CN105259269B - 一种石斛特征指纹图谱的建立方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种石斛特征指纹图谱的建立方法，步骤如下：①标准样品溶液制备：取石斛，粉碎，过筛，加入甲醇超声，过滤，滤液旋蒸浓缩至干，用甲醇溶剂溶解，最后定容，摇匀，制成标准样品溶液；②对照品溶液制备：精密称取一定量异夏佛托苷，用甲醇溶解稀释，制成对照品溶液；③标准指纹图谱的测定：将标准样品溶液和对照品溶液分别注入高效液相色谱仪，以夏佛托苷色谱峰作为指纹图谱的参照峰，计算标准样品各特征峰的相对保留时间和保留峰面积，制定标准指纹图谱。本发明在构建指纹图谱的方法中对相对峰面积大于5％的指纹特征峰进行了定性，突破了以往指纹图谱的过于模糊性，对指纹图谱的主要成分进一步明确，将石斛指纹图谱的整体性和成分特异性统一起来。

Description

一种石斛特征指纹图谱的建立方法

技术领域

本发明涉及中药领域中的一种指纹图谱的建立方法，具体涉及一种石斛特征指纹图谱的建立方法。

背景技术

石斛是一种常用的滋补中药，主要为石斛属植物。石斛属植物是兰科植物中最大的一个属，包括铁皮石斛、金钗石斛、密花石斛、鼓槌石斛等多个品种。在全球范围内，约有1100多种石斛，其中在我国发现的有76种。石斛的药用历史悠久。早在古代，石斛在《神农本草经》中就被列为滋补上品，长久以来，随着时代的发展，石斛一直被人们视为珍贵的中草药，具有十分重要的滋补功效。在临床上，石斛被用于治疗多种疾病，具有增强免疫力、抗氧化、降血糖和抑制癌症等药理功效。由于人为长期无节制采挖及不合理利用石斛，其野生资源日趋减少，市场上出现了一些以假乱真、以次充好的现象。此外，由于石斛品种较多，其品种间的杂交使得其近缘的种存在性状交叉现象，分类区别比较困难。因此，有必要建立石斛的特征指纹图谱对石斛鲜品、干品的药材质量进行评价。

色谱指纹图谱是一种综合的、可量化的鉴别手段，可以判断药材的真伪、评价优劣，可以在整体和局部区分不同品种的药材、同一品种野生和种植、同一品种不同产地的药材、同一品种同一产地不同年份的药材。迄今为止，有关药用石斛HPLC指纹图谱的专利有1项(CN200810218494.5)，成金乐等对石斛中的酚类和黄酮类成分进行了HPLC指纹图谱分析。此方法适合于酚类和黄酮类这两类成分的质量控制。

目前我国对石斛的质量控制主要局限于对个别或某几类成分的质量控制，其评价方式较片面，不足以系统、完整的表明石斛药材的整体质量，急需探索更先进、更有效的质量控制手段。而HPLC特征指纹图谱建立对鉴别与控制石斛药材和含有石斛药材的复方制剂的质量具有重要意义，且建立一种能较全面的质量控制方法来尽量对石斛检测到的化学成分进行质量控制具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种石斛特征指纹图谱的建立方法，通过此建立方法可控制石斛药材的质量。采用特征色谱指纹图谱质量控制方式以分析为手段，从中获取反映药用石斛内在质量的信息，通过对指纹特征的分析比较，评价其内在质量的真实性、一致性和稳定性。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现：

一种石斛特征指纹图谱的建立方法，所述方法包括如下步骤：①标准样品溶液制备：取石斛干燥样品，用粉碎机粉碎，过筛，得石斛粉末，精密称取石斛粉末，加入75％甲醇，室温下超声30min后取出，过滤，滤液浓缩至干，用75％甲醇溶剂溶解，然后转移至容量瓶中定容，摇匀，以0.45μm微孔滤膜过滤，即得标准样品溶液；②对照品溶液制备：精密称取夏佛托苷作为对照品，用75％甲醇(V水：V甲醇＝25:75)溶解稀释，制备成浓度为16.4μg/ml夏佛托苷溶液即为对照品溶液；③标准指纹图谱的测定：分别精密吸取标准样品溶液和对照品溶液，分别注入高效液相色谱仪进行测定，以对照品夏佛托苷色谱峰作为指纹图谱的参照峰，计算标准样品各特征峰的相对保留时间和保留峰面积，制定得到标准指纹图谱。

