表明辅料及杂质峰对主峰干扰较小，符合系统适用性试验的要求（如图6所示）。
4.2.4线性关系考察
对照品溶液的配制：称取各对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml分别含葛根素40μg、野黄芩苷60μg、丹酚酸B110μg、丹参酮ⅡA20μg的混合对照溶液。分别精密吸取对照品溶液1μl、2μl、5μl、10μl、20μl、30μl，注入液相色谱仪进行测定，以峰面积为纵坐标，以进样量为横坐标进行线性回归，结果见表1。
表1线性关系结果
4.2.5 精密度试验
取同一供试品溶液，连续进样5次，按拟定色谱条件测定。结果表明，本方法精密度良好。
表2 精密度试验结果
结果表明，该方法系统适应性良好，葛根素、野黄芩苷、丹酚酸B、丹参酮ⅡA相对标准偏差分别为0.06%、1.42%、0.64%、0.37%。
4.2.6稳定性试验
取同一供试品溶液，分别在0h、2h、4h、8h、12h、24h精密吸取10μl注入液相色谱仪进行测定，结果见表 3。
表3稳定性试验结果
结果表明，该供试品溶液至少在24h内稳定，葛根素、野黄芩苷、丹酚酸B、丹参酮ⅡA相对标准偏差分别为0.58%、1.58%、0.56%、0.41%。
4.2.7重复性考察
取同一批次，低、中、高浓度各3份，供9份，按照供试品方法制得9份供试品溶液，分别精密吸取10μl上述供试品溶液，注入液相色谱仪进行测定，计算含量（mg/g），结果见表4。
表4 重复性考察结果
结果表明，该方法重复性良好，葛根素、野黄芩苷、丹酚酸B、丹参酮ⅡA相对标准偏差分别为1.07%、1.65%、1.66%、1.02%。
4.2.8回收率试验
精密称取葛根素0.01007g（含量以95.5%计）、野黄芩苷0.0107g（含量以93.7%计）、丹酚酸B0.02108g（含量以91.3%计）、丹参酮ⅡA0.00632g（含量以98.9%计），分别置50ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备溶液。分别精密量取上述葛根素对照品储备液4ml、野黄芩苷对照品储备液6ml、丹酚酸B对照品储备液6ml及丹参酮ⅡA对照品储备液2ml，置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为低浓度混合对照品溶液；分别精密量取上述葛根素对照品储备液8ml、野黄芩苷对照品储备液12ml、丹酚酸B对照品储备液12ml及丹参酮ⅡA对照品储备液4ml，置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为中浓度混合对照品溶液；分别精密量取上述葛根素对照品储备液12ml、野黄芩苷对照品储备液18ml、丹酚酸B对照品储备液18ml及丹参酮ⅡA对照品储备液6ml，置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为高浓度混合对照品溶液。取已知含量的样品9份，每份约0.075g，精密称定，每三份为一组。分别精密加入低、中、高三个浓度的混合对照品溶液各25ml，按供试品溶液制备项下方法制备供试品溶液。按拟定的色谱条件测定，计算回收率。
表5加样回收率试验结果
表5续表 加样回收率试验结果
结果表明，该检测方法具有一定准确度，葛根素、野黄芩苷、丹酚酸B及丹参酮ⅡA加样回收率分别为100.40%、100.39%、99.38%及99.82%。
4.2.9样品测定。
取十批不同批次本品按照要求制得的供试品溶液，精密吸取对照品溶液及供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪测定，计算含量（mg/粒），结果见表 6。
表6丹灯通脑胶囊中各成分的含量
实施例5：葛根素、野黄芩苷、丹酚酸B和丹参酮ⅡA含量测定
本法采用高效液相色谱法对方中丹参以丹酚酸B、丹参酮ⅡA为指标；灯盏细辛以野黄芩苷为指标；粉葛或葛根以葛根素为指标进行含量测定。
色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.4%磷酸水溶液为流动相B，按下表进行梯度洗脱；流速：0.8ml/min；柱温：35℃；检测波长280nm。理论塔板数按野黄芩苷峰计算应不低于5000。
对照品溶液制备：精密称取葛根素、野黄芩苷、丹酚酸B、丹参酮ⅡA对照品适量，加体积百分比浓度为75%的甲醇水溶液制成每1ml 含葛根素40μg、野黄芩苷60μg、丹酚酸B110μg及丹参酮ⅡA20μg的混合溶液，即得。
