CN103969353B - 一种大黄丹参提取物的指纹图谱的鉴别方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了大黄丹参提取物的指纹图谱鉴别方法，包括供试品溶液的制备、指纹图谱的测定、对照指纹图谱的确定和大黄丹参提取物指纹图谱的鉴别。通过对大黄丹参提取物进行高效液相色谱（HPLC）指纹图谱测定和分析，确定了9个大黄丹参提取物的特征峰，这些共有特征峰构成了大黄丹参提取物的指纹特征，可作为大黄丹参提取物的对照指纹图谱；对需要鉴别的大黄丹参提取物可以与对照指纹图谱进行比对，检查共有特征峰的情况，以鉴别质量。本发明具有方法简便、重现性好、特征峰明显、准确可靠等特点，有利于鉴别大黄丹参提取物的质量。

Description

一种大黄丹参提取物的指纹图谱的鉴别方法

技术领域

本发明涉及一种大黄丹参提取物指纹图谱的鉴别方法，具体地说是用高效液相色谱指纹图谱法来对大黄丹参提取物的有效成分进行质量控制的一种鉴别方法。

背景技术

大黄具有攻积滞、清湿热、泻火、凉血、祛瘀、解毒等功效，为《中华人民共和国药典2010版》一部收载品种。大黄为蓼科植物掌叶大黄Rheumpalmatum,L．、唐古特大黄Rheumtanguticum／Maxim.exBalf.或药用大黄Rheumoj-flcinaleBaill.的干燥根和根茎。大黄药材中的主要成分是蒽醌苷及双蒽酮苷，其醌苷有：大黄酚-1-葡萄糖苷或大黄酚苷、大黄素-6-葡萄糖苷、芦荟大黄素-8-葡萄糖苷、大黄素甲醚葡萄糖苷、大黄酸-8-葡萄糖苷；掌叶大黄中还含有大黄素双葡萄糖苷、芦荟大黄素双葡萄糖苷、大黄酚双葡萄糖苷。双蒽酮苷有番泻苷A、B、C、D、E、F。游离型蒽醌类主要有：大黄酚、大黄素、大黄素甲醚、芦荟大黄素、大黄酸。大黄又含有大黄鞣酸及其相关物质,如没食子酸、儿茶素、大黄四聚素。此外，大黄尚含有脂肪酸、草酸钙、葡萄糖、果糖和淀粉。目前大黄药材的质量控制方法主要有：以芦荟大黄素(C₁₅H₁₀O₅)、大黄酸(C₁₅H₈0₆)、大黄素(C₁₅H₁₀0₅)、大黄酚(C₁₀H₁₀0₄)和大黄素甲醚(C₁₆H₁₂0₅)的总量测定作为含量测定方法《中华人民共和国药典2010版一部》；丹参主要含结晶性菲醌类化合物：丹参酮I、IIA、IIB，异丹参酮I、异丹参酮II，隐丹参酮，异隐丹参酮、羟基丹参酮IIA、丹参新酮、左旋二氢丹参酮I、丹参酚等。此外，尚含原儿茶醛、原儿茶酸、琥珀酸、熊果酸、乳酸、维生素E等。目前丹参药材的质量控制方法主要有：以丹参酮ⅡA(C₁₉H₁₈0₃)、丹酚酸B(C₃₆H₃₀0₁₆)的含量测定作为含量测定方法《中华人民共和国药典2010版一部》；杨树声采用HPLC法同时测定丹参类药材中水溶性活性成分的含量（甘肃中医学院学报，2008年06期）；王伟采用反相高效液相色谱法同时测定丹参药材中丹参素(Ⅰ)、迷迭香酸(Ⅱ)、紫草酸(Ⅲ)、丹酚酸B(Ⅳ)的含量（安徽医药,AnhuiMedicalandPharmaceuticalJournal，2010年11期）；宋洁瑾通过建立丹参药材的指纹图谱,对不同产地丹参药材质量进行评价（辽宁中医杂志,2008年03期）。

