CN108226313A - 地黄中苷类成分的同时测定及指纹图谱构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种地黄中苷类成分的同时测定及指纹图谱构建方法。测定方法为对供试品溶液进行HPLC‑PDA检测，供试品溶液的制备为：以水超声提取生地黄或熟地黄15‑120分钟，过滤，即可；液相色谱条件如下：Waters Atlantis T3或
Description
技术领域
本发明涉及一种地黄中苷类成分的同时测定及指纹图谱构建方法。
背景技术
地黄为玄参科植物地黄(Rehmannia glutinosa Libosch.)的新鲜或干燥块根，前者习称“鲜地黄”，后者习称“生地黄”。熟地黄，则以生地黄为原料，经酒炖法或蒸法制成的加工炮制品。
国内外学者对地黄的化学成分研究显示：地黄含有多种苷类成分，其中主要含环烯醚萜及其苷类，如梓醇、二氢梓醇、桃叶珊瑚苷、益母草苷、地黄苷A/B/C/D等；苯乙醇糖苷，如洋地黄叶苷、焦地黄苯乙醇苷、毛蕊花糖苷、海胆苷、肉苁蓉苷A等。此外，还含有大量糖类，如水苏糖、棉籽糖、蔗糖等，虽然生地黄和鲜地黄所含糖类组分基本相同，但含量有明显差异。而熟地黄，则含较少量的环烯醚萜类成分，同时也富含糖类组分，有研究称其单糖组分含量较鲜地黄明显增加。且已有药理学研究证实，地黄中的环烯醚萜类及糖类成分与其生物活性密切相关，为其重要药效组分。
现有文献(曹建军，地黄基于HPLC指纹图谱的质量评价及种质资源利用研究，西北农林科技大学，2012博士论文)中公开的生地黄指纹图谱的制备方法以甲醇为提取溶剂，为有毒溶剂；提取时间较长，过程繁琐，提取溶液首先需要冷浸过夜，还需要再超声90分钟，更复杂的一步是，提取液还需减压浓缩后，残渣再用15％甲醇溶解，定容至5ml制备而成。而且，仅涉及地黄中梓醇、5-HMF(5-羟甲基糠醛)和麦角甾苷这三种成分的测定，其中梓醇属于环烯醚萜苷类物质，麦角甾苷属于苯乙醇苷类物质。而且，该现有文献的指纹图谱色谱条件，建立的方法较局限，熟地黄指纹图谱方法色谱方法与生地黄不同，仅用于鲜地黄及生地黄指纹图谱的研究。
发明内容
本发明旨在解决的技术问题在于克服现有技术中的地黄中指纹图谱的构建过程中制备供试品溶液所用溶剂毒性大、提取时间较长，过程繁琐的缺陷，而提供了一种地黄中苷类成分的同时测定及指纹图谱构建方法。
本发明提供了一种地黄中苷类成分的同时测定方法，所述测定方法为对供试品溶液进行HPLC-PDA检测，所述供试品溶液的制备方法包括如下步骤：以水超声提取生地黄或熟地黄15-120分钟，过滤，即可；
液相色谱的检测条件如下：色谱柱为Waters Atlantis T3或 HSS T3色谱柱，流动相A为0.02％-0.1％的磷酸溶液，所述百分比为体积百分比，流动相B为乙腈，洗脱梯度如下：
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0～10 | 100 | 0 |
| 10～25 | 100→98 | 0→2 |
| 25～35 | 98→95 | 2→5 |
| 35～80 | 95→75 | 5→25 |
| 80～90 | 75→70 | 25→30 |
| 90～100 | 70→45 | 30→55 |
| 100～105 | 45→0 | 55→100 |
检测波长为203nm，柱温为30℃～40℃，流速为1.0ml/min；
所述测定方法使用的检测器为PDA检测器。
本发明中，所述的水较佳地为超纯水。
本发明中，所述的过滤较佳地为使用0.45μm滤膜过滤。
本发明中，所述的柱温较佳地为35℃。
本发明中，所述苷类成分为本领域常规的环烯醚萜苷类、苯乙醇苷类以及核苷类成分等，具体包括梓醇、尿苷、腺苷、地黄苷D、地黄苷A、益母草苷、肉苁蓉苷A、毛蕊花糖苷等几种具体苷类成分。
