CN105467051B - 大川芎片全时段多波长融合指纹图谱的质量控制方法 - Google Patents
大川芎片全时段多波长融合指纹图谱的质量控制方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了大川芎片多波长融合指纹图谱的质量控制方法，它是将现代分析检测手段和信息处理手段结合起来，建立综合、全面、有效的质量评价标准。目的在于避免大川芎片中名贵药材天麻被其单一指标性成分天麻素所替代导致的中药复方质量问题，消除单波长单一指标反映制剂质量的不完备性。本发明的质量控制方法操作简单、安全有效、重现性较好，可用于中药材及中成药的质量评价、质量控制及新药研发。特别是可将其作为评价名贵药材中药复方质量控制的有效方法。
Description
技术领域
本发明属于一种中成药的质量检测技术领域，具体是一种大川芎片全时段多波长融合指纹图谱质量控制方法。
背景技术
大川芎片由天麻、川芎两味药材组成，适用于活血化瘀，平肝熄风、主治头风及瘀血型头痛、症见头痛，脑涨，眩晕，颈项紧张不舒，上下肢及凌晨身麻木，舌部瘀斑等、大川芎片专门用于治疗各种头痛和眩晕。该方最早出自《宣明论方》卷二，方用“川芎一斤，天麻四两。上为末，炼蜜为丸。”用于“治首风，眩晕旋急，外和阳气，风寒相博，胃膈痰饮，偏正头痛，身拘倦。”川芎、天麻二药在祖国医学中有悠久的应用历史，当代中医认为，川芎辛温走窜，走而不守，既入血分，又能行气，为血中之气药；天麻甘平，专入肝经，具有平肝熄风之功效。在大川芎片中，二者合用，共奏活血化瘀、平肝熄风、镇定止痛之效。现代药理研究证实，大川芎片主要有镇静镇痛、显著改善肠系膜微循环、抗血小板释放5-HT、阻断血管内皮细胞钙通道及抗实验性脑缺血等作用。
随着科学技术的创新与进步，现代先进分析检测技术以及信息处理技术的日渐成熟，使中药分析检测水平有了显著提高，中药质量控制方法得到不断完善。大川芎片制剂组方药材成分复杂，单一波长测定不能全面、综合的评价其质量。其中的天麻又为名贵中药材，天麻素是大川芎片质量控制的指标性成分，为避免市场上将天麻素单体代替天麻药材混入到大川芎片中，因此，建立综合、全面、有效的质量评价标准具有重大的意义。中药指纹图谱是中药质量控制的有效技术手段，多波长融合技术更是提供更多的指纹图谱信息，故通过多波长融合技术手段建立指纹图谱成为中药质量控制和评价的一种发展模式，更能真实客观的反映中药材及中成药的内在质量，是一种潜移默化的从相对定量到绝对定量的提升，为中药材及中成药的质量控制和物质基础提供新的参考依据，为规范中药制剂及其合理使用奠定基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种大川芎片全时段多波长融合指纹图谱质量控制方法，该方法将现代分析检测技术和信息处理手段结合起来，为传统中成药大川芎片的质量控制提供一种全面、稳定、可靠的评估方法，利于制药企业控制中药制剂的质量，保证药物的药效稳定。
为实现本发明的目的，本发明一方面提供一种大川芎片全时段多波长融合指纹图谱的质量控制方法，包括如下顺序进行的步骤：
(1)制备供试品溶液：
取大川芎片适量，用甲醇进行加热回流提取，提取液过滤后即得供试品溶液；
(2)制备对照品溶液：
取天麻素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含天麻素对照品0.4-0.5mg的溶液，即得；
(3)色谱条件与系统适用性试验：
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；
流动相：以甲酸溶液与乙腈的混合溶液为流动相，进行梯度洗脱，其中甲酸溶液为流动相A，乙腈为流动相B；流速1.0mL·min-1；柱温30℃；检测波长210-320nm下同时进行检测；进样量10μL；理论塔板数计算，应不低于3000；
(4)全时段多波长融合：
将210-320nm波长下的谱图数据利用计算机软件进行全时段融合，得到一张能够同时反映多个波长融合后的色谱图和一组图谱数据；
(5)样品含量测定：
应用融合后的指纹图谱数据，计算样品中指标成分的含量；
(6)对上述确定的含量测定方法进行有效性评价，其中包括专属性、准确度、精密度、重复性、稳定性、线性、范围以及耐用性。
其中，步骤(1)中所述供试品溶液按照如下步骤制备而成：
