CN110274970A - 融差指纹图谱的建立方法及其在益血生胶囊质控中的应用 - Google Patents

融差指纹图谱的建立方法及其在益血生胶囊质控中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种融差指纹图谱的建立方法及其在益血生胶囊质控中的应用，采用高效液相色谱法，选定m个检测波长，在所述检测波长下分别对待测样品进行检测，使待测样品中的检测成分在至少一个所述检测波长下具有较大响应值，然后选定n个扣除波长，在所述扣除波长下分别对待测样品进行检测，使待测样品中的检测成分在所述扣除波长下具有较小响应值或无吸收，同时使非检测成分在至少一个所述扣除波长下具有较大响应值；然后对所述检测波长所得色谱峰信息进行融合，并扣除由所述扣除波长所得的色谱峰信息，得到融差指纹图谱；尽可能的获取了益血生胶囊最全面、准确的特征信息，弥补了传统指纹图谱技术特征信息不全面，不准确或者噪音大的问题。

Description

融差指纹图谱的建立方法及其在益血生胶囊质控中的应用
技术领域
本发明属于中药制剂的质量检测与控制领域，具体涉及一种融差指纹图谱的建立方法及其应用，尤其在益血生胶囊的质量检测与控制中的应用。
背景技术
益血生胶囊组方为：阿胶、龟甲胶、鹿角胶、鹿血、牛髓、紫河车、鹿茸、茯苓、黄芪(密制)、白芍、当归、党参、熟地黄、白术(麸炒)、制何首乌、大枣、炒山楂、炒麦芽、炒鸡内金、知母(盐制)、大黄(酒制)、花生衣。药典记载其具有健脾补肾，生血填精的药理作用，可用于脾肾两虚，精血不足所致的面色无华、眩晕气短、体倦乏力、腰膝痠软、缺铁性贫血、慢性再生障碍性贫血见上述证候者。现代临床研究也报道了单独或联用该药能够有效治疗各类贫血、白细胞减少、以及乙型肝炎等疾病，具有较好的临床使用价值和较广的适用范围。但同时因该组方中药味较多、成分种类众多，现阶段《中国药典》对其质量检验的标准较为单一，无法较好的反映复方整体的成分信息，缺乏一种较为完善的质量控制方法。
随着科学技术的发展，现代化分析检测仪器已大范围普及，对不同实验数据信息的整合、分析处理技术也日渐成熟，为中药制剂或其他复杂成分体系的检测分析、质量控制提供了极大的便利，中药制剂质量控制方法日益完善。指纹图谱作为一种评价复杂体系样品差异、质量差异的技术手段，已经在中药制剂质量控制中得到了大范围的应用，发挥着越来越重要的作用。指纹图谱是采用色谱、光谱或波谱等分析检测手段对中药材或中成药的物质基础进行检测，形成能反应中药材和中成药质量的信息集合。虽然现阶段指纹图谱的建立方法得到了相关法律法规的认可和规范，但现阶段的指纹图谱技术仍存在一定的缺点和不足，例如由于待测体系中各物质的母核结构、侧链取代存在较大差异，导致其无法全部或多数的在同一波长下呈现其最大吸收，由此得到的指纹图谱对待测体系中的信息表达不够准确、完全。
多波长融合指纹图谱技术是一种为解决上述问题而得到的优化的指纹图谱的建立和处理方法，其通过综合多个检测波长所得的色谱峰信息，借助软件编程，对所有色谱信息进行融合，得到各时间点各检测波长下最大响应值，并将其重新绘制成一张融合色谱，这样的融合谱图能够较为准确、完整的体现待测体系中的成分信息。然而，对于某些成分组成复杂的中药制剂或者中药组合物，例如益血生胶囊中既含有动物药、植物药，又含有矿物药，共22味药材，使用现有的融合图谱时噪音较大，无法进行准确测定，这是由于该种融合图谱的原理是筛选多次检测所得的图谱上在检测范围内所有时间点所得响应信息综合分析，融合最大响应值从而最大化的体现待测物的信息，在融合过程中不仅会放大整个液相系统中的噪声，而且所得基线容易漂移，使得融合后的色谱峰信息较多，存在某些非主要检测成分的响应值过大，噪声增大，基线漂移等问题，常常不利于后续的鉴别分析和成分定量。
发明内容
为此，本发明提供了一种融差指纹图谱的建立方法及其应用，目的是为中药、中药复方或中药制剂等复杂体系的质量控制提供一种全面、稳定和可靠的评价方法。
本发明还提供了一种益血生胶囊的质量检测与控制方法，目的是为益血生胶囊的质量控制提供一种全面、稳定和可靠的评价方法。
本发明提供了一种融差指纹图谱的建立方法，包括如下步骤：
采用高效液相色谱法，选定m个检测波长，在所述检测波长下分别对待测样品进行检测，使待测样品中的检测成分在至少一个所述检测波长下具有较大响应值，然后选定n个扣除波长，在所述扣除波长下分别对待测样品进行检测，使待测样品中的检测成分在所述扣除波长下具有较小响应值或无吸收，同时使非检测成分在至少一个所述扣除波长下具有较大响应值，其中m取从1到待测样品所含成分的总个数之间的整数；n取从1到待测样品所含成分的总数一半之间的整数；然后对所述检测波长所得色谱峰信息进行融合，并扣除由所述扣除波长所得的色谱峰信息，得到融差指纹图谱。
所述较大响应值和较小响应值均为峰高响应值，所述较大响应值为占满量程的30～100％，所述较小响应值为占满量程的0～30％。
本发明还提供了一种上述所述的融差指纹图谱的建立方法在药物质量检测与控制中的应用。
所述药物为益血生胶囊。
本发明还提供了一种益血生胶囊融差指纹图谱的建立方法，包括如下步骤：
供试品溶液的制备：取益血生胶囊，去胶囊衣，加入有机溶剂提取，得供试品溶液；
对照品溶液的制备：取芍药苷对照品，加入有机溶剂制成对照品溶液；
采用高效液相色谱法测定：照高效液相色谱法测定，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲酸水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，梯度洗脱，检测波长：230-300nm；扣除波长：310-350nm；
全时段多波长融合与扣除：将检测波长下的图谱数据采用计算机软件进行全时段融合，并扣除由扣除波长所得的色谱峰信息，得到融差指纹图谱。
所述供试品溶液制备的具体方法为：取益血生胶囊，去胶囊衣，得供试品，称定重量3-10g，加入甲醇10-30ml，称定重量，超声处理10-30分钟，放冷，再称定重量，甲醇补足失重，摇匀，滤过，取滤液，即得。
在所述供试品溶液的制备过程中，所述益血生药物与甲醇的用量比为1g：3ml；
优选地，所述超声处理的时间为20分钟。
所述色谱条件与系统适用性实验为：采用高效液相色谱法测定过程为使用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以含0.05-0.2vt％甲酸的水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，进行梯度洗脱；梯度洗脱程序如下表所示：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 95 5
15 95 5
26 84 16
70 57 43