本发明还提供了一种地黄指纹图谱的构建方法，其包括如下步骤，采用上述测定方法检测地黄，再采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件，模拟生成地黄指纹图谱。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明中供试品溶液的制备过程中，提取方法简单，提取溶剂安全、环保，提取时间短，效率更高，采用本发明的色谱柱对水提取液进行检测，并没有造成色谱柱的损伤，同时以该方法得到的供试品建立的指纹图谱更能反映传统中药以水煎液入药的化学成分。
本发明建立的地黄药材HPLC-PDA指纹图谱检测方法，能从苷类成分方面反映地黄的质量，该方法对生地黄化学成分极性大的成分的分离度更好，对生地黄多个苷类成分进行了指认，可以用于生地黄、熟地黄的鉴别，也可以作为质量控制方法，及生地黄、熟地黄配方颗粒的指纹图谱质量控制研究依据。
附图说明
图1为实施例1的HPLC色谱图。
图2为实施例1、实施例4、实施例5对应的不同柱温下的地黄的HPLC色谱图。
图3为对比实施例1中不同波长下的地黄的HPLC色谱图。
图4为由中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版生成的生地黄药材HPLC对照指纹图谱。
图5为地黄药材指纹图谱共有峰7、8、12、13、14、23的指认。
图6为地黄药材指纹图谱共有峰6的指认。
图7为地黄药材指纹图谱共有峰22的指认。
图8为自购不同批次生地黄与熟地黄药材与对照指纹图谱的匹配结果。
图9为对比实施例3与按照实施例1的液相色谱条件得到的色谱图的比较图。
图10为按照对照指纹图谱进行5批地黄颗粒指纹相似度检验的结果。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
下述实施例、对比实施例和效果实施例中，都按照高效液相色谱法(2015年版《中国药典》通则0512)测定，仪器与试剂为：
Waters ACQUITY ARC高效液相色谱仪(包括Quaternary Solvent Manager-R、2998PDADetector、Sample Manager FTN-R、Empower 3软件)；METTLER TOLEDO MS 105Du电子天平；KQ-250DE型医用数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版；Waters Atlantis T3色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；乙腈，色谱纯；超纯水，自制；其他试剂均为分析纯。
研究用对照品来源及批号：
腺苷，含量测定用，批号879-200001，购自中国食品药品检定研究院；
梓醇，含量测定用，批号110808-201210，购自中国食品药品检定研究院；
地黄苷D，批号81720-08-3，HPLC≥98.0％，购自上海诗丹德生物技术有限公司；
地黄苷A，批号15081402，HPLC>98.0％，购自成都普瑞法科技开发有限公司；
益母草苷，HPLC≥98.0％，购自南京康惟盛生物技术有限公司；
尿苷，批号58-96-8，HPLC≥98.0％，购自上海诗丹德生物技术有限公司；
毛蕊花糖苷，HPLC≥98％，购自南京康维盛生物技术有限公司；
肉苁蓉苷A，批号93236-42-1，HPLC≥98.0％，购自上海诗丹德生物技术有限公司；
桃叶珊瑚苷，批号479-98-1，HPLC≥98.0％及异类叶升麻苷(即异毛蕊花糖苷)，批号61303-13-7，HPLC≥98.0％，均购自上海诗丹德生物技术有限公司。
下述实施例中，用到的样品为贵州同济堂制药有限公司提供的共计22个批次的地黄药材进行试验，地黄的相关信息具体见表1。
表1 22个批次的地黄的信息
实施例1
(1)色谱条件与系统适应性试验：
以Waters Atlantis T3色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；以0.1％磷酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按表2中的规定进行梯度洗脱；柱温为35℃；流速为1.0ml/min，检测波长为203nm。理论板数按梓醇峰计算不低于7000。表2中，箭头的含义如下，以10～25分钟，流动相A的体积百分比从100→98为例，是指，流动相A的比例在10～25分钟之内，从100％降至98％。