取大川芎片适量，去除包衣后研细，接着精密称取样品粉末1.9-2.1g，置于100mL圆底烧瓶中，加甲醇80mL回流提取1次，提取时间为2h，然后过滤，滤液浓缩后，加甲醇定容至10mL容量瓶中，摇匀，再采用0.45μm微孔滤膜进行过滤，滤液即为供试品溶液。
特别是，优选精密称取大川芎片去除包衣后研细的粉末样品2.0g进行供试品溶液的制备。
尤其是，采用0.22μm微孔滤膜进行过滤，滤液即为供试品溶液。
特别是，步骤(1)中所述的甲醇选择无水甲醇。
其中，步骤(2)中所述天麻素对照品溶液的浓度优选为1mL溶液中含天麻素对照品0.5mg。
其中，步骤(3)中所述色谱柱选择规格为4.6mm×250mm，5μm的AglientTC-C18色谱柱；所述流动相的甲酸溶液选择体积百分比浓度为0.04％的甲酸水溶液；所述检测波长选择210、225、254、270、320nm。
特别是，步骤(3)中所述流动相梯度洗脱的技术参数为：
其中，步骤(4)中所述计算机软件为Aglient1100色谱工作站中使用Matlab软件，对210-320nm波长下的谱图数据进行所述的全时段多波长融合，获得能够同时反映多波长融合后的色谱图和一组图谱数据。
特别是，采用Aglient1100色谱工作站中使用Matlab软件，对210、225、254、270、320nm五个波长下的谱图数据进行所述的全时段多波长融合，获得能够同时反映五个波长融合后的色谱图和一组图谱数据。
特别是，上述方法用于检测提取方法相同或相近的含有大川芎片组成的任何一种剂型，又可适用于任何一种由名贵中药材组成的中药复方的质量控制。
本发明的大川芎片全时段多波长融合指纹图谱质量控制方法的有益效果如下：
(1)本发明首次公开大川芎片多波长融合指纹图谱质量控制方法，通过本方法可以全面有效、安全可靠的控制大川芎片的质量，完善大川芎片质量控制方法。
(2)本发明采用现代先进分析检测技术，可通过HPLC-MS对大川芎片中主要成分进行分析检测，获得大量关于大川芎片中化学成分的色谱和光谱信息，更能真实客观反映大川芎片的内在质量。
(3)本发明是将现代分析检测技术和信息处理手段结合起来对大川芎片进行多波长融合，克服单一波长下信息量不足的缺点，降低检测限，在不损失原有特征信息的基础上得到一张同时反映多个波长信息的色谱图及图谱数据，避免了市场上将天麻素单体代替名贵药材天麻混入到大川芎片中，影响大川芎片的治疗效果。
(4)本发明的质量控制方法，其优点是操作简便，稳定可靠，精密度高、重复性好、易于掌握，能形成全面的质量控制体系控制样品质量，解决实际生产问题。
(5)本发明所建立的大川芎片多波长融合指纹图谱色谱图可用于大川芎片的指纹定性分析和定量分析，完善了大川芎片的质量控制标准，从而确保其安全性、有效性，形成了一个均一、稳定、可控的质量控制体系，为规范中药制剂及其合理使用奠定基础。
附图说明
图1是天麻素含量测定标准曲线图。
图2是大川芎片210nm波长下HPLC指纹图谱。
图3是大川芎片225nm波长下HPLC指纹图谱。
图4是大川芎片254nm波长下HPLC指纹图谱。
图5是大川芎片270nm波长下HPLC指纹图谱。
图6是大川芎片320nm波长下HPLC指纹图谱。
图7是大川芎片多波长融合指纹图谱。
图8是天麻素对照品多波长融合指纹图谱。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步描述本发明所述大川芎片的质量检测方法，以下实施例包括了本发明的大川芎片的含量测定方法和该方法的专属性、准确度、精密度、重复性、稳定性、线性范围以及耐用性试验。这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。
Aglient液相色谱仪(G1312A二元输液泵；DAD检测器)；
色谱柱(型号：AglientTC-C18色谱柱，4.6mm×250mm×5μm，安捷伦科技有限公司)；
供试品：大川芎片样品3批(批号：20140301、20140302、20140303；棕色固体，大连富生天然药物开发有限公司生产)，其中，批号：20140301的大川芎片的含水率为2.4％；
天麻素标准品(纯度＞98％，购自中国药品生物制品检定所(简称中检所)，批号：110807-201306)；
甲酸(色谱纯，Fisher公司)；乙腈(色谱纯，Fisher公司)；纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)；其他试药均为分析纯。
