CN108760923A - 丹参川芎嗪注射液的hplc指纹图谱检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种丹参川芎嗪注射液的HPLC指纹图谱检测方法，属于中药注射液的指纹图谱分析方法。包括供试品溶液的制备，混合对照品溶液的制备，注入高效液相色谱仪,按照编辑好的洗脱梯度进行洗脱，记录色谱图，用指纹图谱软件对所得图谱进行处理。本发明建立的丹参川芎嗪注射液指纹图谱分析方法，可以快速、灵敏、准确地对丹参川芎嗪注射液的质量进行全面地控制，弥补了丹参川芎嗪注射液质量标准中缺少指纹图谱检查项的不足，为丹参川芎嗪注射液安全性再评价提供相应的技术方法。

Description

丹参川芎嗪注射液的HPLC指纹图谱检测方法
技术领域
本发明属于中药注射液的指纹图谱分析方法，具体涉及丹参川芎嗪注射液的HPLC指纹图谱检测方法。
背景技术
丹参川芎嗪注射液是临床上常用的中药注射液之一，该注射液采用水提醇沉法从丹参中提取水溶性成分并和盐酸川芎嗪、甘油均匀混合，加入注射用水制得。丹参是唇形科植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bge)的干燥根和根茎，从丹参中可以分离得到丹参素、原儿茶醛、原儿茶酸、咖啡酸、异阿魏酸、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸A、B、C等水溶性酚酸类成分，其水溶性成分具有增加冠脉流量、抗心肌缺氧的作用。川芎嗪是从川芎根茎中提取的一种活性成分，具有抗血栓、扩张血管等方面的药理作用，盐酸川芎嗪是市售川芎嗪的主要形式之一。目前，丹参川芎嗪注射液主要用于闭塞性脑血管疾病、脑栓塞、及其他缺血性心血管疾病。
丹参川芎嗪注射液的标准收载于《国家药品标准-化学药品地方标准上升国家标准》第十二册，该标准中采用不同的色谱条件分别对注射液中的丹参素和盐酸川芎嗪含量进行测定，但对注射液的单一成分进行含量测定难以全面地反应注射剂的内在质量。中药指纹图谱能够全面、系统地反应中药制剂的整体特征，为中药制剂质量控制提供有效方法，国家药品监督管理局在2002制订《中药注射剂色谱指纹图谱实验研究技术指南(试行)》，要求对已批准的中药注射剂和申报的新的中药注射剂实行药材和制剂的指纹图谱标准。目前对丹参川芎嗪注射液的文献报道多集中于含量测定，鲜有对其HPLC指纹图谱的报道。为了更有效、更快速的检测注射剂的质量，本发明拟通过对同一生产厂家生产的十批注射液进行分析，建立起丹参川芎嗪注射液的HPLC指纹图谱，为控制注射剂质量提供可靠的依据。
发明内容
本发明提供一种丹参川芎嗪注射液的HPLC指纹图谱检测方法，解决因注射液中盐酸川芎嗪的含量过高而导致的色谱峰比例失调的问题，该检测方法可以快速、全面、准确的评估参川芎嗪注射液的质量，对控制丹参川芎嗪注射液的质量和保证临床疗效具有重要意义。
本发明采取的技术方案是，包括下列步骤：
步骤1、供试品溶液的制备：
制备丹参川芎嗪注射液供试品溶液；
步骤2、混合对照品溶液的制备：
精密称取丹参素钠、原儿茶醛、盐酸川芎嗪、异阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸A对照品，混合置于5ml容量瓶中，定容作为混合对照品溶液；
步骤3、测定：
分别精密吸取丹参川芎嗪供试品溶液和混合对照品溶液，注入高效液相色谱仪，按照编辑好的洗脱梯度进行洗脱，记录色谱图；
步骤4、数据处理：
用指纹图谱软件对所得图谱进行处理，即得到丹参川芎嗪注射液指纹图谱。
本发明步骤1中丹参川芎嗪注射液供试品溶液的制备，制备方法为：
取丹参川芎嗪注射液一支，用注射器精密量取1.0ml，置于5ml容量瓶中，用甲醇稀释并定容，混合均匀后吸取适量溶液置于高效液相色谱仪的进样瓶中备用。
本发明步骤2中混合对照品溶液的制备方法为，精密称取丹参素钠对照品2.3mg，原儿茶醛对照品2.7mg，盐酸川芎嗪对照品2.6mg，异阿魏酸对照品1.0mg，迷迭香酸对照品1.2mg，丹酚酸A对照品2.7mg，混合置于5ml容量瓶中，加入甲醇溶解，并定容至刻度线，超声溶解摇匀，作为混合对照品溶液。
本发明步骤3中指纹图谱的液相色谱条件为，色谱柱：华谱Unitary系列C18色谱柱，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱直径为4.6mm，长度为250mm，填料的粒径为5μm；采用二元泵控制流动相比例，以甲醇为流动相A，0.05％磷酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱，具体为：