流速0.5-1.5 mL/min；柱温20-35℃；检测波长为240nm、260nm、295nm；扣除波长为316nm；进样量2-10μl。
本发明还提供了一种益血生胶囊的指纹图谱，以芍药苷为参照峰，其相对保留时间为1.00，指纹图谱中其他共有峰的相对保留时间依次为0.097±0.03、0.128±0.03、0.142±0.03、0.160±0.03、0.195±0.03、0.217±0.03、0.235±0.03、0.254±0.03、0.267±0.03、0.294±0.03、0.316±0.03、0.330±0.03、0.373±0.03、0.417±0.03、0.436±0.03、0.467±0.03、0.514±0.03、0.590±0.03、0.650±0.03、0.713±0.03、0.776±0.03、0.797±0.03、0.812±0.03、0.843±0.03、0.915±0.03、0.955±0.03、1.000±0、1.093±0.03、1.234±0.03、1.289±0.03、1.304±0.03。
以芍药苷为参照峰，其相对保留面积为1.00，指纹图谱中其他共有峰的相对峰面积依次为0.12～0.15、0.06～0.07、0.11～0.14、0.11～0.14、2.05～2.54、0.12～0.16、0.39～0.47、0.04～0.06、0.08～0.12、1.18～1.41、0.09～0.13、0.21～0.27、0.09～0.12、0.08～0.12、0.32～0.39、0.23～0.31、0.11～0.14、0.08～0.12、0.10～0.14、0.38～0.46、0.18～0.23、0.12～0.15、0.06～0.09、0.14～0.20、0.14～0.18、0.09～0.11、1、0.10～0.13、0.09～0.12、0.09～0.11、0.05～0.08。
所述全时段多波长融合与扣除的具体方法为：从高效液相色谱仪中导出240nm、260nm、295nm波长下的dif格式图谱数据，使用Metlab软件编程，对dif格式数据进行全时段多波长融合，然后扣除316nm波长下的dif格式图谱数据，得到融差指纹图谱和图谱数据。
所述益血生胶囊的质量检测与控制方法还包括定性鉴别和/或样品含量测定；所述定性鉴别为运用中药指纹图谱相似度评价软件处理图谱，使用夹角余弦法和相关系数法计算不同样品间的相似度；所述样品含量测定为测定样品中有效成分的含量；还包括专属性、准确度、精密度、重复性、稳定性、线性范围以及耐用性。
其中检测成分为：对样品中达到或者高于一定含量(响应值)的已知或未知成分进行定性定量分析的成分；非检测成分为：对样品中未达到一定含量(响应值)的已知或未知成分不进行定性定量分析的成分。
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
(1)本发明提供的融差指纹图谱的建立方法，利用现代高科技仪器，辅以信息融合处理技术，将采集到的大量色谱和光谱信息进行了“萃取”，具体为通过对同一样品在不同检测波长下的色谱峰信息等基线融合，并在此基础上扣除某一波长下色谱信息，可以全面有效的得到简洁、清晰、准确的复杂待测体系指纹图谱，实现最大限度体现主要成分同时消除非主要成分影响，很好地解决某些非检测成分占整体比例过大的问题，降低噪音，提高检测准确度，改良了常规多波长融合技术中某些色谱峰在某一波长下响应过大，影响观察和后续分析的不足，其适用于复杂体系药物，特别是药味种类及数量繁多的中药复方，例如可适用于含有众多成分的益血生胶囊，利用本发明的融差指纹图谱能够尽可能的获取了益血生胶囊最全面、准确的特征信息，弥补了传统指纹图谱技术特征信息不全面，不准确或者噪音大的问题，本方法精密度高、重现性好、稳定性高、操作简便、易于掌握。
(2)本发明提供的益血生胶囊的质量检测方法，益血生胶囊中对中成药益血生胶囊中复杂的化学成分进行分析检测，获得了大量关于益血生胶囊化学成分的信息并对其进行了优选融合，建立了一种可供参考的益血生胶囊质量控制方法，完善了益血生胶囊的质量控制体系，有效确保了益血生胶囊的安全、均一、稳定、有效、可控，保证了制剂工艺的规范化和质量一致性，精密度高、重现性好、稳定性高、操作简便、易于掌握。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
图1是实施例1中益血生胶囊供试品溶液在240nm波长(检测波长)下的色谱图；
图2是实施例1中益血生胶囊供试品溶液在260nm波长(检测波长)下的色谱图；
图3是实施例1中益血生胶囊供试品溶液在295nm波长(检测波长)下的色谱图；
图4是实施例1中益血生胶囊供试品溶液在316nm波长(扣除波长)下的色谱图；
图5是实施例1中芍药苷对照品在260nm波长下的色谱图；
图6为实施例1中益血生胶囊供试品溶液在240nm、260nm、295nm波长的融合色谱图；
图7是实施例1中益血生胶囊供试品溶液在240nm、260nm、295nm波长的融合色谱图的基础上扣除316nm所得的融差色谱图；
图8是实验例1中试验组1的供试品溶液在254nm波长下的色谱图；
图9是实验例1中对照组1的供试品溶液在254nm波长下的色谱图；
图10是实验例1中对照组2的供试品溶液在254nm波长下的色谱图；
图11是实验例2中对照组2的供试品溶液在254nm波长下的色谱图；
图12是实验例2中试验组1的供试品溶液在254nm波长下的色谱图；
图13是实验例3中益血生胶囊的供试品溶液在190-400nm波长下的3D光谱图；
图14是实验例3中益血生胶囊的供试品溶液在230nm波长下的色谱图；
图15是实验例3中益血生胶囊的供试品溶液在240nm波长下的色谱图；
图16是实验例3中益血生胶囊的供试品溶液在254nm波长下的色谱图；
图17是实验例3中益血生胶囊的供试品溶液在260nm波长下的色谱图；
图18是实验例3中益血生胶囊的供试品溶液在295nm波长下的色谱图；
图19是实验例3中益血生胶囊的供试品溶液在316nm波长下的色谱图；
图20是实验例3中益血生胶囊的供试品溶液在330nm波长下的色谱图；
图21是实验例3中益血生胶囊的供试品溶液在240nm、260nm、295nm的融合谱图；
图22是实验例4中对照组1的供试品溶液在254nm波长下的色谱图；
图23是实验例4中对照组2的供试品溶液在254nm波长下的色谱图；
图24是实验例4中试验组1的供试品溶液在254nm波长下的色谱图；
图25是实验例5中提取20min所得的供试品溶液在254nm波长下的色谱图；
图26是实验例5中提取30min所得的供试品溶液在254nm波长下的色谱图；
图27是实验例5中提取40min所得的供试品溶液在254nm波长下的色谱图；
图28是实验例6中料液比1:3所得的供试品溶液在254nm波长下的色谱图；
