CN101327246A - 黄芪药材、中间体及其制剂的指纹图谱检测方法和标准指纹图谱 - Google Patents

黄芪药材、中间体及其制剂的指纹图谱检测方法和标准指纹图谱 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种黄芪药材、中间体及其制剂的指纹图谱检测方法，以芒炳花素对照品，通过提取/溶解、定容等步骤制得各供试品溶液，在同一色谱条件下进行HPLC检测，进行梯度洗脱，记录色谱图，即得。该方法对各供试品的前处理方法简单，特征性成分保留完整，供试品溶液稳定；且精密度较高、重现性良好，具一定的专属性；所得指纹图谱中各特征峰分离效果较好，黄芪药材、中间体和制剂的指纹图谱具有较好的相关性；可用于鉴别黄芪药材的伪劣，增加黄芪制剂生产过程的可控性，有利于保证黄芪制剂的质量稳定和临床疗效。本发明还公开了根据上述指纹图谱检测方法得到的黄芪药材、中间体及其制剂的标准指纹图谱。

Description

黄芪药材、中间体及其制剂的指纹图谱检测方法和标准指纹图谱
技术领域
本发明属于药物质量控制技术领域，特别涉及一种黄芪药材、中间体及其制剂的指纹图谱检测方法，并由此得到其标准指纹图谱。
背景技术
黄芪又称膜荚黄芪或黄耆，为豆科、多年生草本。主根长，圆柱形，稍带木质，外质土黄色或棕红色。喜干旱，适应性强。分布河北、山西、陕西、甘肃、青海、辽宁、吉林、黑龙江、内蒙古等地。
黄芪的根是著名的常用中药。商品黄芪呈圆柱形，略扭曲，长20～60厘米，以条粗长、皱纹少、质坚而绵、粉性足、味甜者为好。主要含有香豆素、黄酮类化合物、皂苷及微量叶酸和数种维生素等。其味甘，微温，具有补气固表，托疮生肌、利水的功效，主治气血虚弱、自汗、久泻脱肛、子宫脱垂、肾炎浮肿、蛋白尿、糖尿病、慢性溃疡等症。近年来临床也用于治疗高血压和急慢性肾炎等。
黄芪颗粒是以黄芪药材为原料经过提取制成的颗粒剂，其制备过程中需要将黄芪药材进行水提、浓缩为清膏等步骤处理。在此制备过程中，对黄芪药材、中间体(即黄芪浸膏)以及制剂(即黄芪颗粒，包括有糖型和无糖型)，都需要采取一定的质量控制措施，以保证产品的质量和功效等；而传统的黄芪颗粒质量控制方法中，仅仅只采用了薄层色谱法对其中含有的黄芪甲苷进行了定性鉴别，没有更为可靠的质量控制方法；对于黄芪药材和中间体，更没有任何质量控制措施。这对其终产品黄芪颗粒的质量和功效保证等都是远远不够的。
发明内容
本发明的目的就是针对上述黄芪药材、中间体及其制剂的质量控制现状，提供一种基于高效液相色谱法的黄芪药材、中间体及其制剂的指纹图谱检测方法。通过该检测方法可得到黄芪药材、中间体及其制剂的HPLC(高效液相色谱)指纹图谱，有利于对其原料药材、中间体及其终产品质量的有效控制及保证其临床疗效。
本发明的另一个目的是提供一种上述黄芪药材、中间体及其制剂的标准指纹图谱。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
黄芪药材、中间体及其制剂的指纹图谱检测方法，包括下述主要步骤：
(1)对照品溶液的制备：
称取芒炳花素对照品，置于容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制成对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：
黄芪药材供试品溶液的制备：称取黄芪药材粉末，加80～95％甲醇溶液超声处理10～60min，滤过，用适量80～95％甲醇洗涤滤渣、滤纸和漏斗，洗液并入滤液中，置水浴上挥干，残渣用80～95％的甲醇转移至量瓶中，加同种溶剂稀释至刻度，摇匀，放置0.4h～1.0h，用微孔滤膜0.35-0.55μm滤过，取续滤液，即得黄芪药材供试品溶液；
黄芪中间体供试品溶液的制备：称取黄芪中间体(黄芪浸膏)，置量瓶中，加80～95％甲醇适量(以不超过刻度为准)，超声处理10～60min，加同种溶剂至刻度，摇匀，用微孔滤膜(微孔直径0.35-0.55μm)滤过，取续滤液，即得黄芪中间体供试品溶液；
黄芪制剂(黄芪颗粒，包括有糖型和无糖型，下同)供试品溶液的制备：取黄芪颗粒，研细，称取，加80～95％甲醇超声处理10～60min，滤过，用适量80～95％洗涤滤渣、滤纸和漏斗，洗液并入滤液中，置水浴上挥干，残渣用80～95％甲醇转移至量瓶中，加同种溶剂稀释至刻度，摇匀，放置0.4h～1.0h后，用微孔滤膜(微孔直径0.35-0.55μm)滤过，取续滤液，即得黄芪制剂供试品溶液；
(3)HPLC检测：
分别吸取等体积或不等体积的上述对照品溶液和各供试品溶液，分别注入高效液相色谱仪中，记录色谱图。
色谱条件：
色谱柱为C18反相色谱柱，以柱长为250mm的C18反相色谱柱为佳；柱温为30℃；检测波长为210nm；流动相A为3％(体积百分比)的乙腈水溶液，流动相B为60％(体积百分比)的乙腈水溶液，总流速为1.0ml/min；
采用下述梯度洗脱方式：
在100min内，流动相A的流速从1.0ml/min匀速减至0ml/min，流动相B则从0ml/min匀速增至1.0ml/min，总流速保持为1.0ml/min；流动相A和B经过混合器混合后进入色谱柱进行洗脱。
上述黄芪药材、中间体及其制剂的指纹图谱检测方法中，步骤(2)供试品溶液的制备可优选下述方法进行：
黄芪药材供试品溶液的制备：称取黄芪药材粉末1.0～5.0g，加80～95％甲醇20～150ml超声处理20～40min，滤过，用适量同种溶剂洗涤滤渣、滤纸和漏斗，洗液并入滤液中，置水浴上挥干，残渣用80～95％的甲醇转移至5～25ml量瓶中，加同种溶剂稀释至刻度，摇匀，放置0.4h～1.0h，用微孔滤膜(微孔直径0.35-0.55μm)滤过，取续滤液，即得黄芪药材供试品溶液；
黄芪中间体供试品溶液的制备：称取黄芪中间体(黄芪浸膏)2.0～10.0g，置25～50ml量瓶中，加80～95％甲醇适量(以不超过刻度为准)，超声处理20～40min，加同种溶剂至刻度，摇匀，用微孔滤膜(微孔直径0.35-0.55μm)滤过，取续滤液，即得黄芪中间体供试品溶液；