0到17分钟，甲醇的比例为20％，0.05％磷酸水溶液的比例为80％；
17到23分钟，甲醇的比例由20％均匀上升到27％，0.05％磷酸水溶液的比例由80％均匀下降到73％；
23到50分钟，甲醇的比例由27％均匀上升到45％，0.05％磷酸水溶液的比例由73％均匀下降到55％；
50到80分钟，甲醇的比例由45％均匀上升到65％，0.05％磷酸水溶液的比例由55％均匀下降到35％；
80到90分钟，甲醇的比例由65％均匀上升到100％，0.05％磷酸水溶液的比例由35％均匀下降到0％；
检测波长：254nm；柱温：30℃；体积流量：1.0ml/min。
本发明所述丹参川芎嗪注射液指纹图谱共有8个共有指纹峰，8个共有指纹峰中丹参素钠为1号峰、保留时间为6.439分钟，原儿茶醛为2号峰、保留时间为11.118分钟，盐酸川芎嗪为3号峰、保留时间为13.009分钟，异阿魏酸为4号峰、保留时间为38.559分钟，迷迭香酸为6号峰、保留时间为50.966分钟，丹酚酸A为7号峰、保留时间为58.715分钟。
本发明有益效果：
(1)本发明构建的丹参川芎嗪注射液指纹图谱能从整体上对制剂的质量进行控制，使评价结果更加全面。
(2)本发明针对注射液的组成，构建反映组方药材指纹特征的丹参川芎嗪注射液指纹图谱，指纹峰特征专属性好，稳定可靠、精密度高、分离度好，指纹图谱的精密度、稳定性和重现性较好。
(3)由于指纹图谱是针对组方药材而构建的，不是为了测定某个成分的精确含量，而是要充分反映组方药材所含的化学成分信息。本发明中，丹参川芎嗪注射液是由丹参提取液经稀释后，加入盐酸川芎嗪而制成的，因此一般的检测波长下，盐酸川芎嗪峰是一个既高又宽的峰，与同一张谱图中其他峰的比例严重失调，其他峰既矮又窄，因此本实验选择不同的检测波长分别测定同一样品，筛选出最适宜的检测波长，务求全面地反映化学成分信息。这样检测的色谱峰较多，各个峰吸收值合理，灵敏度高，基线平稳。
(4)本发明采用丹参川芎嗪注射液的指纹图谱作为丹参川芎嗪注射液质量的控制手段，既避免了因只测定1、2种化学成分而判定制剂整体质量的片面性，同时避免了为使质量达标而存在的认为因素。同时通过对多个批次的样品进行系统分析，能更加全面、科学的平均丹参川芎嗪注射液的质量，从而使产品的质量和疗效得到保证。
附图说明
图1是丹参川芎嗪注射液供试品的色谱图；
图2是丹参川芎嗪注射液供试品的对照指纹图谱；
图3是丹参川芎嗪注射液供试品的指纹图谱检测图谱；
图4是混合标准品对照图谱。
具体实施方式
包括下列步骤：
步骤1、供试品溶液的制备：
制备丹参川芎嗪注射液供试品溶液；
步骤2、混合对照品溶液的制备：
精密称取丹参素钠、原儿茶醛、盐酸川芎嗪、异阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸A对照品，混合置于5ml容量瓶中，定容作为混合对照品溶液；
步骤3、测定：
分别精密吸取丹参川芎嗪供试品溶液和混合对照品溶液，注入高效液相色谱仪，按照编辑好的洗脱梯度进行洗脱，记录色谱图；
步骤4、数据处理：
用指纹图谱软件对所得图谱进行处理，即得到丹参川芎嗪注射液指纹图谱。
本发明步骤1中丹参川芎嗪注射液供试品溶液的制备，制备方法为：
取丹参川芎嗪注射液一支，用注射器精密量取1.0ml，置于5ml容量瓶中，用甲醇稀释并定容，混合均匀后吸取适量溶液置于高效液相色谱仪的进样瓶中备用。
本发明步骤2中混合对照品溶液的制备方法为，精密称取丹参素钠对照品2.3mg，原儿茶醛对照品2.7mg，盐酸川芎嗪对照品2.6mg，异阿魏酸对照品1.0mg，迷迭香酸对照品1.2mg，丹酚酸A对照品2.7mg，混合置于5ml容量瓶中，加入甲醇溶解，并定容至刻度线，超声溶解摇匀，作为混合对照品溶液。
本发明步骤3中指纹图谱的液相色谱条件为，色谱柱：华谱Unitary系列C18色谱柱，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱直径为4.6mm，长度为250mm，填料的粒径为5μm；采用二元泵控制流动相比例，以甲醇为流动相A，0.05％磷酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱，具体为：
0到17分钟，甲醇的比例为20％，0.05％磷酸水溶液的比例为80％；