供试品溶液制备：取装量差异项下的供试品丹灯通脑制剂内容物，约0.15~ 0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积百分比浓度为75%的甲醇水溶液25ml，密塞，称定重量，超声处理20分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定方法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定丹灯通脑制剂中葛根素、野黄芩苷、丹酚酸B和丹参酮ⅡA的含量。各定量色谱峰与杂质峰的分离度均大于1.5；辅料及杂质峰对主峰干扰较小，符合系统适用性试验的要求。
实施例6：葛根素、野黄芩苷、丹酚酸B和丹参酮ⅡA含量测定
本法采用高效液相色谱法对方中丹参以丹酚酸B、丹参酮ⅡA为指标；灯盏细辛以野黄芩苷为指标；粉葛或葛根以葛根素为指标进行含量测定。
色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.25%磷酸水溶液为流动相B，按下表进行梯度洗脱；流速：1.2ml/min；柱温：25℃；检测波长280nm。理论塔板数按野黄芩苷峰计算应不低于5000。
对照品溶液制备：精密称取葛根素、野黄芩苷、丹酚酸B、丹参酮ⅡA对照品适量，加体积百分比浓度为90%的甲醇水溶液制成每1ml 含葛根素40μg、野黄芩苷60μg、丹酚酸B110μg及丹参酮ⅡA20μg的混合溶液，即得。
供试品溶液制备：取装量差异项下的供试品丹灯通脑制剂内容物，约0.15~ 0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积百分比浓度为90%的甲醇水溶液25ml，密塞，称定重量，超声处理20分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定方法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定丹灯通脑制剂中葛根素、野黄芩苷、丹酚酸B和丹参酮ⅡA的含量。各定量色谱峰与杂质峰的分离度均大于1.5；辅料及杂质峰对主峰干扰较小，符合系统适用性试验的要求。
本发明的丹灯通脑胶囊质量控制方法，提供了鉴别药物中川芎、丹参、灯盏细辛、粉葛的方法，并提供了高效液相色谱法测定药物中葛根素、野黄芩苷、丹酚酸B、丹参酮ⅡA的含量，该质量控制方法能更好地控制药品的质量，具有较强的专属性和良好的重现性，真正体现药品安全有效、质量可控。
本文虽然已经给出了本发明的一些实施例，但是本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明精神的情况下，可以对本文的实施例进行改变。上述实施应以本文的实施例作为本发明权利范围的限定。
Claims (10)
1.一种丹灯通脑制剂的检测方法，所述丹灯通脑制剂包括下述药材：丹参、灯盏细辛、川芎和粉葛或葛根，按中药制剂方法制得的，其特征在于：该检测方法包括葛根素、野黄芩苷、丹酚酸B和丹参酮ⅡA的同时定量测定方法：
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相；以乙腈-磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱：其中，乙腈-磷酸水溶液梯度洗脱的体积比为10％→14％：90％→86％，0～15min；14％→20％：86％→80％，15～35min；20％→40％：80％→60％，35～55min；40％→73％：60％→27％，55～60min；73％→73％：27％→27％，60～80min；紫外检测器检测，检测波长为280nm；
对照品溶液的制备：称取葛根素、野黄芩苷、丹酚酸B和丹参酮ⅡA对照品适量，加无水甲醇或甲醇水溶液制成对照品混合溶液，作为对照品溶液；
供试品溶液的制备：取丹灯通脑制剂内容物，加入无水甲醇或甲醇水溶液溶解，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
测定方法：分别吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定丹灯通脑制剂中葛根素、野黄芩苷、丹酚酸B和丹参酮ⅡA的含量。
2.根据权利要求1所述的丹灯通脑制剂的检测方法，其特征在于，流动相中磷酸水溶液体积百分比浓度为：0.1％～0.4％。
3.根据权利要求1所述的丹灯通脑制剂的检测方法，其特征在于，流速为：0.8ml/min～1.2ml/min。
4.根据权利要求1所述的丹灯通脑制剂的检测方法，其特征在于，柱温为：25℃～35℃。
5.根据权利要求1所述的丹灯通脑制剂的检测方法，其特征在于，对照品溶液中葛根素的浓度为40μg/ml，野黄芩苷的浓度为60μg/ml，丹酚酸B的浓度为110μg/ml，丹参酮ⅡA的浓度为20μg/ml。