中药指纹图谱是指某些中药材或中药制剂经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性。“整体性”和“模糊性”为其显著特点。中国食品药品监督管理局于2000年颁布了《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）》，要求中药注射剂必须进行指纹图谱的研究，并建立其相关的标准。规范了中药指纹图谱的研究，从而掀起了国内近几年来对指纹图谱的研究热潮。目前，采用指纹图谱技术除了能反映几乎全部成分的含量、种类外，尚能反映成分的比例、未知成分（含量测定方法中可能已被作为无效或干扰成分扣除）的产生，更多的是从药物稳定性、安全性上进行监测。目前中药提取物产业发展迅速，但其质量控制技术水平不高，对质量控制较成熟的方法有单个成分含量测定或一类成分如总皂苷、总黄酮等的紫外分光光度测定法，不能对提取物进行全面直观的质量控制。本发明通过指纹图谱技术对大黄丹参提取物种的化学成分进行整体控制和综合评价，能够有效的鉴别大黄丹参提取物的质量。

发明内容

本发明的目的是提供一种大黄丹参提取物的指纹图谱鉴别方法，通过指纹图谱测定对大黄丹参提取物进行全面而有效的鉴别。

大黄丹参提取物的制备方法：

以大黄、丹参为原料，两味药材以重量份计为：大黄70-150g，丹参60-120g。取大黄、丹参，混合，加水煎煮，煎液浓缩后加乙醇沉淀，吸取上清液，回收乙醇，再加入明胶溶液静置除鞣质，将除鞣质后的上清液制成。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的。

本发明大黄丹参提取物的指纹图谱鉴别方法，该方法包括如下步骤：

(a)色谱条件与系统适应性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈或甲醇、乙腈甲醇混合溶剂为流动相A，以甲酸水溶液或冰醋酸水溶液、磷酸水溶液、三氟乙酸水溶液为流动相B。检测器为紫外检测器、示差检测器或蒸发光检测器；

(b)精密吸取供试品溶液至量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，收取滤液，备用。

(c)测定法吸取供试品溶液适量，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。

进一步优选的测定条件为：

(a)色谱条件与系统适应性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长10~25cm，内径3~5cm，粒径为1~10μm)；以乙腈为流动相A，以0.01~2%冰醋酸水溶液为流动相B；紫外检测器，检测波长200~400nm；柱温20~50℃，流速为每分钟0.2~2ml。

(b)供试品溶液的制备精密吸取大黄丹参提取物供试品溶液0.5～1ml至10～20ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。用微孔滤膜0.22～0.45μm滤过，收取滤液，备用。

(c)测定法吸取供试品溶液5~40μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。

最佳测定条件:

(a)色谱条件与系统适应性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm；以乙腈为流动相A，以0.3%冰醋酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为280nm；柱温25℃；流速为每分钟0.9ml。

(b)供试品溶液的制备精密吸取供试品溶液0.5ml至10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，取续滤液，即得。

(c)测定法精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，记录75分钟色谱图，即得。

供试品色谱图应与对照图谱基本一致，得到的大黄丹参提取物的对照指纹图谱如图1所示，有相对应的9个特征峰。按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，供试品指纹图谱与对照指纹图谱经相似度计算，5分钟后的色谱峰，其相似度不得低于0.90。

相对保留时间

1号峰：0.132号峰：0.183号峰：0.294号峰：0.66

5号峰：0.866号峰：0.937号峰：0.978号峰（S）：1.00

9号峰：1.01

峰1为没食子酸；峰2为丹参素；峰3我原儿茶醛；峰5为迷迭香酸峰；峰6为丹酚酸B；峰7为丹酚酸A；峰8为大黄素糖苷。

这9个峰峰面积比为：峰1（2000~4000）：峰2（750~1700）：峰3（500~1200）：峰4（300~800）：峰5（500~1500）：峰6（550~1600）：峰7（50~1300）：峰8（1000~2500）:峰9（150~1800）

本发明与背景技术相比具有的有益效果

目前关于大黄丹参提取物的指纹图谱未见报道。本发明的特点是：流动相中A（乙腈）所占的比例随时间由低逐渐升高，流动相B（0.3%冰醋酸）比例随时间逐渐下降，采用梯度洗脱的方式，使得流动相的极性随时间变化，针对样品中中各种成分极性不同的特点，从而实现良好的分离。