图29是实验例6中料液比1:5所得的供试品溶液在254nm波长下的色谱图；
图30是实验例6中料液比1:10所得的供试品溶液在254nm波长下的色谱图；
图31是实验例10中十批次益血生胶囊的融差色谱图共有模式图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明的技术特点。
1仪器与试药
仪器：Aglient高效液相色谱仪，DAD检测器；
试药：益血生胶囊由吉林三九金复康药业有限公司提供，产品批号：180802、180803、180804、180805、180806、180807、180809、180810、180814、180817。
实施例1
本实施例所述融差指纹图谱的建立方法，具体包括如下步骤：
(1)供试品溶液的制备：取益血生胶囊，去胶囊衣，混匀内容物，得供试品，精密称定5g供试品，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇15mL，密塞，称定重量，用功率为250W，频率为33KHZ超声处理25分钟，取出，放冷，再称定重量，甲醇补足失重，摇匀，0.22μm滤膜滤过，取滤液即得；
(2)对照品溶液的制备：精密称取芍药苷对照品适量，使用色谱级甲醇配制成浓度为0.536mg/mL的溶液，即得；
(3)采用高效液相色谱法测定：选用Agilent TC-C18色谱柱，规格为4.6mm×250mm，5mm；以0.1vt％甲酸的水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，进行梯度洗脱；流速1.0mL/min；柱温30℃；检测波长240nm、260nm、295nm；扣除波长316nm；在检测波长与扣除波长下同时进行检测；进样量5μL；理论塔板数计算，应不低于3000，梯度洗脱程序如下表1所示：
表1梯度洗脱程序
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 95 5
15 95 5
26 84 16
70 57 43
(4)全时段多波长融合与扣除：使用安捷伦离线工作站导出240nm、260nm、295nm、316nm波长下采集到的色谱图的积分信息(即dif格式图谱数据)，用Excel软件打开dif格式文件并将内部数据另存为xls格式，使用Metlab软件编程，对240nm、260nm和295nm波长下采集的数据进行最大值筛选，多波长融合后得到一张融合色谱图，然后扣除316nm波长下所得色谱峰数据(dif格式图谱数据)，得到融差指纹图谱和图谱数据，色谱图见图1-7所示。其中，如图6所示为240nm、260nm和295nm波长融合色谱图，在3min和10min附近保留时间下的色谱峰响应值巨大，将图中其他色谱峰压缩明显，不利于进行直观观测和峰面积比例计算，影响后续分析的准确性；而融差指纹图谱(见图7)中各峰所占比例恰当，能完整直观的展示待测体系中较为全面的成分信息，所得的益血生胶囊的标准指纹图谱包括31个共有峰，各峰的相对保留时间和相对峰面积见下表2所示。
表2益血生胶囊的的相对保留时间和相对峰面积
实施例2
本实施例所述融差指纹图谱的建立方法，具体包括如下步骤：
(1)供试品溶液的制备：取益血生胶囊，去胶囊衣，混匀内容物，得供试品，精密称定5g供试品，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，称定重量，用功率为250W，频率为33KHZ超声处理20分钟，取出，放冷，再称定重量，甲醇补足失重，摇匀，0.22μm滤膜滤过，取滤液即得；
(2)对照品溶液的制备：精密称取芍药苷对照品适量，使用色谱级甲醇配制成浓度为0.536mg/mL的溶液，即得；
(3)采用高效液相色谱法测定：选用Agilent TC-C18色谱柱，规格为4.6mm×250mm，5mm；以0.1vt％甲酸的水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，进行梯度洗脱；流速1.0mL/min；柱温30℃；检测波长240nm、260nm、295nm；扣除波长316nm；在检测波长与扣除波长下同时进行检测；进样量5μL；理论塔板数计算，应不低于3000，梯度洗脱程序如下表3所示：
表3梯度洗脱程序
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 95 5
15 95 5
26 84 16
70 57 43
(4)全时段多波长融合与扣除：使用安捷伦离线工作站导出240nm、260nm、295nm、316nm波长下采集到的色谱图的积分信息(即dif格式图谱数据)，用Excel软件打开dif格式文件并将内部数据另存为xls格式，使用Metlab软件编程，对240nm、260nm和295nm波长下采集的数据进行最大值筛选，多波长融合后得到一张融合色谱图，然后扣除316nm波长下所得色谱峰数据(dif格式图谱数据)，得到融差指纹图谱和图谱数据。
实施例3
本实施例所述融差指纹图谱的建立方法，具体包括如下步骤：
(1)供试品溶液的制备：取益血生胶囊，去胶囊衣，混匀内容物，得供试品，精密称定10g供试品，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10mL，密塞，称定重量，用功率为200W，频率为30KHZ超声处理10分钟，取出，放冷，再称定重量，甲醇补足失重，摇匀，0.22μm滤膜滤过，取滤液即得；
(2)对照品溶液的制备：精密称取芍药苷对照品适量，使用色谱级甲醇配制成浓度为0.536mg/mL的溶液，即得；
(3)采用高效液相色谱法测定：选用Agilent TC-C18色谱柱，规格为4.6mm×250mm，5mm；以0.15vt％甲酸的水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，进行梯度洗脱；流速1.5mL/min；柱温35℃；检测波长240nm、260nm、295nm；扣除波长316nm；在检测波长与扣除波长下同时进行检测；进样量5μL；理论塔板数计算，应不低于3000，梯度洗脱程序如下表4所示：
表4梯度洗脱程序
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 95 5
15 95 5
26 84 16
70 57 43
(4)全时段多波长融合与扣除：使用安捷伦离线工作站导出240nm、260nm、295nm、316nm波长下采集到的色谱图的积分信息(即dif格式图谱数据)，用Excel软件打开dif格式文件并将内部数据另存为xls格式，使用Metlab软件编程，对240nm、260nm和295nm波长下采集的数据进行最大值筛选，多波长融合后得到一张融合色谱图，然后扣除316nm波长下所得色谱峰数据(dif格式图谱数据)，得到融差指纹图谱和图谱数据。