进一步地，步骤①中所述标准样品溶液制备的具体过程为：取石斛干燥样品，用粉碎机粉碎，过筛，得石斛粉末，精密称取石斛粉末1.000g，置于100ml锥形瓶中，加入50mL75％甲醇(V水：V甲醇＝25:75)，室温下超声30min后取出，过滤，滤液旋蒸浓缩至干，用75％甲醇溶剂(V水：V甲醇＝25:75)溶解，然后转移至5ml容量瓶中定容，摇匀，以0.45μm微孔滤膜过滤，即得标准样品溶液。

进一步地，所述精密称取石斛粉末的称量误差不能超过0.2％。

进一步地，所述过筛为过孔径0.335mm的筛，可以为孔径0.335mm的药典筛。

进一步地，步骤①中所述的石斛为铁皮石斛、霍山石斛、兜唇石斛、齿瓣石斛、金钗石斛、叠鞘石斛、鼓槌石斛、环草石斛、流苏石斛中的任意一种。

进一步地，步骤③中采用高效液相色谱仪进行测定的色谱条件与系统适用性实验为：色谱柱：Alltima C18色谱柱(250mm×4.6mm，5um)；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；进样量：20ul；检测波长：280nm，参比波长500nm；流动相：包括流动相A和流动相B，流动相A为0.4％乙酸+20mmol/L乙酸铵水溶液，流动相B为乙腈，并按一定的洗脱梯度进行洗脱，理论板数按夏佛托苷计算，应不低于10000。

进一步地，所述石斛的标准指纹图谱中含有11个特征峰，其中一个为夏佛托苷对照品的特征峰。该石斛的标准指纹图谱中的11个特征峰的保留时间分别为：10.83min、13.01min、21.22min、24.15min、27.84min、28.80min、43.32min、44.64min、52.67min、56.37min以及66.15min，其中，保留时间为24.15min的峰为夏佛托苷对照品的特征峰；该保留时间的误差一般在±0.3min内，即该石斛的标准指纹图谱中的11个特征峰的保留时间分别可能为10.83±0.3min、13.01±0.3min、21.22±0.3min、24.15±0.3min、27.84±0.3min、28.80±0.3min、43.32±0.3min、44.64±0.3min、52.67±0.3min、56.37±0.3min以及66.15±0.3min。

进一步地，所述洗脱梯度如下所示：

本发明提供了一种石斛特征指纹图谱的建立方法，其主要具有的有益效果为：与过去的指纹图谱相比，本发明方法具有如下显著的优点和用途：本发明选用夏氟托苷为对照峰，对石斛中的其他特征峰进行保留时间和峰面积归一化处理，扣除不同批次之间保留时间漂移、操作误差等影响；本发明在构建指纹图谱的方法中对相对峰面积大于5％的指纹特征峰进行了定性，突破了以往指纹图谱的过于模糊性，对指纹图谱的主要成分进一步明确，将石斛指纹图谱的整体性和成分特异性统一起来，从而可以应用于药用石斛的石斛组培苗、石斛鲜品、石斛干品的质量分级及真伪鉴别。具体地：

①本发明所述方法的重现性良好，各共有峰相对峰面积的RSD小于5％，相对保留时间小于1％；精密度实验中各共有峰相对峰面积的RSD小于5％，相对保留时间小于1％，样品在24小时之内稳定性良好。说明各共有色谱峰能够客观地反映石斛的内在品质，可以作为石斛的质量控制性指标。

