CN110658295A - 二冬汤组方中荷叶饮片指纹图谱测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明二冬汤组方中荷叶饮片指纹图谱测定方法,采用指纹图谱检定技术,对二冬汤中荷叶饮片有效成分进行科学的鉴别和整体表征,具有检测全面、操作简便的特点。本发明所采用的色谱柱能对荷叶中黄酮类成分和生物碱同时进行轮廓分析,所得指纹图谱信息量较大,本发明能够快速、准确的鉴别样品质量优劣,有效控制荷叶饮片的质量,保证了二冬汤质量稳定性。
Description
技术领域
本发明属中药分析技术领域,具体涉及二冬汤组方中荷叶饮片指纹图谱测定方法。
背景技术
二冬汤,中医方剂名,出自《医学心悟》卷三。具有养阴清热,生津止渴之功效。主治上消,渴而多饮;肺热咳嗽,痰少等症。症见咳嗽痰少、口渴多饮、舌红、脉细数。临床上常用于治疗糖尿病、百日咳、肺结核、慢性支气管炎、阴虚咳嗽等。该药是由天冬(去心),麦冬(去心),花粉、黄芩、知母、荷叶、甘草、人参组成。方中麦冬、天冬、花粉为君药,具有养阴清肺,生津润燥之功效;黄芩、知母、荷叶为臣药,具有清除肺热之功效;人参为;佐药,甘草为使药,具有补益肺气之功效。全方扶正祛邪并用,共奏养阴清热、生津止渴之效。
组方中荷叶为睡莲科植物莲Nelumbo nucifera Gaertn的叶,多年生水生草本,生于水泽、池塘、湖诏和水田里,野生或栽培,广布于南北各地,荷叶含有莲碱、原荷叶碱和荷叶碱等多种生物碱及微生物C,中医学认为,荷叶性味苦涩,平,归肝、脾、胃、心经,有清热解毒、凉血、止血等作用。可以治疗头痛眩晕,水肿,食少腹胀,泻痢,脱肛,吐血,便血,崩漏,损伤疲血等病症。
大多数具有清热解毒、凉血、止血等功效的中药复方制剂中含有荷叶饮片,如荷丹片,何丹胶囊等。荷叶的真伪和质量的优劣严重影响了其制剂的质量和疗效,利用现有技术对于荷叶的含量检测和质量鉴定现有纤维显微鉴别及生物碱含量测定等,还远远不能保证荷叶的质量鉴定。
指纹图谱技术是一种综合的、可量化的鉴定手段,它是建立在中药化学成分系统研究的基础上,主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性,具有非常的唯一性。已有的反相C18色谱柱对于生物碱的分离条件较为复杂,导致无法同时对生物碱和其它成分进行指纹分析。
公布号为CN105203690A的发明专利“一种荷丹制剂的指纹图谱测定方法”,公开了一种荷丹制剂的指纹图谱测定方法,其方法包括建立标准对照指纹图谱、测定待检样品指纹图谱,将标准对照指纹图谱和待检样品指纹图谱进行比对,来鉴别待检样品是否合格。其指纹图谱的建立,有助于监控荷丹制剂的质量,保证药品质量稳定性和均一性。但是,此发明专利申请只是对含有荷叶药材的何丹制剂建立了一种指纹图谱的鉴别方法,对于含有荷叶饮片的其他复方制剂来说,是否也可以用上述方法进行指纹图谱检定,并没有进行详细的研究,也就是说没有广泛性。另外,现已有的文献(《亚太传统医药》陈天玲等人2017年11月第13卷第22期“不同产地荷叶药材HPLC指纹图谱研究”)报道了检测方法为:色谱柱为Kromasilc18(250mm×4.6mm);以乙腈(A)-水(B,含0.2%磷酸和0.2%三乙胺)为流动相,梯度洗脱,流速为1.0ml/min;柱温为30℃;检查波长270nm。结果:以槲皮素为对照品,通过测定10批荷叶药材样品,确定了10个共有峰,10批荷叶样品指纹图谱与对照指纹图谱相似度均在0.85以上。本发明人按该“文献报道”所述的方法进行了试验,发现用该发法并不能够同时检测出生物碱和黄酮类成分。
发明内容
二冬汤组方中荷叶饮片的指纹图谱测定方法,是发明人在对二冬汤进行药物分析和质量标准研究所得,本发明可以采用一种色谱条件能同时检测其中主要的活性成分黄酮类和生物碱类,且对其中共有峰均进行成分指认,所建立的方法适合对荷叶质量的整体控制。
为实现上述目的,本发明提供如下技术方案。
二冬汤组方中荷叶饮片指纹图谱测定方法,所述测定方法包括以下步骤:
1、建立标准对照指纹图谱
(1)供试品溶液制备:
取荷叶饮片粉末约0.3g,加20~40mL甲醇,超声提取0.5~2.0h,11000~15000r·min-1离心5~15分钟,取上清液3~7mL,置于10mL容量瓶中,定容,即得。
所述加20~40mL甲醇,优选30mL。