黄芪制剂(黄芪颗粒)供试品溶液的制备：取黄芪制剂(颗粒)，研细，称取1.0～10.0g，加80～95％甲醇20～150ml，超声处理20～40min，滤过，用适量同种溶剂洗涤滤渣、滤纸和漏斗，洗液并入滤液中，置水浴上挥干，残渣用80～95％甲醇转移至5～25ml量瓶中，加同种溶剂稀释至刻度，摇匀，放置0.4h～1.0h，用微孔滤膜(微孔直径0.35-0.55μm)滤过，取续滤液，即得黄芪制剂供试品溶液。
对通过上述检测方法得到的色谱图进行比较分析，以同一色谱图中的芒柄花素峰为参照(即分别以芒柄花素峰的保留时间及峰面积为1)，计算各(特征)色谱峰的相对保留时间及相对峰面积，以相对保留时间对色谱峰进行辨认，并进行相似度评价，即可得到黄芪药材、中间体及其制剂的HPLC指纹图谱。
按照上述方法，发明人通过对不同批次的黄芪药材、中间体及其制剂的大量重复检测及比较分析，得到具有如下述表1～表4所列特征峰的黄芪药材、中间体(黄芪浸膏)及其制剂(黄芪颗粒，包括有糖型和无糖型)的标准指纹图谱：
表1黄芪药材指纹图谱各特征峰的相对保留时间和相对峰面积
  峰号   相对保留时间   相对峰面积
  1   0.087-0.087   0.176-0.409
  2   0.090-0.096   0.170-0.224
  3   0.101-0.102   0.132-0.487
  4   0.115-0.117   0.405-0.558
  5   0.179-0.182   0.946-1.166
  6   0.191-0.199   0.242-0.334
  7   0.201-0.253   0.166-0.844
  8   0.255-0.283   0.376-1.365
  9   0.284-0.406   0.423-0.526
  10   0.545-0.548   0.680-2.616
  11   0.607-0.633   0.359-0.468
  12   0.707-0.711   0.398-0.810
  13   0.714-0.718   0.214-0.402
  14   0.748-0.752   0.694-2.144
  15   0.767-0.770   0.467-1.333
  15’   0.796-0.800   1.286-2.381
  16   0.959-0.983   0.151-0.478
  17   1.000   1.000
  18   1.014-1.016   0.127-0.515
  19   1.028-1.028   1.653-2.329
  19’   1.044-1.046   2.556-8.264
表2黄芪浸膏指纹图谱各特征峰的相对保留时间和相对峰面积
  峰号   相对保留时间   相对峰面积
  1   0.086-0.089   0.717-2.361
  2   0.093-0.101   0.509-0.809
  3   0.100-0.108   0.142-0.422
  4   0.112-0.120   0.296-0.707
  5   0.125-0.140   1.146-1.967
  6   0.195-0.228   5.987-8.195
  7   0.205-0.238   1.944-3.804
  8   0.271-0.287   1.838-2.711
  9   0.284-0.313   0.957-1.963
  9’   0.534-0.545   0.539-0.992
  10   0.551-0.556   2.667-5.310
  11   0.602-0.606   0.487-1.052
  12   0.708-0.711   0.781-1.530
  13   0.747-0.750   2.553-5.016
  14   0.764-0.768   1.364-2.018
  15   0.798-0.801   3.195-4.235
  16   1.000   1.000
  17   1.014-1.016   0.256-0.425
  18   1.030-1.031   2.449-3.132
  19   1.043-1.046   2.520-3.176
表3黄芪颗粒(有糖型)指纹图谱各特征峰的相对保留时间和相对峰面积
  峰号   相对保留时间   相对峰面积
  1   0.082-0.087   0.741-1.403
  2   0.086-0.091   0.703-1.184
  3   0.093-0.098   0.141-0.262
  4   0.099-0.106   0.381-0.578
  5   0.115-0.122   1.283-2.638
  6   0.180-0.193   5.665-7.764
  7   0.194-0.213   1.917-3.245
  8   0.261-0.271   1.851-3.210
  9   0.289-0.297   1.040-1.834
  10   0.548-0.555   3.239-5.710
  11   0.604-0.609   0.433-0.940
  12   0.709-0.713   0.775-1.515
  13   0.748-0.753   3.047-5.159
  14   0.766-0.771   1.298-1.929
  15   0.797-0.801   3.244-3.823
  16   1.000   1.000
  17   1.014-1.015   0.306-0.389
  18   1.028-1.030   2.778-3.254