6.根据权利要求1所述的丹灯通脑制剂的检测方法，其特征在于，甲醇水溶液的体积百分比浓度为：75％≤甲醇水溶液的体积百分比浓度＜100％。
7.根据权利要求1所述的丹灯通脑制剂的检测方法，其特征在于，该检测方法还包括川芎的薄层鉴别方法、丹参的薄层鉴别方法、灯盏细辛及葛根素的薄层鉴别方法；
川芎、丹参、灯盏细辛及葛根素的薄层鉴别供试品溶液的制备方法为：
取丹灯通脑制剂内容物，研细，加水，超声提取，放冷，离心，上清液用滤纸过滤，滤液用氨试液调节pH值至9～10，用乙酸乙酯萃取，蒸干，残渣加甲醇溶解，作为薄层鉴别供试品溶液。
8.根据权利要求7所述的丹灯通脑制剂的检测方法，其特征在于，川芎的薄层鉴别方法为：
取川芎对照药材，加水，加热回流，放冷，离心，上清液用滤纸过滤，滤液用氨试液调节pH值至9～10，用乙酸乙酯萃取，蒸干，残渣加甲醇溶解，作为川芎对照药材溶液；
按照丹灯通脑制剂配比称取除川芎以外的其他药材，按丹灯通脑制剂方法制得不含川芎的阴性对照样品，按照所述薄层鉴别供试品溶液的制备方法制备成川芎阴性对照样品溶液；
照薄层色谱法试验，吸取上述薄层鉴别供试品溶液、川芎对照药材溶液和川芎阴性对照样品溶液各5～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比6：2：0.5的沸程30～60℃石油醚－三氯甲烷－三乙胺为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，105℃加热5分钟，置365nm紫外光灯下检视；
薄层鉴别供试品色谱中，在川芎对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，川芎阴性对照样品色谱中，在与川芎对照药材色谱相应位置上，未见对应的斑点，表明薄层鉴别供试品中含有川芎成分。
9.根据权利要求7所述的丹灯通脑制剂的检测方法，其特征在于，丹参的薄层鉴别方法为：
取丹参对照药材，加甲醇，超声处理，放冷，滤过，滤液作为丹参对照药材溶液；
按照丹灯通脑制剂配比称取除丹参以外的其他药材，按丹灯通脑制剂方法制得不含丹参的阴性对照样品，按照所述薄层鉴别供试品溶液的制备方法制备成丹参阴性对照样品溶液；
照薄层色谱法试验，吸取上述薄层鉴别供试品溶液、丹参对照药材溶液和丹参阴性对照样品溶液各5～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比18：1：1的甲苯－乙酸乙酯－冰醋酸为展开剂，展开，取出，晾干，置日光下检视；
薄层鉴别供试品色谱中，在与丹参对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，丹参阴性对照样品色谱中，在与丹参对照药材色谱相应位置上，未见对应的斑点，表明薄层鉴别供试品中含有丹参成分。
10.根据权利要求7所述的丹灯通脑制剂的检测方法，其特征在于，灯盏细辛及葛根素的薄层鉴别方法为：
取灯盏细辛对照药材，加甲醇，超声处理，放冷，滤过，滤液作为灯盏细辛对照药材溶液；另取葛根素对照品，加甲醇溶解，作为葛根素对照品溶液；
按照丹灯通脑制剂配比称取除灯盏细辛以外的其他药材，按丹灯通脑制剂方法制得不含灯盏细辛的阴性对照样品，按照所述薄层鉴别供试品溶液的制备方法制备成灯盏细辛阴性对照样品溶液；
按照丹灯通脑制剂配比称取除粉葛或葛根以外的其他药材，按丹灯通脑制剂方法制得不含粉葛或葛根的阴性对照样品，按照所述薄层鉴别供试品溶液的制备方法制备成粉葛或葛根阴性对照样品溶液；
照薄层色谱法试验，吸取上述薄层鉴别供试品溶液、灯盏细辛对照药材溶液、葛根素对照品溶液、灯盏细辛阴性对照样品溶液和粉葛或葛根阴性对照样品溶液各2～10μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以体积比5：4：1：0.5的乙酸乙酯－丁酮－甲酸－水为展开剂，展开，取出，晾干；
置254nm紫外光灯下检视，薄层鉴别供试品色谱中，在葛根素对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，粉葛或葛根阴性对照样品色谱中，在与葛根素对照品色谱相应位置上，未见对应的斑点，表明薄层鉴别供试品中含有葛根素成分；
喷以5％三氯化铝乙醇溶液，105℃加热1～5分钟，置365nm紫外光灯下检视，薄层鉴别供试品色谱中，在灯盏细辛对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，灯盏细辛阴性对照样品色谱中，在与灯盏细辛对照药材色谱相应位置上，未见对应的斑点，表明薄层鉴别供试品中含有灯盏细辛成分。
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