表2实施例1的HPLC的洗脱梯度
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0～10 | 100 | 0 |
| 10～25 | 100→98 | 0→2 |
| 25～35 | 98→95 | 2→5 |
| 35～80 | 95→75 | 5→25 |
| 80～90 | 75→70 | 25→30 |
| 90～100 | 70→45 | 30→55 |
| 100～105 | 45→0 | 55→100 |
(2)参照物溶液的制备：
取梓醇、尿苷、腺苷、地黄苷D、地黄苷A、益母草苷、肉苁蓉苷A、毛蕊花糖苷对照品适量，精密称定，加流动相分别制成每1ml含100μg、50μg、100μg、100μg、20μg、100μg、100μg、100μg的溶液，即得。
(3)供试品溶液的制备：
取批号为20151001的地黄粗粉1g，精密称定，置于100ml具塞锥形瓶中，加超纯水50ml，密塞，称定重量，超声(250W，40Hz)15分钟，取出放至室温，再以超纯水补足减失的重量，摇匀，过0.45μm滤膜，取续滤液，即得。
(4)测定：
分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各25μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得，如图1。说明，35℃柱温条件下，各色谱峰形、分离度均较好，基线也较为平稳。
实施例2
本实施例中流动相中磷酸水溶液浓度为0.02％，其余参数和条件均同实施例1，得到的色谱结果中各色谱峰形、分离度与实施例1相比相差不大。
实施例3
本实施例中流动相中磷酸水溶液浓度为0.05％，其余参数和条件均同实施例1，得到的色谱结果中各色谱峰形、分离度与实施例1相比相差不大。
实施例4
本实施例中柱温为30℃，其余参数和条件均同实施例1，得到的色谱结果中各色谱峰形、分离度与实施例1相比相差不大。
实施例5
本实施例中柱温为40℃，其余参数和条件均同实施例1，得到的色谱结果中各色谱峰形、分离度与实施例1相比相差不大。实施例1、实施例4和实施例5的具体谱图结果见图2。
对比实施例1不同检测波长的效果比较
本对比实施例选取了203nm、210nm、254nm、330nm进行考察。取批号20151001的地黄药材按照实施例1的方法制备供试品溶液，不同检测波长下的HPLC图谱如图3。
结果显示：同一样品在203nm下，不仅对梓醇和毛蕊花糖苷均有较好响应，且包含的色谱峰信息最多，响应值也最高，因此，指纹图谱选择203nm作为检测波长。
对比实施例2不同流动相的效果比较
本对比实施例选取了水-乙腈、醋酸水-乙腈、磷酸水-乙腈、磷酸水-甲醇等不同流动相对同一供试品(批号为20151001的地黄)溶液进行考察，结果显示：以磷酸水-乙腈为流动相，不同色谱峰的峰形及分离度均较好，且分析时间较磷酸水-甲醇明显缩短，而且以磷酸水溶液浓度为0.1％的效果最好。
效果实施例1系统适用性试验
取一供试品溶液(批号为20151001的地黄)，以实施例1中色谱条件进样检测。
以参照物梓醇计算理论板数，均大于10000；以指纹图谱共有色谱峰中已指认组分，在高效液相色谱仪中分别自动计算色谱分离度，结果见表3。
表3色谱分离度数据
| 共有色谱峰编号 | 对应成分 | 分离度 |
| 6 | 尿苷 | - |
| 7 | 腺苷 | 4.2 |
| 8 | 梓醇 | 4.7 |
| 12 | 地黄苷D | 1.6 |
| 13 | 地黄苷A | 2.9 |
| 14 | 益母草苷 | 1.1 |
| 22 | 肉苁蓉苷A | 2.1 |
| 23 | 毛蕊花糖苷 | 2.0 |
由表3可见，指认的各色谱峰的分离度较好，可以满足指纹图谱检测的要求。