  19   1.043-1.045   2.745-3.631
表4黄芪颗粒(无糖型)指纹图谱各特征峰的相对保留时间和相对峰面积
  峰号   相对保留时间   相对峰面积
  1   0.086-0.088   1.299-2.044
  2   0.090-0.095   0.539-1.120
  3   0.098-0.101   0.065-0.197
  4   0.104-0.111   0.319-0.523
  5   0.119-0.128   1.173-2.162
  6   0.187-0.207   2.734-6.119
  7   0.199-0.218   1.902-3.671
  8   0.263-0.278   1.524-3.015
  9   0.291-0.304   0.790-1.534
  10   0.552-0.555   3.345-7.457
  11   0.605-0.612   0.474-1.241
  12   0.710-0.717   0.937-2.030
  13   0.749-0.757   3.5081-7.899
  14   0.766-0.775   1.358-2.577
  15   0.798-0.801   3.431-3.841
  16   1.000   1.000
  17   1.015-1.017   0.320-0.529
  18   1.030-1.032   3.004-3.442
  19   1.045-1.046   2.990-4.135
本发明所述的中间体(黄芪浸膏)，可以是在黄芪颗粒等制剂的制备过程中，将原料黄芪药材经过下述方法进行提取、浓缩而得的清膏(当然也并不仅限于该方法)：
取黄芪药材1000g，加水煎煮2次，每次煎煮2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度1.20～1.30(70～80℃)的清膏。
本发明所述的制剂，包括有糖型和无糖型黄芪颗粒，其中：
有糖型黄芪颗粒可以是按照下述方法制得的黄芪颗粒(当然也并不仅限于该方法)：
取以上述方法制得的黄芪清膏，加入蔗糖辅料适量，制成颗粒1000g，干燥，即得有糖型黄芪颗粒制剂。
无糖型黄芪颗粒可以是按照下述方法制得的黄芪颗粒(当然也并不仅限于该方法)：
取以上述方法制得的黄芪清膏，加入糊精辅料适量，制成颗粒1000g，干燥，即得无糖型黄芪颗粒制剂。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明黄芪药材、中间体及其制剂的指纹图谱检测方法对各供试品的前处理方法简单，特征性成分保留完整，且供试品溶液稳定；该HPLC方法的精密度较高、重现性良好，具有一定的专属性；所得指纹图谱中各特征峰的分离效果较好，且黄芪药材指纹图谱与中间体指纹图谱和制剂指纹图谱具有较好的相关性；黄芪药材指纹图谱可用于鉴别黄芪药材的伪劣，黄芪中间体指纹图谱的应用可增加黄芪制剂生产过程的可控性，黄芪制剂指纹图谱的应用则有利于保证黄芪制剂的质量稳定和临床疗效。
附图说明
图1是本发明黄芪药材指纹图谱及其色谱峰编号；
图2是本发明黄芪中间体(黄芪浸膏)指纹图谱及其色谱峰编号；
图3是本发明黄芪制剂(黄芪颗粒，有糖型)指纹图谱及其色谱峰编号；
图4是本发明黄芪制剂(黄芪颗粒，无糖型)指纹图谱及其色谱峰编号。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。
但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。
实施例1
本实施例为对3批黄芪药材的指纹图谱检测方法及据此得到的指纹图谱：
检测方法包括下述主要步骤：
(1)对照品溶液的制备：
称取芒炳花素对照品，置于容量瓶中，加甲醇溶解并稀释制成每1ml含0.1mg的溶液，摇匀，即得对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：
分别称取3批黄芪药材(批次分别为：060530、060827、070202)粉末各2.0g，分别加80％、90％、95％甲醇50ml，分别超声处理50min、30min、20min，滤过，分别用适量同浓度甲醇洗涤滤渣、滤纸和漏斗，洗液并入滤液中，置水浴上挥干，残渣分别用同浓度甲醇转移至10ml量瓶中，分别加同种溶剂稀释至刻度，摇匀，放置0.4h后，用微孔滤膜(微孔直径0.45μm)滤过，取续滤液，即得黄芪药材供试品溶液；
(3)HPLC检测：
HPLC色谱条件：
色谱仪：日本岛津LC-10AT vp高效液相色谱仪，LC-10AT vp泵、SPD-M10Avp光二极管阵列检测器、Class-vp色谱工作站；色谱柱：Luna 5μC18(2)100A(250×4.60mm)柱；检测波长：210nm；柱温：30℃；进样量：10μl；总流速：1.0ml/min；流动相A：体积百分比为3％的乙腈水溶液；流动相B：体积百分比为60％的乙腈水溶液；按照下述梯度洗脱方式进行洗脱：
在100min内，流动相A的流速从1.0ml/min匀速减至0ml/min，流动相B则从0ml/min匀速增至1.0ml/min，总流速保持为1.0ml/min；流动相A和B经过混合器混合后进入色谱柱进行洗脱；
HPLC检测方法：
分别吸取上述对照品溶液和各供试品溶液10μl，分别注入高效液相色谱仪中进行测定，记录色谱图(其中060530批药材所得图谱及其色谱峰编号如图1所示)。
根据得到的色谱图进行比较分析，以芒柄花素峰为参照(即分别以芒柄花素峰的保留时间及峰面积为1)，计算各色谱峰的相对保留时间，以相对保留时间对色谱峰进行辨认；计算各色谱峰的相对保留时间及相对峰面积，所得指纹图谱数据见下述表5。同时，按峰面积计算供试品与标准指纹图谱的夹角余弦，结果均不低于0.9。
表5黄芪药材指纹图谱的相对保留时间和相对峰面积