②本发明建立的特征指纹图谱检测方法对各供试品的前处理方法简单，特征性成分保留完成，且供试品溶液稳定性良好；

③该高效液相色谱方法的精密度较高、重现性良好，分析时间较短，具有一定的专属性，所得指纹图谱中各指纹峰分离效果较好；

④本发明选用峰面积较大的共有峰作为特征指纹峰，通过特征指纹峰相对保留时间和相对峰面积的比较，能有效地表征药用石斛的质量；

⑤本发明所建立的特征指纹图谱以夏佛托苷对照品为参照峰，确保各特质指纹峰的相对稳定性。

附图说明

下面根据附图对本发明作进一步详细说明。

图1是本发明实施例所述的对照品夏佛托苷色谱峰的HPLC图；

图2是本发明实施例所述的对10批铁皮石斛药材建立的HPLC指纹图谱；

图3是本发明实施例所述的铁皮石斛的HPLC指纹图谱；

图4是本发明实施例所述的金钗石斛的HPLC指纹图谱；

图5是本发明实施例所述的对10批金钗石斛药材建立的HPLC指纹图谱；

图6是本发明实施例所述的齿瓣石斛的HPLC指纹图谱。

图7是本发明实施例所述的对10批齿瓣石斛药材建立的HPLC指纹图谱；

图8是本发明实施例所述的兜唇石斛的HPLC指纹图谱。

图9是本发明实施例所述的对10批兜唇石斛药材建立的HPLC指纹图谱；

图10是本发明实施例所述的流苏石斛的HPLC指纹图谱。

图11是本发明实施例所述的对10批流苏石斛药材建立的HPLC指纹图谱；

图12是本发明实施例所述的鼓槌石斛的HPLC指纹图谱。

图13是本发明实施例所述的对10批鼓槌石斛药材建立的HPLC指纹图谱；

图14是本发明实施例所述的美花石斛的HPLC指纹图谱。

图15是本发明实施例所述的对10批美花石斛药材建立的HPLC指纹图谱；

图16是本发明实施例所述的叠鞘石斛的HPLC指纹图谱；

图17是本发明实施例所述的对10批叠鞘石斛药材建立的HPLC指纹图谱；

图18是本发明实施例所述的霍山石斛的HPLC指纹图谱；

图19是本发明实施例所述的对10批霍山石斛药材建立的HPLC指纹图谱。

具体实施方式

如图1-19所示，本发明实施例所述的一种石斛特征指纹图谱的建立方法。下面以具体实验案例为例来说明具体实施方式，应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

仪器和试剂：仪器：Agilent1200series高效液相色谱仪(包括低压二元梯度泵G1312A，柱温箱G1316A，二极管阵列检测器G1315B，Chemstation化学工作站，美国Agilent科技有限公司)，100g手提式粉碎机(广州旭朗机械设备有限公司)Milli-Q Synthesis超纯水纯化系统(Millipore公司)，RQ-250B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，PB303-N电子天平(MEETTLER TOLEDO，0.001g)，0.45μm微孔滤头(津腾公司)。试剂：试剂：乙腈、甲醇(色谱纯，美国Fisher scientific公司)；其它试剂为分析纯；超纯水(MilliQ超纯水，过0.45μm微孔滤膜)；乙酸(北京东方精细化工品有限公司)。

实施例1：铁皮石斛特征指纹图谱的建立

(1)供试品溶液(即标准品溶液)的制备：取铁皮石斛干燥样品，用粉碎机粉碎，过药典筛(孔径0.335mm)，精密称取铁皮石斛粉末1.000g，置于100ml锥形瓶中，分别加入50mL75％甲醇(V水：V甲醇＝25:75)，室温下超声30min后取出，过滤，滤液旋蒸浓缩至干，用75％甲醇溶剂(V水：V甲醇＝25:75)溶解，最后转移至5ml容量瓶中定容，摇匀，以0.45μm微孔滤膜过滤，即得标准品溶液。