(5)样品含量测定：将对照品溶液稀释得一系列浓度的标准品溶液，分别按步骤(3)的色谱条件进样高效液相，得到芍药苷对照品浓度与峰面积的关系式和标准曲线，将供试品溶液按步骤(3)的色谱条件进样高效液相，得到供试品溶液中芍药苷的峰面积，利用标准曲线，计算益血生胶囊中芍药苷的含量。
实验例1流动相考察
取同一批次的益血生胶囊，精密称取三份，分别按照实施例1“供试品溶液的制备”项下的方法制得供试品溶液，然后分别按照如下色谱条件进样测定，色谱条件：(1)试验组1：选用Agilent TC-C18色谱柱，规格为4.6mm×250mm，5mm；以含0.1vt％甲酸的水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，进行梯度洗脱；梯度洗脱程序如下表5所示，所得谱图结果(以254nm下结果为例)见图8所示；
表5梯度洗脱程序
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 95 5
60 0 100
流速1.0mL/min；柱温30℃；检测波长为254nm；进样量5μl；理论塔板数不低于3000；(2)对照组1的色谱条件与试验组1的区别仅在于流动相不同，对照组1中选用水为流动相A，甲醇为流动相B；所得谱图结果见图9所示(3)对照组2的色谱条件与试验组1的区别仅在于流动相不同，对照组2中选用水为流动相A，乙腈为流动相C，所得谱图结果见图10所示。
结果表明，试验组1和对照组1均以甲醇作为有机相(图8和图9)，所得色谱峰分离度均优于对照组2以乙腈作为流动相的色谱图(图10)，且不会出现溶剂峰干扰现象，而且图8中以含0.1％甲酸的水溶液为流动相A，甲醇为流动相B时，基线较为平稳，分离度更好，故选择含0.1vt％甲酸的水溶液为流动相A，甲醇为流动相B。
实验例2梯度洗脱程序的考察
取同一批次的益血生胶囊，精密称取三份，分别按照实施例1“供试品溶液的制备”项下的方法制得供试品溶液，然后分别按照如下色谱条件进样，色谱条件：(1)对照组1：用Agilent TC-C18色谱柱；以含0.1vt％甲酸的水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，进行梯度洗脱；梯度洗脱程序如下表6所示：
表6梯度洗脱程序
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 95 5
60 0 100
流速1.0mL/min；柱温30℃；检测波长为254nm；进样量5μl；理论塔板数不低于3000；结果(以254nm下结果为例)见图8所示；(2)对照组2的色谱条件与对照组1的区别仅在于梯度洗脱程序不同，对照组2的梯度洗脱程序如下表7所示，结果见图11所示；
表7梯度洗脱程序
(3)试验组1的色谱条件与对照组1的区别仅在于梯度洗脱程序不同，对照组2的梯度洗脱程序如下表8所示，结果见图12所示；
表8梯度洗脱程序
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 95 5
15 95 5
28 84 16
70 57 43
结果见图8、图11和图12所示。结果表明，与对照组1和2相比，试验组1条件下所分离出色谱峰数量较多，分离度较好，基线相对平稳。
实验例3检测波长的考察
取同一批次的益血生胶囊，分别按照实施例1“供试品溶液的制备”项下的方法制得供试品溶液，然后分别按照实施例1中“采用高效液相色谱法测定”项下方法进样测定，区别仅在于检测波长不同。
通过查阅2015版中国药典以及相关文献，处方中具有紫外吸收的主要药材及规定的含量测定成分依次为：处方(芍药苷)、阿胶(L-羟脯氨酸)、白芍(芍药苷)、熟地黄(毛蕊花糖苷)、龟甲胶(L-羟脯氨酸)、当归(阿魏酸)、知母(芒果苷)、鹿角胶(L-羟脯氨酸)、黄芪(毛蕊异黄酮葡萄糖苷)、制何首乌、大黄(芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚)。其中芍药苷在230nm波长附近有最大吸收，L-羟脯氨酸、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚在254nm波长附近有最大吸收，芒果苷在258nm波长附近有最大吸收，毛蕊异黄酮葡萄糖苷在260nm波长附近有最大吸收，阿魏酸在316nm波长附近有最大吸收，毛蕊花糖苷在334nm波长附近有最大吸收。
结合DAD检测器对益血生胶囊色谱图进行紫外全波长(190-400nm)扫描(3D光谱图见图13)，通过综合比较230nm、240nm、254nm、260nm、295nm、316nm、330nm各波长下色谱图(分别见图14～20)，优选融合波长及切除波长。230nm波长下部分成分响应较高，但图谱整体基线漂移严重；240nm、254nm与260nm波长下的检测结果相近，峰数量较多，能够较全面的体现益血生胶囊的组成成分；综合光谱吸收图分析，295nm处各峰的吸收较为平均，能同时得到更多峰的数据，为此进行了295nm波长的色谱分析，发现其基线平稳，部分峰的峰高和分离度优于其他波长；故综合各图谱情况，选取240nm、260nm、295nm三个波长进行融合，融合图谱见图21所示。316nm和330nm下，虽然峰数量较少，其前端处，有一大峰，占总峰面积较大，影响其他峰，330nm下芍药苷峰面积较高，因此，选择切除316nm波长，在保证色谱峰数目的同时，使色谱峰面积更为均一，使之达到指纹图谱技术要求。
实验例4提取溶剂的考察
取同一批次的益血生胶囊，精密称取三份，分别按照实施例1“供试品溶液的制备”项下的方法制得供试品溶液，区别仅在于提取溶剂的种类不同，试验组1用甲醇进行超声提取，对照组1使用乙酸乙酯进行超声提取，对照组2使用乙腈进行超声提取，制得供试品溶液后分别按照实施例1中“采用高效液相色谱法测定”进样测定，区别仅在于三份的检测波长均为254nm。
实验结果(以254nm下结果为例)见图22～图24分别为对照组1、对照组2和试验组1的谱图，结果显示以甲醇为提取溶剂所提出的成分最多，故选择甲醇制备供试品溶液。
实验例5提取时间的考察
取益血生胶囊，去胶囊衣，收集并混匀胶囊内容物，精密称定三份，每份5g，分别置25mL具塞锥形瓶中，精密吸取甲醇25mL，密塞，称定重量，在功率200W，频率40kHZ下分别超声提取20、30、40min，取出，放冷，再称定重量，甲醇补足失重，摇匀，0.22μm滤膜滤过，即得。按照实施例1中“采用高效液相色谱法测定”进样测定，区别仅在于三份的检测波长均为254nm，分析检测得到色谱图。结果(以检测波长为254nm下结果为例)见图25～图27，分别为提取20、30、40min得到的谱图，结果显示，提取20min与提取30、40min相比，色谱峰数量与响应值基本一致，且提取时间越长其前端溶剂峰的响应越大，其占总峰面积的比例越大，不符合指纹图谱技术要求，故最终选择超声提取时间为20min。