效果实施例2方法学考察
以研究确定的高效液相色谱条件和供试品溶液制备方法，对建立的指纹图谱HPLC-PDA分析方法学进行考察：精密度、样品的稳定性、方法的重复性。
(1)精密度试验
取一批地黄药材(批号为20151001的地黄)，按照实施例1的方法制备供试品溶液，连续6次进样检测，记录HPLC色谱图。以梓醇为参照峰，对HPLC图中色谱峰面积占比大于1.5％的14个峰，分别记录其相对保留时间及相对峰面积，见表4、表5。
表4精密度试验(与梓醇的相对保留时间)
表5精密度试验(与梓醇的相对峰面积比)
结果显示：以梓醇为参照，主要色谱峰的相对保留时间RSD均小于0.1％，相对峰面积比值基本小于2.08％，说明方法的精密度良好。
(2)稳定性试验
取一批地黄药材(批号为20151001的地黄)，按照实施例1的方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24h进样检测，记录HPLC图。以梓醇为参照峰，对HPLC图中色谱峰面积占比大于1.5％的14个峰，分别记录其相对保留时间及相对峰面积，见表6、表7。
表6稳定性试验(与梓醇的相对保留时间)
表7稳定性试验(与梓醇的相对峰面积比)
结果显示：以梓醇为参照，24小时内供试品溶液的主要色谱峰相对保留时间RSD均小于0.2％，相对峰面积比值除峰8(7.48％)外RSD均小于3.0％，表明供试品溶液在24小时内基本稳定。
(3)重复性试验
取同批次地黄药材6份(批号为20151001的地黄)，按照实施例1的方法制备供试品溶液，分别进样检测，记录HPLC图。以梓醇为参照峰，对HPLC图中色谱峰面积占比大于1.5％的14个峰，分别记录其相对保留时间及相对峰面积，见表8、表9。
表8重复性试验(与梓醇的相对保留时间)
表9重复性试验(与梓醇的相对峰面积比)
结果显示：以梓醇为参照，主要色谱峰的相对保留时间RSD均小于0.2％，相对峰面积比值基本小于3.0％，表明方法稳定性好。
效果实施例3地黄药材HPLC-PDA指纹图谱的构建
分别精密称取梓醇、尿苷、腺苷、地黄苷D、地黄苷A、益母草苷、肉苁蓉苷A、毛蕊花糖苷对照品适量，按照实施例1的方法制备参照物溶液；分别取22批次地黄药材，按照实施例1的方法制备相应的供试品溶液；照实施例1的色谱条件，分别吸取参照物溶液和各供试品溶液进样检测，记录HPLC图。
运用Empower 3导出色谱数据(*.AIA格式文件)，并将其导入国家药典委员会2004年颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(A版)”，进行指纹图谱匹配和相似度计算分析。
(1)共有峰的确定
由22批次地黄药材制备的供试品溶液，进样检测分析，其HPLC-PDA指纹图谱的匹配结果，显示得到26个共有峰。因“梓醇”为地黄的含量测定项，色谱峰的分离度好且峰高适中，故选择以梓醇为参照峰，各共有峰的相对保留时间见表10。
表10指纹图谱共有峰的相对保留时间
| 共有峰编号 | 相对保留时间 | 共有峰编号 | 相对保留时间 |
| 1 | 0.450 | 14 | 2.048 |
| 2 | 0.474 | 15 | 2.259 |
| 3 | 0.498 | 16 | 2.290 |
| 4 | 0.593 | 17 | 2.505 |
| 5 | 0.667 | 18 | 2.569 |
| 6 | 0.746 | 19 | 2.843 |
| 7 | 0.848 | 20 | 3.011 |
| 8 | 1.000 | 21 | 3.079 |
| 9 | 1.199 | 22 | 3.212 |
| 10 | 1.271 | 23 | 3.457 |
| 11 | 1.703 | 24 | 3.503 |
| 12 | 1.882 | 25 | 3.746 |
| 13 | 1.914 | 26 | 4.115 |
(2)指纹图谱的相似度分析