所述超声提取0.5~2.0h,优选1.0h。
所述11000~15000r·min-1,离心5~15分钟,优选12000r·min-1,离心10分钟。
所述取上清液3~7mL,优选5mL。
(2)获得色谱图:
将步骤(1)制备的供试品溶液,注入高效液相色谱仪,获得色谱图,色谱条件如下:
色谱柱为Xcharge柱,柱温20~45℃;流速为0.5~2mL·min-1;检测波长为180~360nm,进样量8-12μL,流动相A为甲酸水,流动相B为甲酸乙腈溶液,梯度洗脱10~70min;所述色谱柱为Xcharge柱,是指色谱柱为Xcharge柱(250×4.6mm,5μm)。
所述柱温20~45℃,优选柱温为40℃。
所述流速为0.5~2mL·min-1,优选1.0mL·min-1。
所述检测波长为180~360nm,优选270nm。
所述进样量8-12μl,优选10μL。
所述流动相A为甲酸水,是指流动项为0.1%甲酸水;
所述流动相B为甲酸乙腈溶液,是指0.1%甲醇乙腈溶液。
所述梯度洗脱10-70min,是指洗脱时间为0~10min时,甲酸乙腈浓度由10%上升为13%;10~13min时,甲酸乙腈浓度由13%上升为20%;13~15min时,甲酸乙腈浓度由20%上升为30%;15~25min时,甲酸乙腈浓度由30%上升至40%,
2、建立标准对照指纹图谱
2.1选取15批荷叶饮片色谱图,建立标准对照指纹图谱;
3、测定待检样品指纹图谱,
将步骤1和步骤3得到的指纹图谱进行相似度比对,鉴别待检样品是否合格。
进一步,所述测定待检样品指纹图谱的方法为:
取荷叶饮片粉末约0.3g,加30mL甲醇,超声提取1h,12000r·min-1,离心10min,取上清液5mL置于10mL容量瓶中,定容,用0.45μm微孔滤膜过滤,取续滤液,注入高效液相色谱仪,在步骤(2)所述的色谱条件下进行分析,记录色谱图,图谱采用药典委推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A)”软件进行色谱峰匹配,计算谱图的相似度,相似度≥0.9,即为合格产品,相似度≤0.9,即为不合格产品。
有益效果
本发明二冬汤组方中荷叶饮片指纹图谱测定方法,采用指纹图谱检定技术,对二冬汤中荷叶饮片有效成分进行科学的鉴别和整体表征,具有检测全面、操作简便的特点。本发明所采用的色谱柱能对荷叶中黄酮类成分和生物碱同时进行轮廓分析,所得指纹图谱信息量较大,本发明能够快速、准确的鉴别样品质量优劣,有效控制荷叶饮片的质量,保证了二冬汤质量稳定性。
附图说明
图1:本发明中15批次的荷叶饮片指纹图谱
图2:本发明的待检测荷叶饮片指纹图谱
图1、2中:1为N-甲基衡州乌药碱;2为N-甲基异衡州乌药碱;3为杏黄罂粟碱;4为衡州乌药碱;5为O-去甲基荷叶碱;6为N-去甲基荷叶碱;7为荷叶碱;8为莲碱;9为异槲皮苷;10为金丝桃苷;11为槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,虽然所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例,但是基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例一
二冬汤组方中荷叶饮片指纹图谱测定方法,包括以下步骤:
1、仪器:
ACCHROM S6000型高效液相色谱仪(华谱科仪(北京)科技有限公司生产);
2、荷叶饮片:
荷叶饮片共15批,见表1,购于湖南、江西、山东等地;
表1 荷叶饮片产地信息
3、试剂:
乙腈为色谱纯(Fisher),其余试剂均为分析纯,水为娃哈哈纯净水。
一、建立标准对照指纹图谱
1、供试品溶液制备
取表1中编号为HYYP01的荷叶饮片粉末约0.3g,加30mL甲醇,超声提取1h,12000r·min-1,离心10min,取上清液5mL置于10mL容量瓶中,定容,用0.45μm微孔滤膜过滤,初滤液,备用;
2、获得色谱图
取步骤1制备的初滤液10μL,注入高效液相色谱仪,获得色谱图,色谱条件如下:色谱柱为Xcharge柱,柱温40℃,流速为1mL·min-1,检测波长为270nm,进样量10μL,流动相A为0.1%甲酸水,流动相B为0.1%甲酸乙腈溶液,梯度洗脱10-70min;
3、建立标准对照指纹图谱