(2)对照品溶液的制备：精密称取夏佛托苷对照品0.164mg，用75％甲醇(V水：V甲醇＝25:75)溶解稀释，制备成浓度为16.4μg/ml夏佛托苷对照品溶液。

(3)标准指纹图谱的测定：分别精密吸取标准样品溶液和对照品溶液，分别注入高效液相色谱仪进行测定，以对照品夏佛托苷色谱峰作为指纹图谱的参照峰，夏佛托苷色谱峰如图1所示，计算标准样品各特征峰的相对保留时间和保留峰面积，制定得到标准指纹图谱；

表1流动相的梯度洗脱变化表

(4)采用高效液相色谱仪进行测定的色谱条件与系统适用性实验为：色谱分离柱填料Alltima C18色谱柱(250mm×4.6mm，5um)，流动相：包括流动相A和流动相B，流动相A为0.4％乙酸+20mmol/L乙酸铵水溶液，流动相B为乙腈，；流速1ml/min，检测波长280nm，柱温30℃；采用梯度洗脱方式：0min→12min→35min→45min→60min→80min，乙腈2％→15％→24％→36％→75％→95％(即采用梯度洗脱方如表1所示)，后运行10min；在此条件下分析标准品溶液，得到铁皮石斛的指纹图谱，图3为铁皮石斛的HPLC指纹图谱。

(5)按照本发明提供的方法，对10批铁皮石斛药材建立了HPLC指纹图谱(如图2所示)，表2为10批石斛相似度结果，根据10批次样品的指纹图谱，制定铁皮石斛的特征指纹图谱。

表2 10批铁皮石斛相似度结果

实施例2：金钗石斛特征指纹图谱的建立

(1)供试品溶液(即标准品溶液)的制备：取金钗石斛干燥样品，用粉碎机粉碎，过药典筛(孔径0.335mm)，精密称取金钗石斛粉末1.000g，置于100ml锥形瓶中，分别加入50mL75％甲醇(V水：V甲醇＝25:75)，室温下超声30min后取出，过滤，滤液旋蒸浓缩至干，用75％甲醇溶剂(V水：V甲醇＝25:75)溶解，最后转移至5ml容量瓶中定容，摇匀，以0.45μm微孔滤膜过滤，即得标准品溶液。

步骤(2)～(4)同实施例1所示，便得到金钗石斛的指纹图谱，图4为铁皮石斛的HPLC指纹图谱。

(5)按照本发明提供的方法，对10批金钗石斛药材建立了HPLC指纹图谱(如图5所示)，表3为10批金钗石斛相似度结果，根据10批次样品的指纹图谱，制定金钗石斛的特征指纹图谱。

表3 10批金钗石斛指纹图谱相似度评价结果

实施例3：齿瓣石斛特征指纹图谱的建立

(1)供试品溶液(即标准品溶液)的制备：取齿瓣石斛干燥样品，用粉碎机粉碎，过药典筛(孔径0.335mm)，精密称取齿瓣石斛粉末1.000g，置于100ml锥形瓶中，分别加入50mL75％甲醇(V水：V甲醇＝25:75)，室温下超声30min后取出，过滤，滤液旋蒸浓缩至干，用75％甲醇溶剂(V水：V甲醇＝25:75)溶解，最后转移至5ml容量瓶中定容，摇匀，以0.45μm微孔滤膜过滤，即得标准品溶液。

步骤(2)～(4)同实施例1所示，便得到齿瓣石斛的指纹图谱，图6为齿瓣石斛的HPLC指纹图谱。

(5)按照本发明提供的方法，对10批齿瓣石斛药材建立了HPLC指纹图谱(如图7所示)，表4为10批齿瓣石斛相似度结果，根据10批次样品的指纹图谱，制定齿瓣石斛的特征指纹图谱。