相似度是评价中药指纹图谱的一个重要参数，它是根据指纹图谱的整体相似程度来计算中药所含化学组分的整体波动程度。本试验以批号140115地黄药材的HPLC图作为参照谱，对22批次地黄药材进行指纹图谱匹配和相似度计算，具体分析结果见表11。
表11相似度分析结果
表11的结果是由国家药典委员会2004年颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(A版)”软件生成的，试验以批号140115地黄药材的HPLC图作为参照谱(即表格的参照含义)，进行匹配，得到对照谱(即表11中的对照)。
由表11可见，企业提供的不同批次各地黄药材，其HPLC-PDA指纹图谱相似度较高，均大于0.946，因此，可以作为建立地黄药材的指纹图谱使用，系统生成的地黄药材对照指纹图谱见图4。
(3)指纹图谱共有峰的指认
取批号20151001地黄药材的供试品溶液的HPLC图，分别以各参照物溶液的HPLC图进行对比，对指纹图谱中共有峰进行指认，具体见图5、图6、图7。
对26个共有峰中8个色谱峰进行了指认，分别为对照指纹图谱图4的峰6(尿苷)、峰7(腺苷)、峰8(梓醇)、峰12(地黄苷D)、峰13(地黄苷A)、峰14(益母草苷)、峰22(肉苁蓉苷A)、峰23(毛蕊花糖苷)。另外，对于图5中的异毛蕊花糖苷的色谱峰和图6中的桃叶珊瑚苷的色谱峰，并不是22批地黄都有这两个峰，所以这两个峰不是共有峰。
效果实施例4自购地黄药材的HPLC-PDA指纹图谱检测分析
采购5批次生地黄药材及4批次熟地黄药材，其来源及批号见表12。
表12自购地黄药材来源及批号
自购生地黄与熟地黄药材的HPLC-PDA指纹图谱分析：
取以上各批次自购生地黄及熟地黄药材，照实施例1中制备相应的供试品溶液；照实施例1中色谱条件，分别吸取各供试品溶液进样检测，记录HPLC图。
运用Empower 3导出色谱数据(*.AIA格式文件)，并将其导入国家药典委员会2004年颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(B版)”，以系统已经生成的地黄-R(即22批次研究药材对照)的色谱图作为参照谱，对各批次自购药材进行指纹图谱匹配和相似度计算分析，结果见图8以及表13。
表13自购不同批次生地黄和熟地黄药材与对照指纹图谱的相似度分析结果
| 批号 | 相似度 |
| R | 1.000 |
| 生地160329 | 0.908 |
| 生地160419 | 0.844 |
| 生地160426 | 0.902 |
| 生地2016012201 | 0.919 |
| 生地2016032405 | 0.801 |
| 熟地160325 | 0.727 |
| 熟地160413 | 0.681 |
| 熟地20160300805华氏 | 0.756 |
| 熟地20160300805雷允上 | 0.839 |
结果显示：自购生地黄、熟地黄药材的指纹图谱与对照指纹图谱在色谱峰上有一定的差别；其中3个批次生地黄药材(生地160329、生地160426、生地2016012201)与建立的标准(对照)指纹图谱的相似度较高，均大于0.90，另2批次生地黄药材和所有批次熟地黄药材与建立的标准指纹图谱的相似度低于0.90。
结论：建立的生地黄HPLC-PDA指纹图谱，不仅可以较好实现对生地黄药材质量的判别，而且可作为区分生地黄和熟地黄药材的特征鉴别方法。
对比实施例3
本对比实施例按照对比文件即曹建军一文的第25页2.2.4溶液制备项下的生地黄溶液制备方法，制备生地黄20151001的供试品溶液，再分别按照对比文件公开的液相方法和本申请实施例1的液相方法对样品进行检测，并对得到的色谱图进行对比，具体如下：
对比实施例的样品溶液制备：生地黄干燥粉末0.5g置于50mL容量瓶中，加甲醇定容，置于室温下冷浸过夜后用超声波提取1.5h，冷却至室温，定容，过滤，取续滤液25mL，在旋转蒸发仪上减压蒸干，残渣用15％甲醇溶解，定容至5mL。用0.45μm滤膜过滤后备用。