17到23分钟，甲醇的比例由20％均匀上升到27％，0.05％磷酸水溶液的比例由80％均匀下降到73％；
23到50分钟，甲醇的比例由27％均匀上升到45％，0.05％磷酸水溶液的比例由73％均匀下降到55％；
50到80分钟，甲醇的比例由45％均匀上升到65％，0.05％磷酸水溶液的比例由55％均匀下降到35％；
80到90分钟，甲醇的比例由65％均匀上升到100％，0.05％磷酸水溶液的比例由35％均匀下降到0％；
检测波长：254nm；柱温：30℃；体积流量：1.0ml/min。
本发明所述丹参川芎嗪注射液指纹图谱共有8个共有指纹峰，8个共有指纹峰中丹参素钠为1号峰、保留时间为6.439分钟，原儿茶醛为2号峰、保留时间为11.118分钟，盐酸川芎嗪为3号峰、保留时间为13.009分钟，异阿魏酸为4号峰、保留时间为38.559分钟，迷迭香酸为6号峰、保留时间为50.966分钟，丹酚酸A为7号峰、保留时间为58.715分钟。
以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步说明，本文所使用的技术和科学术语与相关领域技术人员理解相同。
1.材料
1.1仪器
ACchrom S6000型高效液相色谱仪(华谱新创科技有限公司)；FA1104N型电子分析天平(昆山市超声仪器有限公司)；KQ3200V型超声波清洗器(上海民桥精密科学仪器有限有限公司)；YHG-400-Ⅱ型远红外快速干燥箱(上海跃进医疗器械有限公司)；一次性使用无菌注射器(江苏治宇医疗器材有限公司)。
1.2药品与试剂
丹参川芎嗪注射液为市售药品，生产企业为吉林四长制药有限公司，批号：20170202(S1)、20170203(S2)、20170204(S3)、20170205(S4)、20170206(S5)、20170207(S6)、20170208(S7)、20170209(S8)、20170210(S9)、20170211(S10)。丹参素钠对照品(批号：110855-200809；中国药品生物制品检定所)，原儿茶醛对照品(批号：110810-200205；中国药品生物制品检定所)，盐酸川芎嗪对照品(批号：110817-201006；中国食品药品检定研究院)，异阿魏酸(批号：180102；北京普天同创生物科技有限公司)、迷迭香酸(批号：111871-201102；中国食品药品检定研究院)、丹酚酸A(批号：171217；北京普天同创生物科技有限公司)；甲醇(色谱级，美国Fisher试剂公司)；纯净水(白山娃哈哈饮料有限公司)；磷酸(分析纯，北京化工厂)。
2.溶液的制备
2.1注射液供试品溶液的制备
取丹参川芎嗪注射液一支，用精密量取1.0ml，置于5ml容量瓶中，用甲醇稀释并定容，混合均匀后吸取适量溶液置于高效液相色谱仪的进样瓶中备用。
2.2混合对照品供试品溶液的配制
精密称取丹参素钠对照品2.3mg，原儿茶醛对照品2.7mg，盐酸川芎嗪对照品2.6mg，异阿魏酸对照品1.0mg，迷迭香酸对照品1.2mg，丹酚酸A对照品2.7mg，混合置于5ml容量瓶中，加入甲醇溶解，并定容至刻度线，超声溶解摇匀，作为混合对照品备用液。
3.供试品制备方法及色谱条件的确定
3.1供试品溶液制备方法的确定
3.1.1注射液供试品溶液制备方法的确定
取生产批号为20170209的丹参川芎嗪注射液作为原液，精确吸取1.0ml注射液，分别转移到5ml、25ml、50ml、100ml容量瓶中，用甲醇稀释并定容。分别吸取稀释好的供试品溶液及原液1.5ml装入样品瓶中，在相同的色谱条件下，连续进样6次，得到不同的HPLC色谱图。比较6个色谱图发现，当原液进样时，盐酸川芎嗪的响应值过高，出现平头峰不利于相对峰面积的计算；当原液稀释25倍、50倍、100倍时，虽然盐酸川芎嗪的响应值降低，但是其他峰的相应值低，计算峰面积的误差较大；当原液稀释5倍时，盐酸川芎嗪的响应值虽高，但没有形成平头峰，其他峰的响应值适中。故本实验采用将原液稀释5倍的方法，制备注射液供试品溶液。
3.1.2混合对照品供试品溶液制备的确定
分别配制丹参素钠、原儿茶醛、原儿茶酸、盐酸川芎嗪、阿魏酸、异阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸A、丹酚酸C对照品溶液，，在“3.3”项色谱条件下测定，测得HPLC色谱图。通过与丹参川芎嗪注射液色谱图的对比，确定注射剂中含有的成分，称取已经确定的对照品成分，配制混合标准品。