实验例6提取液料比的考察
取益血生胶囊，去胶囊衣，收集并混匀胶囊内容物，精密称定三份，每份5g，分别按液料比1:3、1:5、1:10，吸取甲醇置25mL具塞锥形瓶中，密塞，称定重量，在功率200W，频率40kHZ下分别超声提取20分钟，取出，放冷，再称定重量，甲醇补足失重，摇匀，0.22μm滤膜滤过，即得。按实施例1中“采用高效液相色谱法测定”项下色谱条件注入液相色谱仪，区别仅在于三份的检测波长均为254nm，分析检测得到色谱图。结果(以254nm下结果为例)见图28～图30，料液比1:3较1:5、1:10色谱峰多且信号强，故最终选择料液比1:3进行分析。
实验例7指纹图谱建立的方法学验证
精密度考察
取同一批次的益血生胶囊，按照实施例1“供试品溶液的制备”项下的方法制得供试品溶液，按照实施例1中的“采用高效液相色谱法测定”和“全时段多波长融合与扣除”项下方法，精密吸取供试品溶液，连续进样6次，结果以27号峰芍药苷为参照，相对保留时间及相对峰面积结果见表9，10所示。
表9益血生胶囊指纹图谱精密度考察相对保留时间表(n＝6)
编号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 平均值 RSD(％)
1 0.1286 0.1289 0.1288 0.1288 0.1288 0.1287 0.1288 0.08
2 0.1426 0.1431 0.1430 0.1430 0.1429 0.1428 0.1429 0.12
3 0.1614 0.1617 0.1617 0.1617 0.1616 0.1615 0.1616 0.08
4 0.1956 0.1961 0.1961 0.1959 0.1959 0.1958 0.1959 0.10
5 0.2184 0.2192 0.2193 0.2188 0.2187 0.2188 0.2189 0.15
6 0.2373 0.2376 0.2378 0.2374 0.2370 0.2370 0.2373 0.13
7 0.2566 0.2569 0.2570 0.2568 0.2564 0.2567 0.2567 0.09
8 0.2689 0.2693 0.2694 0.2691 0.2687 0.2691 0.2691 0.09
9 0.2965 0.2970 0.2971 0.2966 0.2963 0.2967 0.2967 0.10
10 0.3187 0.3191 0.3193 0.3188 0.3184 0.3188 0.3189 0.10
11 0.3338 0.3344 0.3345 0.3339 0.3334 0.3337 0.3340 0.12
12 0.3765 0.3767 0.3769 0.3763 0.3759 0.3762 0.3764 0.10
13 0.4212 0.4215 0.4219 0.4211 0.4206 0.4209 0.4212 0.11
14 0.4397 0.4398 0.4403 0.4396 0.4392 0.4396 0.4397 0.09
15 0.4700 0.4700 0.4705 0.4698 0.4693 0.4698 0.4699 0.08
16 0.4860 0.4858 0.4862 0.4856 0.4850 0.4856 0.4857 0.08
17 0.5150 0.5151 0.5154 0.5151 0.5145 0.5150 0.5150 0.06
18 0.5540 0.5540 0.5545 0.5539 0.5535 0.5539 0.5540 0.06
19 0.6507 0.6508 0.6511 0.6509 0.6504 0.6506 0.6508 0.04
20 0.7130 0.7131 0.7133 0.7130 0.7126 0.7127 0.7130 0.04
21 0.7755 0.7755 0.7757 0.7755 0.7753 0.7754 0.7755 0.02
22 0.7979 0.7979 0.7982 0.7980 0.7977 0.7978 0.7979 0.02
23 0.8427 0.8429 0.8430 0.8427 0.8425 0.8426 0.8427 0.02
24 0.8933 0.8935 0.8935 0.8936 0.8936 0.8936 0.8935 0.01
25 0.9153 0.9154 0.9154 0.9153 0.9152 0.9153 0.9153 0.01
26 0.9556 0.9557 0.9557 0.9556 0.9554 0.9554 0.9556 0.01
27 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 0.00
28 1.0900 1.0897 1.0900 1.0895 1.0892 1.0892 1.0896 0.03
29 1.2341 1.2339 1.2340 1.2341 1.2341 1.2345 1.2341 0.02
30 1.2893 1.2890 1.2892 1.2892 1.2892 1.2897 1.2893 0.02
31 1.3045 1.3042 1.3043 1.3045 1.3045 1.3050 1.3045 0.02
表10益血生胶囊指纹图谱精密度考察相对峰面积表(n＝6)
编号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 平均值 RSD(％)
1 0.0937 0.0940 0.0878 0.0937 0.0901 0.0887 0.0914 3.09
2 0.0625 0.0618 0.0590 0.0637 0.0597 0.0634 0.0617 3.13
3 0.1095 0.1149 0.1087 0.1146 0.1106 0.1097 0.1113 2.42
4 3.1459 3.1962 3.0611 3.2364 3.1636 3.1734 3.1628 1.86
5 0.6374 0.6434 0.6267 0.6516 0.6382 0.6375 0.6391 1.28
6 0.4860 0.4831 0.4531 0.4836 0.4653 0.4278 0.4665 4.92
7 0.1762 0.1818 0.1785 0.1890 0.1786 0.1791 0.1805 2.50