表4 10批齿瓣石斛指纹图谱相似度评价结果

实施例4：兜唇石斛特征指纹图谱的建立

(1)供试品溶液(即标准品溶液)的制备：取兜唇石斛干燥样品，用粉碎机粉碎，过药典筛(孔径0.335mm)，精密称取兜唇石斛粉末1.000g，置于100ml锥形瓶中，分别加入50mL75％甲醇(V水：V甲醇＝25:75)，室温下超声30min后取出，过滤，滤液旋蒸浓缩至干，用75％甲醇溶剂(V水：V甲醇＝25:75)溶解，最后转移至5ml容量瓶中定容，摇匀，以0.45μm微孔滤膜过滤，即得标准品溶液。

步骤(2)～(4)同实施例1所示，便得到兜唇石斛的指纹图谱，图8为兜唇石斛的HPLC指纹图谱。

(5)按照本发明提供的方法，对10批兜唇石斛药材建立了HPLC指纹图谱(如图9所示)，表5为10批齿瓣石斛相似度结果，根据10批次样品的指纹图谱，制定兜唇石斛的特征指纹图谱。

表5 10批兜唇石斛指纹图谱相似度评价结果

实施例5：霍山石斛特征指纹图谱的建立

(1)供试品溶液(即标准品溶液)的制备：取霍山石斛干燥样品，用粉碎机粉碎，过药典筛(孔径0.335mm)，精密称取霍山石斛粉末1.000g，置于100ml锥形瓶中，分别加入50mL75％甲醇(V水：V甲醇＝25:75)，室温下超声30min后取出，过滤，滤液旋蒸浓缩至干，用75％甲醇溶剂(V水：V甲醇＝25:75)溶解，最后转移至5ml容量瓶中定容，摇匀，以0.45μm微孔滤膜过滤，即得标准品溶液。

步骤(2)～(4)同实施例1所示，便得到霍山石斛的指纹图谱，图18为霍山石斛的HPLC指纹图谱。

(5)按照本发明提供的方法，对10批霍山石斛药材建立了HPLC指纹图谱(如图19所示)，表6为10批齿瓣石斛相似度结果，根据10批次样品的指纹图谱，制定霍山石斛的特征指纹图谱。

表6 10批齿瓣石斛指纹图谱相似度评价结果

实施例6：流苏石斛特征指纹图谱的建立

(1)供试品溶液(即标准品溶液)的制备：取流苏石斛干燥样品，用粉碎机粉碎，过药典筛(孔径0.335mm)，精密称取流苏石斛粉末1.000g，置于100ml锥形瓶中，分别加入50mL75％甲醇(V水：V甲醇＝25:75)，室温下超声30min后取出，过滤，滤液旋蒸浓缩至干，用75％甲醇溶剂(V水：V甲醇＝25:75)溶解，最后转移至5ml容量瓶中定容，摇匀，以0.45μm微孔滤膜过滤，即得标准品溶液。

步骤(2)～(4)同实施例1所示，便得到流苏石斛的指纹图谱，图10为流苏石斛的HPLC指纹图谱。

(5)按照本发明提供的方法，对10批流苏石斛药材建立了HPLC指纹图谱(如图11所示)，表7为10批流苏石斛相似度结果，根据10批次样品的指纹图谱，制定流苏石斛的特征指纹图谱。

表7 10批流苏石斛指纹图谱相似度评价结果

实施例7：鼓槌石斛特征指纹图谱的建立

(1)供试品溶液(即标准品溶液)的制备：取鼓槌石斛干燥样品，用粉碎机粉碎，过药典筛(孔径0.335mm)，精密称取鼓槌石斛粉末1.000g，置于100ml锥形瓶中，分别加入50mL75％甲醇(V水：V甲醇＝25:75)，室温下超声30min后取出，过滤，滤液旋蒸浓缩至干，用75％甲醇溶剂(V水：V甲醇＝25:75)溶解，最后转移至5ml容量瓶中定容，摇匀，以0.45μm微孔滤膜过滤，即得标准品溶液。