3.2色谱条件的确定
3.2.1流动相梯度的确定
本实验采用甲醇作为流动相A，0.05％磷酸水溶液作为流动相B，梯度洗脱，利用二元泵控制流动相比例，实验考察了不同种洗脱梯度，详见表1。
表1不同梯度流动相洗脱梯度表
采用方法一、二、三进样时，后部分的峰分离度差，且进样时间较长；比较方法四、五、六进样时，后部分的峰得到了充分分离，进样时间缩短，并且方法五进样时，前部分分离度也好，峰面积积分准确。故本实验采用方法五的梯度。
3.2.2进样量的确定
取同一供试品溶液分别进样5μl、10μl及20μl，记录其色谱图，经果比较5μl进样时，其色谱峰响应值较低；20μl进样时，盐酸川芎嗪峰峰高远远高于其他峰；10μl进样时响应值较好，故选择10μl作为进样量。
3.2.3检测波长的确定
实验中用到的丹参川芎嗪注射液是由丹参提取液经稀释后，加入盐酸川芎嗪而制成的，因此盐酸川芎嗪的含量要远远大于注射剂中其他化学成分的含量。因此一般的检测波长不能同时有效的反应盐酸川芎嗪和其他化学成分的信息，所以本实验在相同的流动相梯度下，选用285nm、270nm、260nm、254nm等不同的波长进行检测。结果表明，在285nm时，盐酸川芎嗪峰的峰高远远高于其他峰，与其他峰比例失调，不能全面地反应注射液的成分信息；在270、260nm时，虽然盐酸川芎嗪峰的峰高虽然有所下降但不是很明显并且峰宽增加，依然不能较全面的反应注射液的成分信息；在254nm时，盐酸川芎嗪峰与其他峰的比例适宜，峰宽适中。故选择254nm为检测波长。
3.2.4柱温的确定
在其他色谱条件一致的情况下，对其柱温进行考察，设定柱温分别为25℃、30℃、35℃对其色谱图结果进行分析，结果表明，柱温30℃时，色谱峰基线平稳、分离度较好、响应值较好，适合指纹图谱研究。
3.3指纹图谱共有峰的选择
在实际运用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”处理HPLC色谱谱图数据时发现，通过设置共有峰的时间窗的数值可以改变共有峰的数目。时间窗的数值设置的越大，共有峰之间允许的时间误差就越大，共有峰的数目就越多；反之，时间窗的数值设置的越小，共有峰之间允许的时间误差就越小，共有峰的数目就越少；处理数据中，当时间窗设置为0.1分钟以上时，共有12个共有峰，相似度均为100％；当时间窗设置为0.9668分钟时，共有8个共有峰，相似度可达99.9％；当时间窗设置为0.9668分钟以下时，共有7个共有峰，但相似度下降到60％以下；处理数据本着严谨的原则，尽量降低共有峰之间允许的时间误差，故实际中，采用8个共有峰，相似度为99.9％。
3.4结论
通过选择，选定如下色谱条件为丹参川芎嗪注射液指纹图谱的测定色谱条件：色谱条件为，
色谱柱：华谱Unitary系列C18色谱柱，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱直径为4.6mm，长度为250mm，填料的粒径为5μm；
以甲醇为流动相A，0.05％磷酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱，采用二元泵控制流动相比例。
0到17分钟，甲醇的比例为20％，0.05％磷酸水溶液的比例为80％；
17到23分钟，甲醇的比例由20％均匀上升到27％，0.05％磷酸水溶液的比例由80％均匀下降到73％；
23到50分钟，甲醇的比例由27％均匀上升到45％，0.05％磷酸水溶液的比例由73％均匀下降到55％；
50到80分钟，甲醇的比例由45％均匀上升到65％，0.05％磷酸水溶液的比例由55％均匀下降到35％；
80到90分钟，甲醇的比例由65％均匀上升到100％，0.05％磷酸水溶液的比例由35％均匀下降到0％；
检测波长：254nm；柱温：30℃；体积流量：1.0ml/min。
4.方法学考察
4.1精密度实验
取同一批次丹参川芎嗪注射液供试品溶液(批号：20170205)，在“3.4”项色谱条件下测定，连续进样5次，测得HPLC色谱图。3号峰为盐酸川芎嗪峰，其为后添加入注射液的化学单体，出峰时间和峰面积相对稳定，故将3号峰设定为参照峰，计算各共有色谱峰的相对保留时间及相对峰面积，各共有峰相对保留时间RSD值在0.02％～0.20％之间，各共有峰相对峰面积RSD值在0.00％～0.02％之间，详见表2和表3。将五批色谱图导入国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”，对其相似度进行考察，相似度可达0.999，结果表明仪器的精密度良好。