8 0.1378 0.1378 0.1449 0.1373 0.1370 0.1371 0.1386 2.22
9 1.6755 1.7000 1.6310 1.7164 1.6787 1.6834 1.6808 1.71
10 0.3829 0.3951 0.3732 0.4010 0.3854 0.3864 0.3873 2.51
11 0.4512 0.5096 0.4860 0.4909 0.4810 0.4808 0.4832 3.93
12 0.1476 0.1470 0.1472 0.1429 0.1420 0.1435 0.1450 1.71
13 0.1073 0.1091 0.1017 0.1115 0.1049 0.1038 0.1064 3.39
14 0.3186 0.3258 0.3059 0.3257 0.3151 0.3152 0.3177 2.36
15 0.1663 0.1692 0.1610 0.1758 0.1636 0.1663 0.1670 3.06
16 0.0892 0.0926 0.0876 0.0894 0.0886 0.0902 0.0896 1.90
17 0.0261 0.0262 0.0246 0.0264 0.0262 0.0256 0.0258 2.64
18 0.0904 0.0914 0.0894 0.0942 0.0927 0.0925 0.0918 1.90
19 0.0704 0.0723 0.0735 0.0731 0.0727 0.0725 0.0724 1.47
20 0.3398 0.3516 0.3320 0.3529 0.3400 0.3424 0.3431 2.30
21 0.1038 0.1097 0.1005 0.1112 0.1087 0.1064 0.1067 3.76
22 0.0919 0.1008 0.0946 0.0987 0.0992 0.0940 0.0965 3.62
23 0.2342 0.2384 0.2258 0.2402 0.2308 0.2314 0.2334 2.27
24 0.0650 0.0691 0.0657 0.0690 0.0656 0.0674 0.0670 2.71
25 0.2177 0.2271 0.2158 0.2259 0.2175 0.2205 0.2208 2.14
26 0.1401 0.1447 0.1334 0.1456 0.1437 0.1438 0.1419 3.20
27 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 0.00
28 0.1573 0.1645 0.1520 0.1646 0.1565 0.1556 0.1584 3.22
29 0.1100 0.1209 0.1123 0.1161 0.1139 0.1150 0.1147 3.23
30 0.0936 0.0945 0.0948 0.0979 0.0963 0.0948 0.0953 1.62
31 0.1029 0.1060 0.1160 0.1019 0.1093 0.1080 0.1074 4.75
精密度考察结果显示共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为0.01％～0.15％和1.28％～4.92％，表明本方法精密度良好。
稳定性考察
按照实施例1步骤(1)项下的方法制备得供试品溶液，室温放置，分别于0、2、4、6、12、24h时按照实施例1中的“采用高效液相色谱法测定”和“全时段多波长融合与扣除”项下方法进样测定。以27号峰芍药苷为参照，相对保留时间及相对峰面积见表11和12。
表11益血生胶囊指纹图谱稳定性考察相对保留时间表(n＝6)
表12益血生胶囊指纹图谱稳定性考察相对峰面积表(n＝6)
稳定性考察结果显示共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为0.03％～2.01％和1.76％～4.84％，表明供试品溶液在24小时内稳定。
重现性考察
按照实施例1步骤(1)项下的方法制备得供试品溶液，按照实施例1中的“采用高效液相色谱法测定”和“全时段多波长融合与扣除”项下方法进样测定。以27号峰芍药苷为参照，相对保留时间及相对峰面积见表13，14。
表13益血生胶囊指纹图谱重复性考察相对保留时间表(n＝6)
编号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 平均值 RSD(％)
1 0.0971 0.0972 0.0972 0.0971 0.0972 0.0972 0.0972 0.06
2 0.1288 0.1291 0.1291 0.1289 0.1290 0.1291 0.1290 0.10
3 0.1431 0.1437 0.1435 0.1434 0.1435 0.1436 0.1435 0.15
4 0.1617 0.1623 0.1621 0.1621 0.1622 0.1621 0.1621 0.11
5 0.1958 0.1963 0.1961 0.1961 0.1961 0.1960 0.1961 0.08
6 0.2187 0.2200 0.2195 0.2199 0.2198 0.2196 0.2196 0.21
7 0.2377 0.2386 0.2383 0.2386 0.2387 0.2386 0.2384 0.16
8 0.2692 0.2697 0.2694 0.2696 0.2695 0.2694 0.2695 0.07
9 0.2970 0.2978 0.2976 0.2978 0.2978 0.2976 0.2976 0.11
10 0.3190 0.3197 0.3194 0.3196 0.3194 0.3193 0.3194 0.08
11 0.3346 0.3354 0.3353 0.3355 0.3354 0.3354 0.3353 0.11
12 0.3768 0.3775 0.3773 0.3774 0.3773 0.3773 0.3773 0.06
13 0.4400 0.4408 0.4406 0.4407 0.4405 0.4406 0.4405 0.06
14 0.4703 0.4711 0.4709 0.4710 0.4709 0.4709 0.4708 0.06
15 0.4853 0.4861 0.4858 0.4861 0.4858 0.4858 0.4858 0.06
16 0.5151 0.5156 0.5155 0.5156 0.5154 0.5153 0.5154 0.04
17 0.6218 0.6220 0.6219 0.6222 0.6222 0.6221 0.6220 0.02