对比实施例的色谱条件为：采用Waters高效液相色谱仪，配备Watersl 525二元梯度泵，柱温箱，Waters sunfire C18色谱柱(4.6mm*250mm、5μm),Waters Sunfire C18保护柱(4mm*5mm)，Waters 2996二极管阵列检测器。Empower Pro色谱工作站。
色谱条件为柱温35℃。二极管阵列检测器波长范围190～400nm，进样量20μL。流动相为：A，乙腈；B，0.02％磷酸水溶液，流动相流速1mL/min。按下表14所示梯度线性梯度洗脱。
表14对比实施例中的HPLC指纹图谱洗脱梯度
图9为对比实施例3得到的色谱与本申请实施例1的液相色谱条件检测得到的色谱图的比较结果，其中上面的曲线为对比实施例3的色谱，下面的曲线为本申请实施例1色谱条件检测的色谱图。由图9可见，本申请的HPLC色谱条件较对比文件的色谱条件更有利于尿苷、腺苷、梓醇等色谱峰的分离和指认，且本申请在供试品溶液的制备方法上提取溶剂更经济和环保，提取方法也更简便。
效果实施例5
市售5批地黄颗粒指纹相似度检验
为了更好的评价不同批次地黄配方颗粒的相似程度，利用上述建立的HPLC对照指纹图谱进行评价。
按照各批次配方颗粒的标示量，取相当于1g饮片的量的配方颗粒粉末，精密称定。按按附件1确定的供试液制备方法制备各批次地黄、饮片的供试品溶液。按确定的色谱条件，记录色谱图。运用Empower 3将6批样品的HPLC色谱数据导出*.AIA格式文件，并将文件导入国家药典委员会2004年颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统B版”。色谱图进行多点校正，以地黄-HPLC-R(即22批对照)对照色谱图作为参照谱，进行指纹图谱匹配，见图10，相似度结果见表15。并利用国家药典委员会2004年颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版”考察了不同批次配方颗粒的相似度，结果见表16。
表15 5批颗粒与药材HPLC标准指纹图谱的相似度比较
表16 5批配方颗粒相似度比较
由表15可见，5批颗粒与建立的药材对照指纹图谱的相似度均在0.8以上，由表16可见，5批配方颗粒与之生成的指纹图谱相似度也较高，在0.88以上。说明提供的5批颗粒的样品均一，质量稳定。已经建立的HPLC指纹图谱方法可以作为地黄饮片配方颗粒的研究参考。
Claims (6)
1.一种地黄中苷类成分的同时测定方法，其特征在于，所述测定方法为对供试品溶液进行HPLC-PDA检测，所述供试品溶液的制备方法包括如下步骤：以水超声提取生地黄或熟地黄15-120分钟，过滤，即可；
液相色谱的检测条件如下：色谱柱为Waters Atlantis T3或 HSS T3色谱柱，流动相A为0.02％-0.1％的磷酸溶液，所述百分比为体积百分比，流动相B为乙腈，洗脱梯度如下：
检测波长为203nm，柱温为30℃～40℃，流速为1.0ml/min；
所述测定方法使用的检测器为PDA检测器。
2.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述的水为超纯水。
3.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述的过滤为使用0.45μm滤膜过滤。
4.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述的柱温为35℃。
5.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述苷类成分包括梓醇、尿苷、腺苷、地黄苷D、地黄苷A、益母草苷、肉苁蓉苷A和毛蕊花糖苷中的一种或多种。
6.一种地黄指纹图谱的构建方法，其特征在于，其包括如下步骤，所述构建方法采用如权利要求1～5任一项所述的测定方法检测地黄，再采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件，模拟生成地黄指纹图谱。
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