表2指纹图谱精密度实验相对保留时间数据(批号：20170205)
一 二 三 四 五 RSD％
峰1 0.5211 0.5209 0.5212 0.5212 0.5208 0.02
峰2 0.8993 0.8994 0.8999 0.8999 0.8995 0.03
峰3 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 0.00
峰4 3.1140 3.1133 3.1150 3.1156 3.1169 0.14
峰5 3.5515 3.5514 3.5524 3.5535 3.5547 0.14
峰6 4.1133 4.1125 4.1142 4.1152 4.1170 0.18
峰7 4.7356 4.7353 4.7369 4.7380 4.7398 0.18
峰8 4.7801 4.7795 4.7814 4.7825 4.7844 0.20
表3指纹图谱精密度实验相对峰面积数据(批号：20170205)
一 二 三 四 五 RSD％
峰1 0.01638 0.01635 0.01622 0.01631 0.01624 0.00
峰2 0.04983 0.04962 0.04991 0.04989 0.04997 0.01
峰3 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 0.00
峰4 0.02959 0.02941 0.02961 0.02983 0.02958 0.01
峰5 0.03308 0.03362 0.03365 0.03360 0.03361 0.02
峰6 0.01623 0.01621 0.01616 0.01611 0.01611 0.01
峰7 0.00973 0.00959 0.00970 0.00962 0.00957 0.01
峰8 0.02557 0.02528 0.02537 0.02547 0.02536 0.01
4.2稳定性实验
现配同一批次丹参川芎嗪注射液供试品溶液(批号：20170205)，在“3.4”项色谱条件下测定，分别在2、4、6、12、24h进样，测得HPLC色谱图。3号峰为盐酸川芎嗪峰，其为后添加入注射液的化学单体，出峰时间和峰面积相对稳定，故将3号峰设定为参照峰，计算各共有色谱峰的相对保留时间及相对峰面积，各共有峰相对保留时间RSD值在0.09％～0.90％之间，各共有峰相对峰面积RSD值在0.01％～0.31％之间，详见表4和表5。将五批色谱图导入国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”，对其相似度进行考察，相似度可达0.999，结果表明供试品在24h内稳定。
表4指纹图谱稳定性实验相对保留时间数据(批号：20170205)
2时 4时 6时 12时 24时 RSD％
峰1 0.4964 0.4967 0.4983 0.4983 0.4982 0.09
峰2 0.8566 0.8582 0.8602 0.8599 0.8598 0.15
峰3 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 0.00
峰4 2.9748 2.9854 2.9825 2.9883 2.9924 0.66
峰5 3.3967 3.4079 3.4038 3.4100 3.4159 0.71
峰6 3.9353 3.9464 3.9408 3.9485 3.9572 0.83
峰7 4.5359 4.5480 4.5403 4.5492 4.5594 0.90
峰8 4.5783 4.5908 4.5831 4.5921 4.6017 0.90
表5指纹图谱稳定性实验相对峰面积据(批号：20170205)
2时 4时 6时 12时 24时 RSD％
峰1 0.01759 0.01746 0.01744 0.01721 0.01669 0.04
峰2 0.03996 0.04170 0.4284 0.04494 0.04799 0.30
峰3 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 0
峰4 0.02945 0.02960 0.02963 0.02951 0.02895 0.03