18 0.6508 0.6510 0.6509 0.6513 0.6512 0.6511 0.6511 0.03
19 0.7130 0.7131 0.7130 0.7134 0.7133 0.7132 0.7132 0.02
20 0.7755 0.7756 0.7756 0.7760 0.7759 0.7758 0.7757 0.03
21 0.7981 0.7982 0.7982 0.7986 0.7986 0.7985 0.7984 0.03
22 0.8113 0.8113 0.8112 0.8116 0.8114 0.8113 0.8114 0.02
23 0.8431 0.8432 0.8432 0.8437 0.8436 0.8436 0.8434 0.03
24 0.8934 0.8933 0.8933 0.8935 0.8934 0.8933 0.8934 0.01
25 0.9156 0.9157 0.9157 0.9160 0.9159 0.9159 0.9158 0.02
26 0.9559 0.9559 0.9559 0.9562 0.9561 0.9561 0.9560 0.01
27 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 0.00
28 1.0900 1.0902 1.0903 1.0903 1.0903 1.0902 1.0902 0.01
29 1.2342 1.2340 1.2341 1.2338 1.2340 1.2338 1.2340 0.01
30 1.2895 1.2893 1.2896 1.2893 1.2896 1.2893 1.2894 0.01
31 1.3040 1.3037 1.3037 1.3034 1.3035 1.3032 1.3036 0.02
表14益血生胶囊指纹图谱重复性考察相对峰面积表(n＝6)
重复性考察结果显示，共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为0.01％～0.21％和0.37％～3.58％，表明本方法重现性良好。
实验例9指纹图谱含量测定的方法学验证
对照品溶液的制备：取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含0.20mg的对照品溶液，即得。
取益血生胶囊，去胶囊衣，收集并混匀胶囊内容物，精密称定约5g，置25mL具塞锥形瓶中，精密吸取甲醇15mL，加入锥形瓶，密塞，称定重量，超声处理(功率200W，频率40kHZ)20分钟，取出，放冷，再称定重量，甲醇补足失重，摇匀，0.22μm滤膜滤过，即得。
色谱条件：色谱柱：Agilent 5TC-C18 4.6mm×250mm，5μm色谱柱；流动相：0.1％甲酸水(A)-甲醇(B)；按表15中的规定进行梯度洗脱；流速1.0mL/min；检测波长为254nm；柱温为30℃；进样量：5μL。理论板数按芍药苷峰计算应不低于6000。
表15梯度洗脱程序
(1)线性范围
分别精密吸取对照品溶液1，3，5，10，15，20μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。以待测成分的进样量(X，μg)为横坐标，以对应峰面积(Y)为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程y＝266.87x+40.379，r＝0.9997。
(2)精密度试验
取同一批样品，按上述方法制备供试品溶液，按上述色谱条件连续进样6次，记录色谱图。结果芍药苷峰面积分别为2197.1、2223.6、2236.4、2241.5、2298.8、2284.1，RSD为1.6％，表明仪器精密度良好。
(3)稳定性试验
取同一批样品，按上述方法制备供试品溶液分别于0，2，4，6，12，24h时进样，记录色谱图。结果芍药苷峰面积分别为2699.9、2659.1、2710.3、2769.5、2675、2742.2，RSD为1.52％，表明供试品溶液在24h内稳定。
(4)重复性试验
取同一批样品，按上述方法平行制备6份供试品溶液，按上述色谱条件测定，记录色谱图。结果芍药苷含量分别为0.857、0.891、0.885、0.890、0.890、0.878mg/g，平均含量为0.882mg/g，RSD为1.5％。表明方法重复性良好。
(5)回收率试验
取已知含量的样品共6份，每份约0.25g，精密称定，分别精密加入不同量的对照品，按上述方法制备供试品溶液，按拟订色谱条件测定，记录色谱图，计算回收率。结果见下表16所示。
表16回收率实验结果
(6)样品含量测定
取10批益血生胶囊，按上述方法制备供试品溶液，按拟订色谱条件测定，记录色谱图，计算含量，结果见表17。
表17样品含量测定结果
实验例10十批益血生胶囊的相似度评价
取10批益血生胶囊(S1-S10)，分别按照实施例1中“供试品溶液的制备”项下方法，制得供试品溶液，然后分别按照如下色谱条件和实施例1中“全时段多波长融合与扣除”项下方法进样测定和处理，得到融差指纹图谱，采用国家药典颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.130723版本)”进行分析，得到10批样品指纹图谱共有模式图，见图31，并计算样品相似度，相似度分析结果见表18所示。
表18益血生胶囊10批样品相似度分析结果
S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 R
S1 1.000 0.980 0.999 0.990 0.970 0.967 0.994 0.991 0.993 0.971 0.991
S2 0.980 1.000 0.973 0.997 0.996 0.990 0.991 0.988 0.993 0.996 0.996
S3 0.999 0.973 1.000 0.985 0.963 0.963 0.989 0.986 0.989 0.964 0.987
S4 0.990 0.997 0.985 1.000 0.993 0.990 0.995 0.992 0.997 0.994 0.999
S5 0.970 0.996 0.963 0.993 1.000 0.998 0.986 0.984 0.989 1.000 0.993
S6 0.967 0.990 0.963 0.990 0.998 1.000 0.985 0.984 0.987 0.997 0.992
S7 0.994 0.991 0.989 0.995 0.986 0.985 1.000 0.999 0.998 0.986 0.998