试验例1
1、制备供试品溶液
取批号为20140301的大川芎片，去除包衣后，研细；精密称定大川芎片粉末2.0g，置于100mL圆底烧瓶中，加甲醇80mL，加热进行回流提取1次，提取时间为2h；然后过滤，滤液浓缩后，加甲醇定容至10mL容量瓶中，摇匀，再采用0.22μm微孔滤膜进行过滤，滤液即为供试品溶液。
2、制备对照品溶液
取天麻素标准品适量，精密称定天麻素标准品(4.802mg)，置于10ml容量瓶中，加入无水甲醇，定容，摇匀，配制成每1ml含0.4802mg天麻素对照品溶液。
3、色谱分析
3.1色谱条件及系统适用性的选择
参照2010版中国药典有关天麻素含量测定方法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的Aglient TC-C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，以体积百分比浓度为0.04％的甲酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B进行梯度洗脱，梯度洗脱的技术参数如表1所示：
表1洗脱液洗脱梯度
流速1.0mL·min-1；柱温30℃；检测波长210、225、254、270、320nm下同时进行检测；进样量10μL；理论塔板数计算，不低于3000；天麻素及其他成分的分离度均＞1.5，对称度符合要求，分离效果好，表明本发明是系统适用性好。
3.2方法学考察
3.2.1标准曲线的制备
精密吸取步骤2制备的天麻素对照品溶液3、5、10、14、18、20μL，分别进样，注入高效液相色谱仪，按色谱条件分析，测定各自峰面积，色谱条件如下：
十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的Aglient TC-C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；以体积百分比浓度为0.04％的甲酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B进行梯度洗脱[0min(2％A)→10min(2％A)→90min(24％A)]，流速1.0mL·min-1；柱温30℃；检测波长210、225、254、270、320nm下同时进行检测；理论塔板数按天麻素计算，不低于3000；
以对照品进样量X为横坐标，峰面积值Y为纵坐标，绘制标准曲线，求得回归方程：Y＝1431402.0950X+27.9316，r＝0.9994。结果表明：天麻素在1.50～10.00μg范围内与峰面积呈良好的线性关系，如图1所示。
3.2.2精密度试验
精密吸取步骤2制备的天麻素对照品溶液10μL，按色谱条件分析，连续进样6次，记录色谱峰的峰面积，测得峰面积值的RSD为1.32％(n＝6)，表明本发明方法的仪器精密度好，结果见表2，符合指纹图谱要求。
表2精密度试验结果
3.2.3稳定性试验
A)精密称取批号为20140301的去除包衣并研细后的大川芎片粉末1份(2.027g)，然后分别置于100mL圆底烧瓶中，加甲醇80mL，加热进行回流提取1次，提取时间为2h；然后过滤，滤液浓缩后，加甲醇定容至10mL容量瓶中，摇匀，再采用0.22μm微孔滤膜进行过滤，滤液即为大川芎片稳定性试验供试品溶液；
B)于0，2，4，8，12，18，24h间隔分别精密吸取上述大川芎片稳定性试验供试品溶液各10μl，分别注入高效液相色谱仪中，按照试验例1的步骤3的色谱分析条件进行测定，记录色谱峰，计算天麻素峰面积(A)，天麻素峰面积值的RSD为2.85％(n＝6)，表明大川芎片供试品溶液在24小时内稳定，结果见表3，符合指纹图谱要求。
表3稳定性试验结果
3.2.4重复性试验
A)按照表4分别精密称取批号为20140301的去除包衣并研细后的大川芎片粉末6份(每份约2.0g)，然后分别置于100mL圆底烧瓶中，加无水甲醇80mL，加热进行回流提取1次，提取时间为2h；然后过滤，滤液浓缩后，加甲醇定容至10mL容量瓶中，摇匀，再采用0.22μm微孔滤膜进行过滤，滤液即为大川芎片供试品溶液；
B)分别精密吸取上述大川芎片供试品液各10μl，分别注入高效液相色谱仪中，测定并记录色谱峰，计算大川芎片中天麻素的含量，测定的色谱条件按照实施例1步骤3的色谱分析条件，测定结果如表4所示。
表4 HPLC方法学重复性试验结果