Figure A20081004568100141
Figure A20081004568100151
实施例2
本实施例为对3批中间体(黄芪浸膏)的指纹图谱检测方法及据此得到的指纹图谱：
检测方法包括下述主要步骤：
(1)对照品溶液的制备：
称取芒炳花素对照品，置于容量瓶中，加甲醇溶解并稀释制成每1ml含0.1mg的溶液，摇匀，即得对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：
分别称取3批黄芪中间体(黄芪浸膏；批次分别为：M070601、M070701、M070702)5.0g，置25ml量瓶中，分别加80％、90％、95％甲醇适量，分别超声处理20min、30min、40min，分别加同浓度甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜(微孔直径为0.35μm)滤过，取续滤液，即得黄芪中间体供试品溶液；
(3)HPLC检测：
HPLC色谱条件：
色谱仪：日本岛津LC-10AT vp高效液相色谱仪，LC-10AT vp泵、SPD-M10Avp光二极管阵列检测器、Class-vp色谱工作站；色谱柱：Luna 5μC18(2)100A(250×4.60mm)柱；检测波长：210nm；柱温：30℃；进样量：10μl；流速：1.0ml/min；流动相A：体积百分比为3％的乙腈水溶液；流动相B：体积百分比为60％的乙腈水溶液(按照实施例1所述的梯度洗脱方式进行洗脱)；
HPLC检测方法：
分别吸取上述对照品溶液和各供试品溶液10μl，分别注入高效液相色谱仪中进行测定，记录色谱图(其中M070601批浸膏所得图谱及其色谱峰编号如图2所示)。
根据得到的色谱图进行比较分析，以芒柄花素峰为参照(即分别以芒柄花素峰的保留时间及峰面积为1)，计算各色谱峰的相对保留时间，以相对保留时间对色谱峰进行辨认；计算各色谱峰的相对保留时间及相对峰面积，所得指纹图谱数据见下述表6。同时，按峰面积计算供试品与标准指纹图谱的夹角余弦，结果均不低于0.9。
表6黄芪浸膏指纹图谱的相对保留时间和相对峰面积
Figure A20081004568100161
实施例3
本实施例为对3批制剂(黄芪颗粒，有糖型)的指纹图谱检测方法及据此得到的指纹图谱：
检测方法包括下述主要步骤：
(1)对照品溶液的制备：
称取芒炳花素对照品，置于容量瓶中，加甲醇溶解并稀释制成每1ml含0.1mg的溶液，摇匀，即得对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：
取黄芪制剂(黄芪颗粒，有糖型；批号分别为：070601、070701、070702)，研细，称取3.0g，置50ml量瓶中，分别加80％、90％、95％甲醇适量，分别超声处理20min、30min、50min，用适量同浓度甲醇洗涤滤渣、滤纸和漏斗，洗液并入滤液中，置水浴上挥干，残渣分别用同浓度甲醇转移至10ml量瓶中，加同种溶剂稀释至刻度，摇匀，放置半小时后，用微孔滤膜(微孔直径0.45μm)滤过，取续滤液，即得黄芪制剂供试品溶液；
(3)HPLC检测：
HPLC色谱条件：
色谱仪：日本岛津LC-10AT vp高效液相色谱仪，LC-10AT vp泵、SPD-M10Avp光二极管阵列检测器、Class-vp色谱工作站；色谱柱：Luna 5μC18(2)100A(250×4.60mm)柱；检测波长：210nm；柱温：30℃；进样量：10μl；流速：1.0ml/min；流动相A：体积百分比为3％的乙腈水溶液；流动相B：体积百分比为60％的乙腈水溶液(按照实施例1所述的梯度洗脱方式进行洗脱)；
HPLC检测方法：
分别吸取上述对照品溶液和各供试品溶液10μl，分别注入高效液相色谱仪中进行测定，记录色谱图(其中070601批颗粒所得图谱及其色谱峰编号如图3所示)。
根据得到的色谱图进行比较分析，以芒柄花素峰为参照(即分别以芒柄花素峰的保留时间及峰面积为1)，计算各色谱峰的相对保留时间，以相对保留时间对色谱峰进行辨认；计算各色谱峰的平均相对保留时间及平均相对峰面积，所得指纹图谱数据见下述表7。同时，按峰面积计算供试品与标准指纹图谱的夹角余弦，结果均不低于0.9。
表7黄芪颗粒(有糖型)指纹图谱的相对保留时间和相对峰面积
Figure A20081004568100171
Figure A20081004568100181
实施例4
本实施例为对3批制剂(黄芪颗粒，无糖型)的指纹图谱检测方法及据此得到的指纹图谱：
检测方法包括下述主要步骤：
(1)对照品溶液的制备：
称取芒炳花素对照品，置于容量瓶中，加甲醇溶解并稀释制成每1ml含0.1mg的溶液，摇匀，即得对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：
取黄芪制剂(黄芪颗粒，无糖型；批号分别为：070530、070603、070720)，研细，称取2.0g，置50ml量瓶中，分别加80％、90％、95％甲醇适量，超声处理20min、40min、50min，用适量甲醇洗涤滤渣、滤纸和漏斗，洗液并入滤液中，置水浴上挥干，残渣用同浓度甲醇转移至10ml量瓶中，加同种溶剂稀释至刻度，摇匀，放置半小时后，用微孔滤膜(微孔直径0.45μm)滤过，取续滤液，即得黄芪制剂供试品溶液；
(3)HPLC检测：
HPLC色谱条件：
色谱仪：日本岛津LC-10AT vp高效液相色谱仪，LC-10AT vp泵、SPD-M10Avp光二极管阵列检测器、Class-vp色谱工作站；色谱柱：Luna 5μC18(2)100A(250×4.60mm)柱；检测波长：210nm；柱温：30℃；进样量：10μl；流速：1.0ml/min；流动相A：体积百分比为3％的乙腈水溶液；流动相B：体积百分比为60％的乙腈水溶液(按照实施例1所述的梯度洗脱方式进行洗脱)；
HPLC检测方法：