峰5 0.03476 0.03426 0.03442 0.03451 0.03344 0.05
峰6 0.01640 0.01630 0.01672 0.01628 0.01630 0.01
峰7 0.00935 0.00930 0.00942 0.00942 0.00913 0.01
峰8 0.02498 0.02514 0.02511 0.02508 0.02480 0.01
4.3重现性实验
取同一批次丹参川芎嗪注射液(批号：20170205)，按照“2.2”项下的方法制备五批供试品溶液，在“3.4”项色谱条件下测定，连续进样5次，测得HPLC色谱图。3号峰为盐酸川芎嗪峰，其为后添加入注射液的化学单体，出峰时间和峰面积相对稳定，故将3号峰设定为参照峰，计算各共有色谱峰的相对保留时间及相对峰面积，各共有峰相对保留时间RSD值在0.05％～1.36％之间，各共有峰相对峰面积RSD值在0.05％～0.43％之间，详见表6和表7。将四批色谱图导入国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”，对其相似度进行考察，相似度可达0.999，结果表明方法重复性良好。
表6指纹图谱重现性实验相对保留时间数据(批号：20170205)
一 二 三 四 五 RSD％
峰1 0.5020 0.5024 0.5033 0.5027 0.5020 0.05
峰2 0.8664 0.8676 0.8686 0.8680 0.8669 0.09
峰3 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 0.00
峰4 3.0198 3.0228 3.0255 3.0190 3.0161 0.36
峰5 3.8066 3.8079 3.8109 3.8029 3.8001 0.42
峰6 3.9983 3.9991 4.0020 3.9943 3.9906 0.44
峰7 4.6107 4.6102 4.6133 4.6058 4.6000 0.52
峰8 4.6541 4.6535 4.6566 4.6494 4.6430 0.53
表7指纹图谱重现性实验相对峰面积数据(批号：20170205)
一 二 三 四 五 RSD％
峰1 0.01085 0.00945 0.00918 0.00939 0.00940 0.07
峰2 0.05680 0.04962 0.04918 0.05764 0.04950 0.43
峰3 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 0.00
峰4 0.03170 0.02655 0.02623 0.02663 0.02649 0.23
峰5 0.04698 0.04139 0.04091 0.04141 0.04125 0.26
峰6 0.01710 0.01534 0.01530 0.01535 0.01517 0.08
峰7 0.00933 0.00813 0.00804 0.00819 0.00824 0.05
峰8 0.02668 0.02337 0.02327 0.02319 0.02343 0.15
5丹参川芎嗪注射液指纹图谱的建立及共有峰的归属
5.1指纹图谱的建立
按如下方法建立丹参川芎嗪注射指纹图谱
取十批不同批号的丹参川芎嗪注射液，按照“2.1”项下的方法制备十批丹参川芎嗪样品溶液，在“3.4”项下确定的色谱条件进行测定，连续进样10次，测得HPLC色谱图。将测得的十批丹参川芎嗪注射液的HPLC谱图导入国家药典委员会“中药指纹图谱相似度评价系统”(2004A版)，设定S1为参照谱图，经过谱峰多点校正后生成共有模式的对照指纹谱图，各批次样品的指纹图谱与对照指纹图谱的相似度结果见表8。生成丹参川芎嗪注射液供试品的色谱图见图1，丹参川芎嗪注射液供试品的对照指纹图谱见图2，丹参川芎嗪注射液供试品的指纹图谱检测图谱见图3。
表8丹参川芎嗪注射液相似度评价
以对照指纹图谱作为参考，由表可知，不同批次的丹参川芎嗪注射液样品的指纹图谱的相似度值非常高，均能达到0.999，说明丹参川芎嗪注射液的质量一致性非常好。5.2峰的确认
根据已确认的8个共有峰，通过与混合对照品溶液色谱图的比对见图4，确认1号峰为丹参素钠、2号峰为原儿茶醛、3号峰为盐酸川芎嗪、4号峰为异阿魏酸、6号峰为迷迭香酸、7号峰为丹酚酸A。3号峰为盐酸川芎嗪峰，其为后添加入注射液的化学单体，出峰时间和峰面积相对稳定，故将3号峰设定为参照峰，分别计算指纹图谱个共有峰的相对保留时间和相对峰面积分别见表9和见表10。
