CN103698432B - 测定荔枝核提取物中皂苷含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种测定荔枝核提取物中皂苷含量的方法，其步骤如下：（1）制备对照品溶液；（2）制备供试品溶液；（3）精密吸取人参皂苷对照品溶液进样，测定峰面积，得标准曲线方程；（4）精密吸取的供试品溶液进样，测定峰面积，根据上述标准曲线计算样品皂苷含量。本发明的方法基于高效液相色谱-蒸发光散射检测，该法专属性好，重现性好，稳定性强，从而使得对产品的质量控制和用药安全得到保证。
Description
技术领域
本发明属于药物质量控制领域，特别涉及一种测定荔枝核提取物中皂苷含量的方法。
背景技术
荔枝核（Lychee Seed,Litchi Seed），为无患子科植物荔枝（Litchi Chinensis Sonn）的干燥成熟种子，别名荔仁、荔核、大荔核，收载于《中国药典》2010版一部，性温，味甘、微苦，具有行气散结，祛寒止痛功效。《本草纲目》记载，荔枝核“止渴、益人颜色、食之止烦渴”（烦渴病，现代医学称为糖尿病）。研究表明，荔枝核有降低血糖、调节血脂、提高抗氧化、抑制乙肝病毒表面抗原的作用。荔枝核所含成分研究较为充分，主要成分有皂苷、黄酮及花色素类、植物甾醇类、鞣质及多酚类、脂肪酸、氨基酸、蛋白质和多糖等。实验研究和临床治疗显示荔枝核提取物能够显著降低血糖和血脂，有效治疗糖尿病及代谢综合征。充分利用本地丰富的荔枝核资源，开发成安全有效、质量可控的治疗糖尿病的药物供临床应用，对改变因生活方式改变而引起的糖尿病患病率居高不下的趋势，具有重要的社会意义和市场价值。
中国专利CN102048885公开了一种制备荔枝核提取物的提取工艺，通过该工艺获得的提取物主要成分为荔枝核皂苷，含量达85%以上，其制备工艺为：将荔枝核粉碎为20目大小，取适量，加入3倍量的水浸润10分钟，称取1%重量（以药材计）的纤维素酶、1%重量（以药材计）的果胶酶和1%重量（以药材计）的葡聚糖酶加入其中，混匀，控温50℃酶解3小时后加入3倍量的70%乙醇，超声提取40分钟，滤过，滤液减压回收乙醇及浓缩，浓缩液经大孔树脂吸附，再用70%乙醇洗脱，收集洗脱液，洗脱液减压回收乙醇及浓缩得浸膏，将浸膏真空低温干燥即得荔枝核提取物。该提取物可作为中间体加入适量制药辅料后制成用于治疗糖尿病的药物。为保证药物的安全、有效、稳定，有必要对作为中间体的提取物的质量进行监控。
目前，作为原料药材的荔枝核为《中国药典》收载的法定药材，其中仅通过鉴别、浸出物等指标进行简单的质量控制，并无有效成分的含量测定项。荔枝核制剂仅有文献报道采用高效液相色谱法,以原儿茶酸为对照测定荔枝核复方制剂“降糖片”中的原儿茶酸含量作为质控指标（郭宇洁等，降糖片中荔枝核提取工艺优选和定量测定，《中国实验方剂学杂志》，2009年，第15卷,第8期：50-52），原儿茶酸为黄酮类成分而非皂苷类成分，因此不具参考性。从现有文献对荔枝核皂苷成分的含量测定方法分析，普遍是采用皂苷与香草醛-浓酸（高氯酸、硫酸、冰醋酸等）显色后进行紫外分光光度法进行测定，其原理是强酸使皂苷的酚羟基脱水，再与香草醛缩合形成共轭体系而显色（方欢乐等，荔枝核皂苷含量测定及提取工艺优选研究，《亚太传统医药》，2010年，第6卷（第3期）：17-19.）。该方法原先用于测定人参皂苷等成分。但荔枝核提取物中除含有皂苷成分外，也含有多酚、原花青素等成分，这类成分也具有酚羟基结构，因此也能与香草醛-浓酸反应显色，也有文献报道采用该法测定荔枝核中原花青素的含量（丁丽，荔枝核化学成分的研究（天津科技大学硕士学位论文，2006年），《中国优秀硕士论文全文数据库》）。因此采用该方法测定荔枝核提取物的皂苷含量，将会使测定值偏高，不能反映提取物中皂苷的真实含量，不利于提取物的质量控制。因此，建立一种能准确检测荔枝核提取物皂苷含量的质量检测方法具有现实的意义。
发明内容
本发明的目的是针对以上技术问题，提供一种专属性好，重现性好，稳定性强的测定中药荔枝核提取物中皂苷含量的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现：
一种测定荔枝核提取物中皂苷含量的方法，其步骤如下：