附图说明

图1是大黄丹参提取物的对照指纹图谱。其中从左到右分别标出了其共有特征峰1至9号。

图2是本发明提供的大黄丹参提取物的对照指纹图谱。其中从左到右分别标出了其共有特征峰1至9号。

实施例一：大黄丹参提取物指纹图谱测定

1、仪器：Agilent1260型高效液相色谱仪，G1311C四元泵，柱温箱，G1316A，G1315D，DAD检测器，AgilentZorbaxEclipseXDBC18色谱柱（4.6×250mm，5μm）。质谱仪器系统为ESI-MSn质谱仪（Bruker公司）。

试剂：乙腈为色谱纯（Burdick&Jackson,HoneywellInternationalInc.,USA）、冰醋酸色谱纯（TediacompanyInc.,USA）、水（Millipore,Bedford,MA,USA)，其它试剂均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。所有样品留样保存在中国科学院上海药物研究所中药现代化中心样品室。

2、色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，AgilentZorbaxEclipseXDBC18色谱柱（柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm）；以乙腈为流动相A，以0.3%冰醋酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为280nm；柱温25℃；流速为每分钟0.9ml。

梯度洗脱时间

3．供试品溶液的制备精密吸取大黄丹参提取物供试品溶液0.5ml至10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，取续滤液，即得。

4．测定法精密吸取供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录75分钟色谱图。供试品色谱图应与对照图谱基本一致，有相对应的9个特征峰，不应有缺峰现象。

5．大黄丹参提取物样品指纹图谱测定结果（见表1）

表1大黄丹参提取物相似度计算结果

以33批大黄丹参提取物建立对照图谱如图2所示

相对保留时间

1号峰：0.132号峰：0.183号峰：0.294号峰：0.66

5号峰：0.866号峰：0.937号峰：0.978号峰（S）：1.00

9号峰：1.01

峰1为没食子酸；峰2为丹参素；峰3我原儿茶醛；峰5为迷迭香酸峰；峰6为丹酚酸B；峰7为丹酚酸A；峰8为大黄素糖苷。

6方法学考察

6.1仪器精密度考察

取批号为T20110903A样品，按照前述供试品溶液制备方法制备，连续进样6次，考察指纹图谱精密度。将精密度实验色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》，计算相似度，结果有较高的相似度（相似度在0.98以上，见表2），表明仪器精密度较高。

表2大黄丹参提取物HPLC指纹图谱精密度相似度

6.2指纹图谱重复性试验

供试品制备和分析方法如前所述，取同一批号大黄丹参提取物（批号T20110903A），平行制备6份供试品，考察指纹图谱的变化情况。将重复性实验色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》，计算相似度，如表3所示，结果表明有较高的相似度（相似度均在0.99以上）。

表3大黄丹参提取物HPLC指纹图谱重复性相似度

6.3指纹图谱稳定性试验

按照前述方法制备大黄丹参提取物（批号T20110903A）供试品一份，于常温下保存，分别在0、4、8、12、16、24小时测定供试品溶液，考察稳定性，，相似度计算结果见表4。大黄丹参提取物供试品溶液在24小时内稳定。

表4大黄丹参提取物HPLC指纹图谱稳定性相似度

实施例二：大黄丹参提取物指纹图谱测定

1.仪器：Agilent1260型高效液相色谱仪，G1311C四元泵，柱温箱，G1316A，G1315D，DAD检测器，AgilentZorbaxEclipseXDBC18色谱柱（4.6×250mm，5μm）。质谱仪器系统为ESI-MSn质谱仪（Bruker公司）。

试剂：乙腈为色谱纯（Burdick&Jackson,HoneywellInternationalInc.,USA）、冰醋酸色谱纯（TediacompanyInc.,USA）、水（Millipore,Bedford,MA,USA)，其它试剂均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。大黄酸对照品购自中国生物制品有限公司。