分别吸取上述对照品溶液和各供试品溶液10μl，分别注入高效液相色谱仪中进行测定，记录色谱图(其中070530批颗粒所得图谱及其色谱峰编号如图4所示)。
根据得到的色谱图进行比较分析，以芒柄花素峰为参照(即分别以芒柄花素峰的保留时间及峰面积为1)，计算各色谱峰的相对保留时间，以相对保留时间对色谱峰进行辨认；计算各色谱峰的相对保留时间及相对峰面积，所得指纹图谱数据见下述表8。同时，按峰面积计算供试品与标准指纹图谱的夹角余弦，结果均不低于0.9。
表8黄芪颗粒(无糖型)指纹图谱的相对保留时间和相对峰面积
实施例5
在探索本发明指纹图谱检测方法过程中，发明人对黄芪药材、中间体、制剂等供试品溶液的制备方法、各供试品HPLC检测时色谱条件的选择等，进行了大量的试验考察及对比研究分析，最终确立了如本发明所述的技术方案。
本实施例即是以黄芪颗粒(有糖型)为例，对供试品溶液的制备方法、HPLC检测色谱条件的选择等进行考察，从而体现本发明指纹图谱检测方法的确定过程及方法验证等过程：
1色谱条件的选择
1.1流动相的选择
试验了以下四种不同的流动相系统：乙腈-水、乙腈-0.01％磷酸、甲醇-水，以及乙腈-甲醇-水，结果以乙腈-水流动相系统的分离效果较好，故选择乙腈-水系统进一步试验。
1.2梯度程序的选择
由于本品中组分的极性差异较大，采用梯度洗脱方式为佳。发明人分别以不同浓度的乙腈水溶液作为流动相A和流动相B，对初始流动相、终止流动相和梯度程序等进行了试验研究及对比分析，最终选择的流动相为：
流动相A：体积百分比为3％乙腈水溶液；
流动相B：体积百分比为60％乙腈水溶液。
按照下述方法进行梯度洗脱，取得了较好的分离效果：
在100min内，流动相A的流速从1.0ml/min匀速减至0ml/min，流动相B则从0ml/min匀速增至1.0ml/min，总流速保持1.0ml/min；流动相A和B经过混合器混合后进入色谱柱进行洗脱。
1.3测定波长的选择
分别在205nm、210nm、220nm、230nm、250nm、280nm、300nm和320nm波长下检测，结果在205nm、210nm、220nm、230nm波长下检测，检出的色谱峰较多，以210nm处色谱峰的信号较强，且基线较平，所以选择210nm为检测波长。
1.4色谱柱的选择
试验了多种C18反相色谱柱，如：Kromasil 100-5 C18(150×4.6mm)柱、日本岛津Shim-pack VP-ODS(150×4.6mm)柱、Luna 5u C18(2)(150×4.60mm)柱、Luna 5u C18(2)100A(250×4.6mm)柱、Hypersil ODS 2 5μm(250mm×4.6mm)柱和AichromBond-1 C18(250mm×4.6mm)柱等。其中以柱长为250mm左右的色谱柱分离效果最好，所以优选柱长为250mm的C18反相色谱柱，尤以Luna5u C18(2)100A(250×4.60mm)柱为佳。
1.5色谱条件的确定
综合上述各试验考察结果，可优选黄芪颗粒的HPLC检测色谱条件如下：
色谱柱：柱长为250mm的C18反相色谱柱，本实施例采用Luna 5u C18(2)100A(250×4.60mm)柱；
检测波长：210nm；
柱温：30℃；
流动相A：3％的乙腈水溶液；流动相B：60％的乙腈水溶液；
洗脱：采用下述梯度洗脱方式：
在100min内，流动相A的流速从1.0ml/min匀速减至0ml/min，流动相B则从0ml/min匀速增至1.0ml/min，总流速保持1.0ml/min；流动相A和B经过混合器混合后进入色谱柱进行洗脱。
2供试品溶液的制备
2.1提取溶剂的选择
称取黄芪颗粒3.0g，分别加入95％甲醇、95％乙醇各50ml，超声处理20分钟，滤过，用同种溶剂洗涤滤渣、滤纸和漏斗，洗液并入滤液中，置水浴上挥干，残渣分别用90％甲醇转移至10ml量瓶中，加同种溶剂稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液10μl，按前述优选的色谱条件测定，记录色谱图。结果甲醇提出组分的量较多，所以选择甲醇作为提取溶剂。
2.2提取方式的选择
称取黄芪颗粒3.0g，加入95％甲醇50ml，分别采用浸泡过夜、超声提取(功率250W，频率40kHz)30分钟和回流2小时三种提取方式，按前述优选的色谱条件测定。结果以超声30分钟提出的量最多，故选择超声提取的方式。
2.3超声提取时间的选择
称取黄芪颗粒3.0g，加入95％甲醇50ml，分别超声提取(功率250W，频率40kHz)10、20、30、40、60分钟，按前述优选的色谱条件测定。结果不同提取时间提出组分的量无显著差异，以20-40分钟的略优。
2.4供试品溶液的制备方法
经以上试验后可优选供试品溶液的制备方法如下：
取黄芪颗粒，研细，称取1.0～10.0g，加入80～95％甲醇20～150ml，超声处理(功率250W，频率40kHz)20～40分钟，滤过，用适量80～95％甲醇洗涤滤渣、滤纸和漏斗，洗液并入滤液中，置水浴上挥干，残渣用80～95％的甲醇转移至至5～25ml量瓶中，加同种溶剂稀释至刻度，摇匀，放置0.4h～1.0h后，用微孔滤膜(微孔直径0.35～0.55μm)滤过，取续滤液，即得。
放置0.4h～1.0h后过滤是为了使组分的溶解达到平衡，否则滤液放置数小时后会变浑浊。
本实施例采用的供试品溶液的制备方法如下：
取黄芪颗粒，研细，称取3.0g，加入90％甲醇50ml，超声处理(功率250W，频率40kHz)20分钟，滤过，用适量90％甲醇洗涤滤渣、滤纸和漏斗，洗液并入滤液中，置水浴上挥干，残渣用90％的甲醇转移至至10ml量瓶中，加同种溶剂稀释至刻度，摇匀，放置0.5h后，用微孔滤膜(微孔直径0.45μm)滤过，取续滤液，即得。
3色谱峰的鉴定和定位
3.1参照峰的确定