（1）制备对照品溶液：取人参皂苷Rg1对照品，置于容量瓶，加入甲醇溶解，定容，摇匀，制成对照品溶液；
（2）制备供试品溶液：取荔枝核提取物粉末1.0g，精密称定，加50mL甲醇超声提取30min，滤过，滤液回收甲醇至净，残渣加水10mL使溶解，转移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇萃取3次,每次10mL，合并正丁醇萃取液，于水浴上蒸干，残渣以色谱纯甲醇溶解，转移至10mL量瓶中，并以色谱纯甲醇稀释至刻度，摇匀，以0.2μm微孔滤膜滤过，续滤液作为供试品溶液；
（3）精密吸取人参皂苷对照品溶液0.5、1、3、5、10、20μL进样，测定峰面积；以不同的进样量C的对数值和峰面积积分值A的对数值进行回归，得标准曲线方程：A=1.8152C-1.3038，R2=0.9918；
（4）精密吸取供试品溶液10μL，进样，测定峰面积，根据上述标准曲线计算样品皂苷含量。
根据本发明的方法，所述步骤（1）中的对照品溶液每毫升含人参皂苷Rg10.10mg。
根据本发明的方法，，所述色谱条件为：色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，规格为：4.6mm×250mm,5μm；流动相为甲醇-水（70:30），流速为1.0mL/min，柱温为30℃；检测器为蒸发光散射检测器，漂移管温度为90℃，氮气流速为2.0L/min。
经本法测定，专利CN102048885中所公开的荔枝核提取物所含皂苷以浸膏干重计不少于0.8g/g。
与现有技术相比，本发明基于高效液相色谱-蒸发光散射检测(HPLC-ELSD)，提供一种新的荔枝核皂苷的含量测定方法，该法专属性好，重现性好，稳定性强，从而使得对产品的质量控制和用药安全得到保证。
具体实施方式
实施例1
1、仪器：
Agilent1100高效液相色谱仪(Agilent公司,美国)，包括脱气机，四元梯度泵，自动进样器，柱温箱和HP Chemstation工作站；Allteeh ELSD2000检测器(Allteeh公司，美国)；AE240型电子分析天平(梅特勒一托利多仪器有限公司)；Buchi旋转蒸发仪(Buchi公司,瑞士);KQ3200B超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。
2、试药：
荔枝核提取物（按照专利CN102048885方法自制）；人参皂苷Rg1对照品（中国食品药品检定研究院）；正丁醇（分析纯）；甲醇（色谱纯）。
3、色谱条件：
色谱柱为Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18柱，规格为：4.6mm×250mm,5μm;流动相为甲醇-水（70:30），流速为1.0mL/min，柱温30℃；检测器为蒸发光散射检测器，检测参数：漂移管温度90℃，氮气流速为2.0L/min。
4、试验方法：
4.1对照品溶液的制备：
精密称取人参皂苷Rg1对照品，置于容量瓶，加入甲醇溶解，定容，摇匀，制成每毫升含人参皂苷Rg10.10mg的对照品溶液。
4.2供试品溶液的制备：
取荔枝核提取物粉末1.0g，精密称定，加50mL甲醇超声提取30min，滤过，滤液回收甲醇至净，残渣加水10mL使溶解，转移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇萃取3次，每次10mL合并正丁醇萃取液，于水浴上蒸干，残渣以色谱纯甲醇溶解,转移至10mL量瓶中,并以色谱纯甲醇稀释至刻度，摇匀，以0.2μm微孔滤膜滤过，续滤液作为供试品溶液。
4.3标准曲线制备：
精密吸取人参皂苷对照品溶液0.5、1、3、5、10、20μL进样，测定峰面积。以不同的进样量C的对数值和峰面积积分值A的对数值进行回归，得标准曲线方程：A=1.7835C-1.3736，R2=0.9918。
4.4精密度研究：
精密吸取4.1项下对照品溶液10μL，注入液相色谱仪中，测定峰面积，重复进样6次，测得人参皂苷Rg1峰面积RSD为1.87%，表明仪器精密度良好。
4.5回收率实验：
在已知皂苷含量的提取物溶液中定量加入对照品溶液，混匀，吸取10μL，按以上条件测定峰面积，根据标准曲线计算皂苷对照品的量，计算回收率，回收率为99.3%。