本发明方法测定的原料药天麻素的平均含量为2.841mg/g，RSD为2.31％(n＝6)，符合要求，重复性良好。
3.2.5回收率试验
A)按照表5分别精密称取批号为20140301的去除包衣并研细后的大川芎片粉末6份(每份约1.0g)，然后分别加入天麻素对照品溶液(3.020mg/mL)1mL；
B)将6份样品分别置于100mL圆底烧瓶中，加甲醇80mL，加热进行回流提取1次，提取时间为2h；然后过滤，滤液浓缩后，加甲醇定容至10mL容量瓶中，摇匀，再采用0.22μm微孔滤膜进行过滤，滤液即为回收率-大川芎片供试品溶液；
C)分别精密吸取上述回收率-大川芎片供试品液各10μl，分别注入高效液相色谱仪中，测定并记录色谱峰，测定样品中含量，计算回收率，测定的色谱条件按照实施例1步骤3的色谱分析条件，测定结果如表5所示。
表5 HPLC方法学回收率测定试验结果
本发明方法测定的大川芎片中天麻素的平均回收率为96.51％，RSD为1.25％(n＝6)，符合要求。
实施例1批号为20140301的大川芎片中天麻素含量测定
1)取天麻素标准品适量，精密称定天麻素标准品(10mg)，置于10ml容量瓶中，加入无水甲醇，定容，摇匀，配制成每1ml含1.000mg天麻素对照品溶液。
2)取批号为20140301的大川芎片，去除包衣后，研细；精密称定大川芎片粉末2.00g，置于100mL圆底烧瓶中，加甲醇80mL，加热进行回流提取1次，提取时间为2h；然后过滤，滤液浓缩后，加甲醇定容至10mL容量瓶中，摇匀，再采用0.22μm微孔滤膜进行过滤，滤液即为供试品溶液。
3)分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，色谱条件如下：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的Aglient TC-C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，以体积百分比浓度为0.04％的甲酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B进行梯度洗脱，梯度洗脱的技术参数如下[0min(2％A)→10min(2％A)→90min(24％A)]，流速1.0mL·min-1；柱温30℃；检测波长210、225、254、270、320nm下同时进行检测；理论塔板数按天麻素计算，不低于3000；
测定天麻素对照品和大川芎片中天麻素的峰面积，根据天麻素对照品的浓度和峰面积，计算得到大川芎片样品中天麻素含量为2.841mg/g。
大川芎片在210、225、254、270、320nm下的色谱图如图2-6所示。
4)全时段多波长融合
将Aglient1100色谱工作站中210、225、254、270、320nm波长下测定的天麻素对照品、大川芎片的HPLC指纹图图谱数据，按照dif格式数据文件导出，分别使用计算机信息处理软件(Matlab软件)，对dif格式数据分别进行全时段多波长融合，得到2张能同时反映5个波长信息的色谱图和一组图谱数据，其中一张图谱为大川芎片的全时段多波长融合指纹图谱(如图7)，另一张图谱为天麻素对照品的全时段多波长融合指纹图谱(如图8)；大川芎片的指纹图谱数据如表6所示；
表6大川芎片指纹峰图谱数据
| 指纹峰序号 | 保留时间(min) | 峰高 | 峰面积 |
| 1 | 4.624 | 141.5606 | 1395.204 |
| 2 | 7.408 | 160.0981 | 3972.587 |
| 3 | 9.972 | 333.0641 | 5694.403 |
| 4 | 14.094 | 251.7991 | 8161.183 |
| 5 | 15.956 | 1152.592 | 32680.69 |
| 6 | 25.624 | 21.8215 | 466.5932 |
| 7 | 35.241 | 78.4111 | 2976.832 |
| 8 | 38.981 | 32.5222 | 1339.726 |
| 9 | 41.768 | 30.27153 | 1630.202 |
| 10 | 44.808 | 50.12417 | 1708.687 |
| 11 | 65.756 | 20.70665 | 988.4823 |