本品中含有黄芪甲苷、芒柄花素等成分。但在本实验条件下，黄芪甲苷的色谱峰信号很弱，而另一有效成分芒柄花素的色谱峰信号相对较强，且其对照品在中国药品生物制品检定所有售，故选择芒柄花素作为参照物。试验中以芒柄花素峰的保留时间为参比，计算其他色谱峰对芒柄花素峰的相对保留时间，以相对保留时间对色谱峰进行辨认。
3.2色谱峰的编号
以芒柄花素色谱峰的保留时间为参照，计算各色谱峰的相对保留时间，以相对保留时间对色谱峰进行辨认，并对19个色谱峰进行了编号(见图3)。
3.3色谱峰的鉴定
采用液相色谱-质谱联用法(LC-MS)测定色谱图中各峰的分子量，结合文献报道黄芪化学成分的结构和分子量，对色谱峰进行鉴定。测定条件如下：
色谱条件：按照前述本发明优选的色谱条件。
质联仪：Agilent 1100液质联用仪；离子源：ESI(-)；扫描范围：m/z 250～930；雾化气流速(NEB)：8L/min；气帘气流速(CUR)：9L/min；离子源温度(TEM)：500.0℃；喷雾电压：-4500.0V；去簇电压(DP)：-60.0V(选择离子模式采用-60.0和-10.0V)；聚焦电压(FP)：-325.0V；入口电压(EP)：-9.0V。采用全扫描和选择离子两种模式，记录色谱图、质谱图。根据组分的分子量，有8个主要的共有峰可鉴定，鉴定结果见下述表9：
表9黄芪颗粒指纹图谱中可鉴定的8个主要成分
Figure A20081004568100231
4方法验证
4.1专属性
取黄芪颗粒的阴性对照品，按前述供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液。分别取90％甲醇、阴性对照溶液、供试品溶液和芒柄花素对照品溶液各10μl进样，记录色谱图。结果表明，溶剂90％甲醇和阴性对照溶液对样品测定均无干扰。
4.2进样精密度
取供试品溶液10μl，按前述已确定的测定方法，重复进样6次，记录色谱图。以6次进样相应色谱峰的平均峰面积为对照模式，计算各指纹图谱与对照模式的夹角余弦(结果见下述表10)。结果表明，6次进样指纹图谱与对照模式的夹角余弦均大于0.99，说明进样的精密度良好。
表10黄芪颗粒(有糖型)指纹图谱进样精密度夹角余弦
Figure A20081004568100232
4.3日内精密度
取供试品溶液10μl，按前述已确定的测定方法，分别于同一日内0、2、4、6、8小时进样，记录色谱图。以5次相应色谱峰的平均峰面积为对照模式，计算各指纹图谱与对照模式的夹角余弦(结果见下述表11)。结果表明，同一日内0～8小时进样的指纹图谱与对照模式的夹角余弦均大于0.99，说明本法日内精密度良好。
表11黄芪颗粒(有糖型)指纹图谱日内精密度夹角余弦
Figure A20081004568100242
Figure A20081004568100251
4.4日间精密度
取供试品溶液10μl，按前述已确定的测定方法，分别于0、1、2、3天进样，记录色谱图。以相应色谱峰的平均峰面积为对照模式，计算各指纹图谱与对照模式的夹角余弦(结果见下述表12)。结果表明，0～3天进样的指纹图谱与对照模式的夹角余弦均大于0.99，说明本法日间精密度良好。
表12黄芪颗粒(有糖型)指纹图谱日间精密度夹角余弦
Figure A20081004568100252
Figure A20081004568100261
4.5重复性
取黄芪颗粒，按前述已确定的方法制备供试品溶液，共6份，分别取10μl进样，记录色谱图。以相应色谱峰的平均峰面积为对照模式，计算各指纹图谱与对照模式的夹角余弦(结果见下述表13)。结果表明，各指纹图谱与对照模式的夹角余弦均大于0.99，说明本法重复性良好。
表13黄芪颗粒(有糖型)指纹图谱重复性夹角余弦
Figure A20081004568100271
4.6耐用性
取供试品溶液10μl，分别使用Luna 5u C18(2)100A(250×4.60mm)柱、Hypersil ODS2 5μm(250mm×4.6mm)和AichromBond-1 C18(250mm×4.6mm，5μm)等三种牌号的色谱柱，按前述已确定的测定方法，记录色谱图。结果三种色谱柱的分离效果接近，分离均较好。
5标准指纹图谱的建立
参照高效液相色谱法(中国药典(2005年版)一部附录VID)及《中药注射剂色谱指纹图谱实验研究技术指南(试行)》，取有代表性的黄芪颗粒(有糖型)10批，按前述已确定的测定方法(即按照实施例3进行检测)，检测得到黄芪颗粒10批样品的指纹图谱。以测得结果的平均峰面积为对照模式，计算得标准指纹图谱。
6样品指纹图谱的测定及相似度的计算
另取3批黄芪颗粒样品，按前述已确定的测定方法，得到黄芪颗粒样品的指纹图谱，计算各色谱峰的相对保留时间，以相对保留时间对色谱峰进行定位；按峰面积，计算与标准指纹图谱的夹角余弦(结果见下述表14)。结果表明，黄芪颗粒样品与标准指纹图谱的夹角余弦均大于0.9，相似度良好。
表14黄芪颗粒(有糖型)3批样品与标准指纹图谱夹角余弦
Figure A20081004568100272
Figure A20081004568100281
黄芪药材、黄芪浸膏、黄芪颗粒(无糖型)的供试品溶液制备方法、HPLC检测色谱条件等，均通过与上述实施例5中黄芪颗粒(有糖型)指纹图谱检测方法的确定过程相同/相似的试验研究及对比分析等过程，从而最终确定了如本发明所述的技术方案，并经过上述专属性、精密度、重复性、耐用性等方法验证，从而参照高效液相色谱法(中国药典(2005年版)一部附录VI D)及《中药注射剂色谱指纹图谱实验研究技术指南(试行)》，在检测所得大量色谱图的基础上，通过计算分析，得到黄芪材、黄芪浸膏、黄芪颗粒(无糖型)的标准指纹图谱，并计算各样品与标准指纹图谱的夹角余弦，结果均大于0.9，相似度良好。
本发明申请文件中，所有涉及到液体浓度时的“％”，均是指体积百分比浓度；所有涉及到如甲醇(溶液)、乙醇(溶液)的描述，当其浓度不是100％时，均是指其与水的混合溶液。

Claims (7)

1.黄芪药材、中间体及其制剂的指纹图谱检测方法，包括下述主要步骤：
(1)对照品溶液的制备：