步骤(2)～(4)同实施例1所示，便得到鼓槌石斛的指纹图谱，图12为鼓槌石斛的HPLC指纹图谱。

(5)按照本发明提供的方法，对10批鼓槌石斛药材建立了HPLC指纹图谱(如图13所示)，表8为10批鼓槌石斛相似度结果，根据10批次样品的指纹图谱，制定鼓槌石斛的特征指纹图谱。

表8 10批鼓槌石斛指纹图谱相似度评价结果

实施例8：美花石斛(即环草石斛)特征指纹图谱的建立

(1)供试品溶液(即标准品溶液)的制备：取美花石斛干燥样品，用粉碎机粉碎，过药典筛(孔径0.335mm)，精密称取美花石斛粉末1.000g，置于100ml锥形瓶中，分别加入50mL75％甲醇(V水：V甲醇＝25:75)，室温下超声30min后取出，过滤，滤液旋蒸浓缩至干，用75％甲醇溶剂(V水：V甲醇＝25:75)溶解，最后转移至5ml容量瓶中定容，摇匀，以0.45μm微孔滤膜过滤，即得标准品溶液。

步骤(2)～(4)同实施例1所示，便得到美花石斛的指纹图谱，图14为美花石斛的HPLC指纹图谱。

(5)按照本发明提供的方法，对10批美花石斛药材建立了HPLC指纹图谱(如图15所示)，表9为10批美花石斛相似度结果，根据10批次样品的指纹图谱，制定美花石斛的特征指纹图谱。

表9 10批美花石斛指纹图谱相似度评价结果

实施例9：叠鞘石斛特征指纹图谱的建立

(1)供试品溶液(即标准品溶液)的制备：取叠鞘石斛干燥样品，用粉碎机粉碎，过药典筛(孔径0.335mm)，精密称取叠鞘石斛粉末1.000g，置于100ml锥形瓶中，分别加入50mL75％甲醇(V水：V甲醇＝25:75)，室温下超声30min后取出，过滤，滤液旋蒸浓缩至干，用75％甲醇溶剂(V水：V甲醇＝25:75)溶解，最后转移至5ml容量瓶中定容，摇匀，以0.45μm微孔滤膜过滤，即得标准品溶液。

步骤(2)～(4)同实施例1所示，便得到叠鞘石斛的指纹图谱，图16为叠鞘石斛的HPLC指纹图谱。

(5)按照本发明提供的方法，对10批叠鞘石斛药材建立了HPLC指纹图谱(如图17所示)，表10为10批叠鞘石斛相似度结果，根据10批次样品的指纹图谱，制定叠鞘石斛的特征指纹图谱。

表10 10批叠鞘石斛指纹图谱相似度评价结果

在280nm波长下，选用夏氟托苷为对照峰，对石斛中的其他特征峰进行保留时间和峰面积归一化处理，扣除不同批次之间保留时间漂移、操作误差等影响；选取上述实施例1～9中的各种石斛的指纹图谱中的11个共有峰作为特征峰，如图3中标示出了这11个共有的特征峰，分别为1～11号峰(图3中这11个峰的保留时间分别为10.83min、13.01min、21.22min、24.15min、27.84min、28.80min、43.32min、44.64min、52.67min、56.37min以及66.15min)。这11个共有的特征峰按保留时间由短至长分别为腺苷、未知结构、异夏佛托苷、夏佛托苷、芦丁、铁皮石斛素L、N-p-香豆酰酪胺、反-N-(4-羟基苯乙基)阿魏酸酰胺、4，4'-二羟基-3,5-二甲氧基联苄、3，4-二羟基-5,4'-二甲氧基联苄以及钩状石斛素。

此外，11个共有峰(铁皮石斛(Dendrobium catenatum)、霍山石斛(Dendrobiumhuoshanense)、兜唇石斛(Dendrobium cucullatum)、齿瓣石斛(Dendrobium devonianum)、金钗石斛(Dendrobium nobile)、叠鞘石斛(Dendrobium denneanum)、鼓锤石斛(Dendrobium chrysotoxum)、环草石斛(Dendrobium loddigesii)、流苏石斛(Dendrobiumfimbriatum)中均有的峰)的精密度实验结果、重复性实验结果以及稳定性实验结果如表11～16所示。