表9共有指纹峰相对保留时间
表10共有指纹峰相对峰面积
由表可知，不同批次丹参川芎嗪注射液HPLC指纹图谱共有峰的相对保留时间的RSD为0.37％～2.99％，小于3％，说明了重现性很好；相对峰面积的RSD为0.03％～0.29％，小于3％，说明不同批次之间丹参川芎嗪注射液的化学成分含量差异不大，
本发明建立的HPLC指纹图谱检测方法可以对丹参川芎嗪注射液进行检测。且检测方法精密度高，稳定性好，重现性好，是一种安全可靠的检测方法。
上面描述，只是本发明的具体实施方式，举例说明不对本发明的实质内容构成限制。

Claims (5)

1.一种丹参川芎嗪注射液的HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于，包括下列步骤：
步骤1、供试品溶液的制备：
制备丹参川芎嗪注射液供试品溶液；
步骤2、混合对照品溶液的制备：
精密称取丹参素钠、原儿茶醛、盐酸川芎嗪、异阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸A对照品，混合置于5ml容量瓶中，定容作为混合对照品溶液；
步骤3、测定：
分别精密吸取丹参川芎嗪供试品溶液和混合对照品溶液，注入高效液相色谱仪，按照编辑好的洗脱梯度进行洗脱，记录色谱图；
步骤4、数据处理：
用指纹图谱软件对所得图谱进行处理，即得到丹参川芎嗪注射液指纹图谱。
2.如权利要求1所述的丹参川芎嗪注射液的HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于，步骤1中丹参川芎嗪注射液供试品溶液的制备，制备方法为：
取丹参川芎嗪注射液一支，用注射器精密量取1.0ml，置于5ml容量瓶中，用甲醇稀释并定容，混合均匀后吸取适量溶液置于高效液相色谱仪的进样瓶中备用。
3.如权利要求1所述的丹参川芎嗪注射液的HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于，步骤2中混合对照品溶液的制备方法为，精密称取丹参素钠对照品2.3mg，原儿茶醛对照品2.7mg，盐酸川芎嗪对照品2.6mg，异阿魏酸对照品1.0mg，迷迭香酸对照品1.2mg，丹酚酸A对照品2.7mg，混合置于5ml容量瓶中，加入甲醇溶解，并定容至刻度线，超声溶解摇匀，作为混合对照品溶液。
4.如权利要求1所述的丹参川芎嗪注射液的HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于，步骤3中指纹图谱的液相色谱条件为，色谱柱：华谱Unitary系列C18色谱柱，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱直径为4.6mm，长度为250mm，填料的粒径为5μm；采用二元泵控制流动相比例，以甲醇为流动相A，0.05％磷酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱，具体为：
0到17分钟，甲醇的比例为20％，0.05％磷酸水溶液的比例为80％；
17到23分钟，甲醇的比例由20％均匀上升到27％，0.05％磷酸水溶液的比例由80％均匀下降到73％；
23到50分钟，甲醇的比例由27％均匀上升到45％，0.05％磷酸水溶液的比例由73％均匀下降到55％；
50到80分钟，甲醇的比例由45％均匀上升到65％，0.05％磷酸水溶液的比例由55％均匀下降到35％；
80到90分钟，甲醇的比例由65％均匀上升到100％，0.05％磷酸水溶液的比例由35％均匀下降到0％；
检测波长：254nm；柱温：30℃；体积流量：1.0ml/min。
5.如权利要求1所述的丹参川芎嗪注射液的HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于，所述丹参川芎嗪注射液指纹图谱共有8个共有指纹峰，8个共有指纹峰中丹参素钠为1号峰、保留时间为6.439分钟，原儿茶醛为2号峰、保留时间为11.118分钟，盐酸川芎嗪为3号峰、保留时间为13.009分钟，异阿魏酸为4号峰、保留时间为38.559分钟，迷迭香酸为6号峰、保留时间为50.966分钟，丹酚酸A为7号峰、保留时间为58.715分钟。
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