称取芒炳花素对照品，置于容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制成对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：
黄芪药材供试品溶液的制备：称取黄芪药材粉末，加80～95％甲醇超声处理10～60min，滤过，用80～95％甲醇洗涤滤渣、滤纸和漏斗，洗液并入滤液中，置水浴上挥干，残渣用80～95％的甲醇转移至量瓶中，加同种溶剂稀释至刻度，摇匀，放置0.4h～1.0h，用微孔直径为0.35-0.55μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得黄芪药材供试品溶液；
黄芪中间体供试品溶液的制备：称取黄芪中间体，置量瓶中，加80～95％甲醇不超过刻度，超声处理10～60min，加同种溶剂至刻度，摇匀，用微孔直径为0.35-0.55μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得黄芪中间体供试品溶液；
黄芪制剂供试品溶液的制备：取黄芪制剂，研细，称取，加80～95％甲醇超声处理10～60min，滤过，用80～95％甲醇洗涤滤渣、滤纸和漏斗，洗液并入滤液中，置水浴上挥干，残渣用80～95％的甲醇转移至量瓶中，加同种溶剂稀释至刻度，摇匀，放置0.4h～1.0h后，用微孔直径为0.35-0.55μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得黄芪制剂供试品溶液；
(3)HPLC检测：
分别吸取上述对照品溶液和各供试品溶液，分别注入高效液相色谱仪中，记录色谱图；
其中，色谱条件为：
色谱柱为C18反相色谱柱；柱温为30℃；检测波长为210nm；流动相A为体积百分比为3％的乙腈水溶液，流动相B为体积百分比为60％的乙腈水溶液，总流速为1.0ml/min；
采用下述梯度洗脱方式洗脱：
在100min内，流动相A的流速从1.0ml/min匀速减至0ml/min，流动相B则从0ml/min匀速增至1.0ml/min，总流速保持为1.0ml/min；流动相A和B经过混合器混合后进入色谱柱进行洗脱。
2.根据权利要求1所述的黄芪药材、中间体及其制剂的指纹图谱检测方法，其特征在于：所述步骤(2)供试品溶液的制备按照下述方法进行：
黄芪药材供试品溶液的制备：称取黄芪药材粉末1.0～5.0g，加80～95％甲醇20～150ml超声处理20～40min，滤过，用同种溶剂洗涤滤渣、滤纸和漏斗，洗液并入滤液中，置水浴上挥干，残渣用80～95％的甲醇转移至5～25ml量瓶中，加同种溶剂稀释至刻度，摇匀，放置0.4h～1.0h，用微孔直径为0.35-0.55μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得黄芪药材供试品溶液；
黄芪中间体供试品溶液的制备：称取黄芪浸膏2.0～10.0g，置25～50ml量瓶中，加80～95％甲醇不超过刻度，超声处理20～40min，加同种溶剂至刻度，摇匀，用微孔直径为0.35-0.55μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得黄芪中间体供试品溶液；
黄芪制剂供试品溶液的制备：取黄芪颗粒，研细，称取1.0～10.0g，加80～95％甲醇20～150ml，超声处理20～40min，滤过，用同种溶剂洗涤滤渣、滤纸和漏斗，洗液并入滤液中，置水浴上挥干，残渣用80～95％的甲醇转移至5～25ml量瓶中，加同种溶剂稀释至刻度，摇匀，放置0.4h～1.0h，用微孔直径为0.35-0.55μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得黄芪制剂供试品溶液。
3.根据权利要求1所述的黄芪药材、中间体及其制剂的指纹图谱检测方法，其特征在于：所述步骤(3)中的色谱柱是柱长为250mm的C18反相色谱柱。
4.黄芪药材的标准指纹图谱，其特征在于：
以色谱图中的芒柄花素峰为参照，计算得黄芪药材标准指纹图谱中各色谱峰的相对保留时间及相对峰面积分别如下：
相对保留时间：
1号峰：0.087-0.087；     2号峰：0.090-0.096；   3号峰：0.101-0.102；
4号峰：0.115-0.117；     5号峰：0.179-0.182；   6号峰：0.191-0.199；
7号峰：0.201-0.253；     8号峰：0.255-0.283；   9号峰：0.284-0.406；
10号峰：0.545-0.548；    11号峰：0.607-0.633；  12号峰：0.707-0.711；
13号峰：0.714-0.718；    14号峰：0.748-0.752；  15号峰：0.767-0.770；
15’号峰：0.796-0.800；  16号峰：0.959-0.983；  17号峰：1.000；
18号峰：1.014-1.016；  19号峰：1.028-1.028；  19’号峰：1.044-1.046；
相对峰面积：
1号峰：0.176-0.409；     2号峰：0.170-0.224；   3号峰：0.132-0.487；
4号峰：0.405-0.558；     5号峰：0.946-1.166；   6号峰：0.242-0.334；
7号峰：0.166-0.844；     8号峰：0.376-1.365；   9号峰：0.423-0.526；
10号峰：0.680-2.616；    11号峰：0.359-0.468；  12号峰：0.398-0.810；
13号峰：0.214-0.402；    14号峰：0.694-2.144；  15号峰：0.467-1.333；
15’号峰：1.286-2.381；  16号峰：0.151-0.478；  17号峰：1.000；