| 12 | 77.369 | 178.0491 | 8409.028 |
| 13 | 82.530 | 40.57741 | 2514.37 |
天麻素作为大川芎片指纹图谱的参照峰，对照品指纹图谱目的在于参照峰的指认及计算样品中的含量。
实施例2批号为20140302的大川芎片中天麻素含量测定
除了步骤2)中称取批号为20140302的大川芎片之外，其余与实施例1相同，测定的批号为20140302的大川芎片中天麻素含量为2.813mg/g；其中210、225、254、270、320nm下的色谱图与实施例1相同；全时段多波长融合后的指纹图谱与实施例1相同。
实施例3批号为20140303的大川芎片中天麻素含量测定
除了步骤2)中称取批号为20140303的大川芎片之外，其余与实施例1相同，测定的批号为20140303的大川芎片中天麻素含量为2.799mg/g；其中210、225、254、270、320nm下的色谱图与实施例1相同；全时段多波长融合后的指纹图谱与实施例1相同。
本发明的大川芎片全时段多波长融合指纹图谱的质量控制方法得到的指纹图谱谱图不仅可以用于大川芎片的指纹定性分析，还可以用于其它制剂(例如大川芎颗粒、胶囊、注射剂、肠溶片、咀嚼片、口服液等)的指纹定性分析。
Claims (8)
1.大川芎片全时段多波长融合指纹图谱的质量控制方法，其特征在于包括如下顺序进行的步骤：
(1)制备供试品溶液：
取大川芎片适量，用甲醇进行加热回流提取，提取液过滤后即得供试品溶液；
(2)制备对照品溶液：
取天麻素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含天麻素对照品0.4-0.5mg的溶液，即得；
(3)色谱条件与系统适用性试验：
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；
流动相：以甲酸溶液与乙腈的混合溶液为流动相，进行梯度洗脱，其中甲酸溶液为流动相A，乙腈为流动相B；流速1.0mL·min-1；柱温30℃；检测波长210-320nm下同时进行检测；进样量10μL；理论塔板数计算，应不低于3000，其中，所述流动相的甲酸溶液选择体积百分比浓度为0.04％的甲酸水溶液；所述流动相梯度洗脱的技术参数为：
(4)全时段多波长融合：
将210-320nm波长下的谱图数据利用计算机软件进行全时段融合，得到一张能够同时反映多波长融合后的色谱图和一组图谱数据；
(5)样品含量测定：
应用融合后的指纹图谱数据，计算样品中指标成分的含量；
(6)对质量控制方法进行有效性评价，其中包括专属性、准确度、精密度、重复性、稳定性、线性范围以及耐用性。
2.如权利要求1所述的大川芎片全时段多波长融合指纹图谱质量控制方法，其特征在于步骤(3)中所述色谱柱的规格为4.6mm×250mm，5μm。
3.如权利要求1或2所述的大川芎片全时段多波长融合指纹图谱质量控制方法，其特征在于步骤(3)中所述检测波长选择210、225、254、270、320nm的波长。
4.如权利要求1或2所述的大川芎片全时段多波长融合指纹图谱质量控制方法，其特征在于步骤(1)中所述供试品溶液按照如下步骤制备而成：
取大川芎片适量，去除包衣后研细，接着精密称取样品粉末1.9-2.1g，置于100mL圆底烧瓶中，加甲醇80mL回流提取1次，提取时间为2h，然后过滤，滤液浓缩后，加甲醇定容至10mL容量瓶中，摇匀，再采用0.45μm微孔滤膜进行过滤，滤液即为供试品溶液。
5.如权利要求4所述的大川芎片全时段多波长融合指纹图谱质量控制方法，其特征在于精密称取大川芎片去除包衣后研细的粉末样品2.0g进行供试品溶液的制备。
6.如权利要求1或2所述的大川芎片全时段多波长融合指纹图谱质量控制方法，其特征在于步骤(2)中所述天麻素对照品溶液的浓度为每1mL含天麻素对照品0.5mg。
7.如权利要求1或2所述的大川芎片全时段多波长融合指纹图谱质量控制方法，其特征在于步骤(4)中所述计算机软件为Aglient 1100色谱工作站中使用Matlab软件，对210-320nm波长下的谱图数据进行所述的全时段多波长融合，获得能够同时反映多波长融合后的色谱图和一组图谱数据。
8.如权利要求1或2所述的大川芎片全时段多波长融合指纹图谱质量控制方法，其特征在于：所述方法用于含有大川芎片组成的任何一种剂型。
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