表11相对峰面积精密度实验结果

表12相对保留时间精密度实验结果

表13相对峰面积重复性实验结果

表14相对保留时间重复性实验结果

表15相对峰面积稳定性实验结果

表16相对保留时间稳定性实验结果

由以上实验结果可知，采用本发明方法所建立的一种石斛的HPLC特征指纹图谱，检测波长280nm下确定了9种石斛的特征指纹峰，其中包括对照品夏佛托苷的色谱峰。方法学考察结果表明：本实验重现性良好，各共有峰相对峰面积的RSD小于5％，相对保留时间小于1％；精密度实验中各共有峰相对峰面积的RSD小于5％，相对保留时间小于1％，样品在24小时之内稳定性良好。说明各共有色谱峰能够客观地反映石斛的内在品质，可以作为石斛的质量控制性指标。

本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下所作的有关本发明的任何修饰或变更，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种石斛特征指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

①标准样品溶液制备：取石斛干燥样品，用粉碎机粉碎，过筛，得石斛粉末，精密称取石斛粉末，加入75％甲醇，室温下超声30min后取出，过滤，滤液浓缩至干，用75％甲醇溶剂溶解，然后转移至容量瓶中定容，摇匀，以0.45μm微孔滤膜过滤，即得标准样品溶液；

②对照品溶液制备：精密称取夏佛托苷作为对照品，用75％甲醇溶解稀释，制备成浓度为16.4μg/ml夏佛托苷溶液即为对照品溶液；

③标准指纹图谱的测定：分别精密吸取标准样品溶液和对照品溶液，分别注入高效液相色谱仪进行测定，以对照品夏佛托苷色谱峰作为指纹图谱的参照峰，计算标准样品各特征峰的相对保留时间和保留峰面积，制定得到石斛的标准指纹图谱；采用高效液相色谱仪进行测定的色谱条件与系统适用性实验为：色谱柱：Alltima C18色谱柱，250mm×4.6mm，5um；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；进样量：20ul；检测波长：280nm，参比波长500nm；流动相：包括流动相A和流动相B，流动相A为0.4％乙酸+20mmol/L乙酸铵水溶液，流动相B为乙腈，并按一定的洗脱梯度进行洗脱，理论板数按夏佛托苷计算，应不低于10000；所述洗脱梯度如下所示：

所述石斛的标准指纹图谱中含有11个特征峰，保留时间分别为：10.83±0.3min、13.01±0.3min、21.22±0.3min、24.15±0.3min、27.84±0.3min、28.80±0.3min、43.32±0.3min、44.64±0.3min、52.67±0.3min、56.37±0.3min以及66.15±0.3min，其中，保留时间为24.15±0.3min的峰为夏佛托苷对照品的特征峰。

2.根据权利要求1所述的石斛特征指纹图谱的建立方法，其特征在于：步骤①中所述标准样品溶液制备的具体过程为：取石斛干燥样品，用粉碎机粉碎，过筛，得石斛粉末，精密称取石斛粉末1.000g，置于100mL锥形瓶中，加入50mL 75％甲醇，室温下超声30min后取出，过滤，滤液减压蒸馏浓缩至干，用75％甲醇溶解，然后转移至5mL容量瓶中定容，摇匀，以0.45μm微孔滤膜过滤，即得标准样品溶液。

3.根据权利要求1或2所述的石斛特征指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述精密称取石斛粉末的称量误差不能超过0.2％。

4.根据权利要求1或2所述的石斛特征指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述过筛为过孔径0.335mm的筛。

5.根据权利要求1所述的石斛特征指纹图谱的建立方法，其特征在于：步骤①中所述的石斛为铁皮石斛、霍山石斛、兜唇石斛、齿瓣石斛、金钗石斛、叠鞘石斛、鼓槌石斛、环草石斛以及流苏石斛中的任意一种。