4.6稳定性研究：
分别在0,1,2,4,8小时精密吸取4.1项下对照品溶液10μL，注入液相色谱仪中，测定峰面积，峰面积RSD为2.13%，表明供试品溶液在8小时内稳定。
实施例2
1、仪器：
Agilent1100高效液相色谱仪(Agilent公司,美国)，包括脱气机，四元梯度泵，自动进样器，柱温箱和HP Chemstation工作站；Allteeh ELSD2000检测器(Allteeh公司，美国)；AE240型电子分析天平(梅特勒一托利多仪器有限公司)；Buchi旋转蒸发仪(Buchi公司,瑞士);KQ3200B超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。
2、试药：
荔枝核提取物（按照专利CN102048885方法自制）；人参皂苷Rg1对照品（中国食品药品检定研究院）；正丁醇（分析纯）；甲醇（色谱纯）。
3、色谱条件：
色谱柱为Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18柱，规格为：4.6mm×250mm,5μm;流动相为甲醇-水（70:30），流速为1.0mL/min，柱温30℃；检测器为蒸发光散射检测器，检测参数：漂移管温度90℃，氮气流速为2.0L/min。
4、试验方法：
4.1对照品溶液的制备：
精密称取人参皂苷Rg1对照品，置于容量瓶，加入甲醇溶解，定容，摇匀，制成每毫升含人参皂苷Rg10.10mg的对照品溶液。
4.2供试品溶液的制备：
取荔枝核提取物粉末1.0g，精密称定，加50mL甲醇超声提取30min，滤过，滤液回收甲醇至净，残渣加水10mL使溶解,转移至分液漏斗中,用水饱和的正丁醇萃取3次,每次10mL合并正丁醇萃取液,于水浴上蒸干,残渣以色谱纯甲醇溶解,转移至10ml量瓶中,并以色谱纯甲醇稀释至刻度,摇匀,以0.2μm微孔滤膜滤过，续滤液作为供试品溶液。
4.3标准曲线制备：
精密吸取人参皂苷对照品溶液0.5、1、3、5、10、20μL进样，测定峰面积。以不同的进样量C的对数值和峰面积积分值A的对数值进行回归，得标准曲线方程：A=1.8152C-1.3038，R2=0.9918。
4.4样品皂苷含量测定：
精密吸取4.2项下的供试品溶液10μL，进样，测定峰面积，根据标准曲线计算样品皂苷含量。经计算，提取物皂苷含量为0.809g/g。
Claims (1)
1.一种测定荔枝核提取物中皂苷含量的方法，其步骤如下：
（1）制备对照品溶液：取人参皂苷Rg1对照品，置于容量瓶，加入甲醇溶解，定容，摇匀，制成对照品溶液，所述对照品溶液每毫升含人参皂苷Rg1 0.10mg；
（2）制备供试品溶液：取荔枝核提取物粉末1.0g，精密称定，加50 mL甲醇超声提取30min，滤过，滤液回收甲醇至净，残渣加水10 mL使溶解，转移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇萃取3次,每次10 mL，合并正丁醇萃取液，于水浴上蒸干，残渣以色谱纯甲醇溶解，转移至10 mL量瓶中，并以色谱纯甲醇稀释至刻度，摇匀，以0.2μm微孔滤膜滤过，续滤液作为供试品溶液；
（3）精密吸取人参皂苷对照品溶液0.5、1、3、5、10、20μL进样，测定峰面积；以不同的进样量C的对数值和峰面积积分值A的对数值进行回归，得标准曲线方程：A=1.8152C-1.3038，R2=0.9918；
（4）精密吸取的供试品溶液10μL，进样，测定峰面积，根据上述标准曲线计算样品皂苷含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，色谱条件为：色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，规格为：4.6mm×250mm,5μm；流动相为甲醇-水，甲醇：水=70:30，流速为1.0 mL/min，柱温为30℃；检测器为蒸发光散射检测器，漂移管温度为90℃，氮气流速为2.0L/min。
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