2.色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，AgilentZorbaxEclipseXDBC18色谱柱（柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm）；以乙腈为流动相A，以0.3%冰醋酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为230nm；柱温20℃；流速为每分钟0.5ml。

梯度洗脱时间

3.供试品溶液的制备精密吸取大黄丹参提取物供试品溶液0.5ml至10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，取续滤液，即得。

4.测定法精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录75分钟色谱图。供试品色谱图应与对照图谱基本一致，有相对应的9个特征峰，不应有缺峰现象。

5.大黄丹参提取物样品指纹图谱测定结果见表5

表533批大黄丹参提取物相似度结果

实施例三：大黄丹参提取物指纹图谱测定

1.仪器：Agilent1260型高效液相色谱仪，G1311C四元泵，柱温箱，G1316A，G1315D，DAD检测器，AgilentZorbaxEclipseXDBC18色谱柱（4.6×250mm，5μm）。质谱仪器系统为ESI-MSn质谱仪（Bruker公司）。

试剂：乙腈为色谱纯（Burdick&Jackson,HoneywellInternationalInc.,USA）、冰醋酸色谱纯（TediacompanyInc.,USA）、水（Millipore,Bedford,MA,USA)，其它试剂均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。大黄酸对照品购自中国生物制品有限公司。

2.色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，AgilentZorbaxEclipseXDBC18色谱柱（柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm）；以乙腈为流动相A，以0.3%冰醋酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为380nm；柱温45℃；流速为每分钟1.8ml。

梯度洗脱时间

3.供试品溶液的制备精密吸取大黄丹参提取物供试品溶液0.5ml至10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，取续滤液，即得。

4.测定法精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录75分钟色谱图。供试品色谱图应与对照图谱基本一致，有相对应的9个特征峰，不应有缺峰现象。

5.大黄丹参提取物样品指纹图谱测定结果见表6

表633批大黄丹参提取物相似度结果

实验证实，采用本发明的方法，可有效的鉴别大黄丹参提取物的质量。

Claims (3)

1.大黄丹参提取物的指纹图谱鉴别方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)大黄丹参提取物的制备方法：

以大黄、丹参为原料，两味药材以重量份计为：大黄70-150g，丹参60-120g，取大黄、丹参，混合，加水煎煮，煎液浓缩后加乙醇沉淀，吸取上清液，回收乙醇，再加入明胶溶液静置除鞣质，将除鞣质后的上清液制成；

(2)供试品溶液的制备：精密吸取大黄丹参提取物供试品溶液0.5～1ml至10～20ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜0.22～0.45μm滤过，收取滤液，备用；

(3)指纹图谱测定：取供试品溶液适量，注入高效液相色谱仪，记录75分钟以内的色谱图，得到由其共有特征峰构成的大黄丹参提取物对照高效液相指纹图谱；其中高效液相色谱分析的条件如下：用十八烷基键合硅胶为填充剂的AgilentZorbaxEclipseXDBC18色谱柱4.6×250mm；乙腈-0.01～2％冰醋酸为流动相梯度洗脱，梯度程序为：0min→5min→30min→45min→60min→62min→75min对应流动相：乙腈：2％→7％→15％→20％→35％→50％→50％；0.01-2％冰醋酸：98％→93％→85％→80％→65％→50％→50％；检测波长为200nm-400nm；流速为0.2ml/min-2ml/min；柱温为20℃-50℃；所得到的大黄丹参提取物的对照指纹图谱有9个共有特征峰，其相对保留时间分别为：1号峰：0.13，2号峰：0.18，3号峰：0.29，4号峰：0.66，5号峰：0.86，6号峰：0.93，7号峰：0.97，8号S峰：1.00，9号峰：1.01。

2.根据权利要求1所述的大黄丹参提取物的指纹图谱鉴别方法，其特征在于：其中所述的检测波长为280nm；流速为0.9ml/min；柱温为25℃。

3.根据权利要求1所述的大黄丹参提取物的指纹图谱鉴别方法，其特征在于：其中的流动相乙腈-0.01～2％冰醋酸用乙腈-0.03％磷酸溶液或乙腈-0.03％甲酸溶液代替。