18号峰：0.127-0.515；    19号峰：1.653-2.329；  19’号峰：2.556-8.264。
5.黄芪中间体的标准指纹图谱，其特征在于：
以色谱图中的芒柄花素峰为参照，计算得黄芪浸膏标准指纹图谱中各色谱峰的相对保留时间及相对峰面积分别如下：
相对保留时间：
1号峰：0.086-0.089；    2号峰：0.093-0.101；   3号峰：0.100-0.108；
4号峰：0.112-0.120；    5号峰：0.125-0.140；   6号峰：0.195-0.228；
7号峰：0.205-0.238；    8号峰：0.271-0.287；   9号峰：0.284-0.313；
9’号峰：0.534-0.545；  10号峰：0.551-0.556；  11号峰：0.602-0.606：
12号峰：0.708-0.711；   13号峰：0.747-0.750；  14号峰：0.764-0.768；
15号峰：0.798-0.801；   16号峰：1.000；        17号峰：1.014-1.016；
18号峰：1.030-1.031；   19号峰：1.043-1.046；
相对峰面积：
1号峰：0.717-2.361；   2号峰：0.509-0.809；   3号峰：0.142-0.422；
4号峰：0.296-0.707；   5号峰：1.146-1.967；   6号峰：5.987-8.195；
7号峰：1.944-3.804；   8号峰：1.838-2.711；   9号峰：0.957-1.963；
9’号峰：0.539-0.992； 10号峰：2.667-5.310；  11号峰：0.487-1.052；
12号峰：0.781-1.530；  13号峰：2.553-5.016；  14号峰：1.364-2.018；
15号峰：3.195-4.235；  16号峰：1.000；        17号峰：0.256-0.425；
18号峰：2.449-3.132；  19号峰：2.520-3.176。
6.黄芪制剂的标准指纹图谱，其特征在于：
以色谱图中的芒柄花素峰为参照，计算得有糖型黄芪颗粒标准指纹图谱中各色谱峰的相对保留时间及相对峰面积分别如下：
相对保留时间：
1号峰：0.082-0.087；   2号峰：0.086-0.091；   3号峰：0.093-0.098；
4号峰：0.099-0.106；   5号峰：0.115-0.122；   6号峰：0.180-0.193；
7号峰：0.194-0.213；   8号峰：0.261-0.271；   9号峰：0.289-0.297；
10号峰：0.548-0.555；  11号峰：0.604-0.609；  12号峰：0.709-0.713；
13号峰：0.748-0.753；  14号峰：0.766-0.771；  15号峰：0.797-0.801；
16号峰：1.000；        17号峰：1.014-1.015；  18号峰：1.028-1.030；
19号峰：1.043-1.045；
相对峰面积：
1号峰：0.741-1.403；   2号峰：0.703-1.184；   3号峰：0.141-0.262；
4号峰：0.381-0.578；   5号峰：1.283-2.638；   6号峰：5.665-7.764；
7号峰：1.917-3.245；   8号峰：1.851-3.210；   9号峰：1.040-1.834；
10号峰：3.239-5.710；  11号峰：0.433-0.940；  12号峰：0.775-1.515；
13号峰：3.047-5.159；  14号峰：1.298-1.929；  15号峰：3.244-3.823；
16号峰：1.000；        17号峰：0.306-0.389；  18号峰：2.778-3.254；
19号峰：2.745-3.631。
7.黄芪制剂的标准指纹图谱，其特征在于：
以色谱图中的芒柄花素峰为参照，计算得无糖型黄芪颗粒标准指纹图谱中各色谱峰的相对保留时间及相对峰面积分别如下：
相对保留时间：
1号峰：0.086-0.088；   2号峰：0.090-0.095；   3号峰：0.098-0.101；
4号峰：0.104-0.111；   5号峰：0.119-0.128；   6号峰：0.187-0.207；
7号峰：0.199-0.218；   8号峰：0.263-0.278；   9号峰：0.291-0.304；
10号峰：0.552-0.555；  11号峰：0.605-0.612；  12号峰：0.710-0.717；
13号峰：0.749-0.757；  14号峰：0.766-0.775；  15号峰：0.798-0.801；
16号峰：1.000；        17号峰：1.015-1.017；  18号峰：1.030-1.032；
19号峰：1.045-1.046；
相对峰面积：
1号峰：1.299-2.044；    2号峰：0.539-1.120；   3号峰：0.065-0.197；
4号峰：0.319-0.523；    5号峰：1.173-2.162；   6号峰：2.734-6.119；
7号峰：1.902-3.671；    8号峰：1.524-3.015；   9号峰：0.790-1.534；
10号峰：3.345-7.457；   11号峰：0.474-1.241；  12号峰：0.937-2.030；
13号峰：3.5081-7.899；  14号峰：1.358-2.577；  15号峰：3.431-3.841；
16号峰：1.000；         17号峰：0.320-0.529；  18号峰：3.004-3.442；
19号峰：2.990-4.135。
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