S8 0.991 0.988 0.986 0.992 0.984 0.984 0.999 1.000 0.996 0.984 0.996
S9 0.993 0.993 0.989 0.997 0.989 0.987 0.998 0.996 1.000 0.989 0.999
S10 0.971 0.996 0.964 0.994 1.000 0.997 0.986 0.984 0.989 1.000 0.993
R 0.991 0.996 0.987 0.999 0.993 0.992 0.998 0.996 0.999 0.993 1.000
以上实验结果显示，10批次益血生胶囊指纹图谱与对照指纹图谱比较相似度分别为0.991、0.996、0.987、0.999、0.993、0.992、0.998、0.996、0.999、0.993。结果表明，10批次益血生胶囊相似性良好，质量稳定。
以上所述实施例仅举例表达本发明的一种实施方式，其描述较具体详细，但并不能因此而理解为对本发明专利应用范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，或是将该种方法应用到不同中药、中药制剂或其他复杂体系的质量控制当中，这些都属本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种融差指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：
采用高效液相色谱法，选定m个检测波长，在所述检测波长下分别对待测样品进行检测，使待测样品中的检测成分在至少一个所述检测波长下具有较大响应值，然后选定n个扣除波长，在所述扣除波长下分别对待测样品进行检测，使待测样品中的检测成分在所述扣除波长下具有较小响应值或无吸收，同时使非检测成分在至少一个所述扣除波长下具有较大响应值，其中m取从1到待测样品所含成分的总个数之间的整数；n取从1到待测样品所含成分的总数一半之间的整数；然后对所述检测波长所得色谱峰信息进行融合，并扣除由所述扣除波长所得的色谱峰信息，得到融差指纹图谱。
2.根据权利要求1所述的融差指纹图谱的建立方法，其特征在于，
所述较大响应值和较小响应值均为峰高响应值，所述较大响应值为占满量程的30～100％，所述较小响应值为占满量程的0～30％。
3.权利要求1或2所述的融差指纹图谱的建立方法在药物质量检测与控制中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物为益血生胶囊。
5.一种益血生胶囊的融差指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：
供试品溶液的制备：取益血生胶囊，去胶囊衣，加入有机溶剂提取，得供试品溶液；
对照品溶液的制备：取芍药苷对照品，加入有机溶剂制成对照品溶液；
采用高效液相色谱法测定：照高效液相色谱法测定，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲酸水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，梯度洗脱，检测波长：230-300nm；扣除波长：310-350nm；
全时段多波长融合与扣除：将检测波长下的图谱数据采用计算机软件进行全时段融合，并扣除由扣除波长所得的色谱峰信息，得到融差指纹图谱。
6.根据权利要5所述的益血生胶囊的融差指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述供试品溶液制备的具体方法为：取益血生胶囊，去胶囊衣，得供试品，称定重量3-10g，加入甲醇10-30ml，称定重量，超声处理10-30分钟，放冷，再称定重量，甲醇补足失重，摇匀，滤过，取滤液，即得。
7.根据权利要5或6所述的益血生胶囊的融差指纹图谱的建立方法，其特征在于，在所述供试品溶液的制备过程中，所述供试品与甲醇的用量比为1g：3ml；所述超声处理的时间为20分钟。
8.根据权利要求5-7中任一所述的益血生胶囊的融差指纹图谱的建立方法，其特征在于，采用高效液相色谱法测定过程为使用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以含0.05-0.2vt％甲酸的水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，进行梯度洗脱；梯度洗脱程序如下表所示：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％) 0 95 5 15 95 5 26 84 16 70 57 43
流速0.5-1.5mL/min；柱温20-35℃；检测波长为240nm、260nm、295nm；扣除波长为316nm；进样量2-10μl。
9.一种益血生胶囊的指纹图谱，其特征在于，以芍药苷为参照峰，其相对保留时间为1.00，指纹图谱中其他共有峰的相对保留时间依次为0.097±0.03、0.128±0.03、0.142±0.03、0.160±0.03、0.195±0.03、0.217±0.03、0.235±0.03、0.254±0.03、0.267±0.03、0.294±0.03、0.316±0.03、0.330±0.03、0.373±0.03、0.417±0.03、0.436±0.03、0.467±0.03、0.514±0.03、0.590±0.03、0.650±0.03、0.713±0.03、0.776±0.03、0.797±0.03、0.812±0.03、0.843±0.03、0.915±0.03、0.955±0.03、1.000±0、1.093±0.03、1.234±0.03、1.289±0.03、1.304±0.03。
10.根据权利要求9所述的益血生胶囊的指纹图谱，其特征在于，以芍药苷为参照峰，其相对保留面积为1.00，指纹图谱中其他共有峰的相对峰面积依次为0.12～0.15、0.06～0.07、0.11～0.14、0.11～0.14、2.05～2.54、0.12～0.16、0.39～0.47、0.04～0.06、0.08～0.12、1.18～1.41、0.09～0.13、0.21～0.27、0.09～0.12、0.08～0.12、0.32～0.39、0.23～0.31、0.11～0.14、0.08～0.12、0.10～0.14、0.38～0.46、0.18～0.23、0.12～0.15、0.06～0.09、0.14～0.20、0.14～0.18、0.09～0.11、1、0.10～0.13、0.09～0.12、0.09～0.11、0.05～0.08。
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