取表1中其他14个不同编号的荷叶饮片,分别按照步骤1供试品溶液制备方法进行制备,获得色谱图,如图1所示。通过比较15个色谱图,确定11个共有峰,包括8个生物碱和3个主要黄酮类成分。经质谱仪分析并计算各共有峰的相对峰面积,如表2所示;
表2(附后)
二、测定待检样品指纹图谱
1、取荷叶饮片(湖南益阳产)约0.3g,加30mL甲醇,超声提取1h,12000r·min-1,离心10min,取上清液5mL置于10mL容量瓶中,定容,用0.45μm微孔滤膜过滤,取初滤液,备用;
2、获得色谱图
将步骤1制备的供试品溶液的初滤液10μL,注入高效液相色谱仪,获得色谱图,如图2所示。色谱条件如下:色谱柱为Xcharge柱,柱温40℃;流速为1mL·min-1;检测波长为270nm,进样量10μL,流动相A为0.1%甲酸水,流动相B为0.1%甲酸乙腈溶液,梯度洗脱10-70min;得指纹色谱图,所得指纹谱图采用药典委推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A)”软件进行色谱峰匹配,计算色谱图的相似度,通过“相似度计算”功能进行相似度评价,结果显示相似度≥0.9,即待检测荷叶饮片为合格产品。
此外,应当理解,虽然本说明书按照实施方式加以描述,但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案,说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见,本领域技术人员应当将说明书作为一个整体,各实施例中的技术方案也可以经适当组合,形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (16)
1.二冬汤组方中荷叶饮片指纹图谱测定方法,其特征在于所述测定方法包括以下步骤:
1.1供试品溶液制备:
取荷叶饮片粉末约0.3g,加20~40mL甲醇,超声提取0.5~2.0h,11000~15000r·min-1离心5~15分钟,取上清液3~7mL,置于10mL容量瓶中,定容,即得,
1.2获得色谱图:
将步骤1.1制备的供试品溶液,注入高效液相色谱仪,获得色谱图,色谱条件如下:
色谱柱为Xcharge柱,柱温20~45℃;流速为0.5~2mL·min-1;检测波长为180~360nm,进样量8-12μL,流动相A为甲酸水,流动相B为甲酸乙腈溶液,梯度洗脱10~70min;1.3建立标准对照指纹图谱:
选取15批荷叶饮片色谱图,建立标准对照指纹图谱;
1.4测定待检样品指纹图谱,将权利要求1.2和1.3得到的指纹图谱进行相似度比对,鉴别待检样品是否合格。
2.根据权利要求1所述的二冬汤组方中荷叶饮片指纹图谱测定方法,其特征在于所述供试品溶液制备方法为:取荷叶饮片粉末约0.3g,加30mL甲醇,超声提取1h,12000r·min-1,离心10min,取上清液5mL置于10mL容量瓶中,定容,用0.45μm微孔滤膜过滤,取续滤液,即得。
3.根据权利要求1所述二冬汤组方中荷叶饮片指纹图谱测定方法,其特征在于测定待检样品指纹图谱的方法为:取荷叶饮片粉末约0.3g,加30mL甲醇,超声提取1h,12000r·min-1,离心10min,取上清液5mL置于10mL容量瓶中,定容,用0.45μm微孔滤膜过滤,取续滤液,注入高效液相色谱仪,在权利要求1.2所述的色谱条件下进行分析,记录10-70min色谱图,即得。
4.根据权利要求1.4所述的二冬汤组方中荷叶饮片指纹图谱测定方法,其特征在于所述指纹图谱进行相似度比对的方法为:图谱采用药典委推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A)”软件进行色谱峰匹配,计算谱图的相似度,相似度≥0.9,即为合格产品,相似度≤0.9,即为不合格产品。
5.根据权利要求1.1所述加20~40mL甲醇,其特征在于优选30mL。
6.根据权利要求1.1所述超声提取0.5~2.0h,其特征在于优选1.0h。
7.根据权利要求1.1所述11000~15000r·min-1,离心5~15分钟,其特征在于优选12000r·min-1,离心10分钟。
8.根据权利要求1.1所述取上清液3~7mL,其特征在于优选5mL。
9.根据权利要求1.2所述色谱柱为Xcharge柱,其特征在于是指色谱柱为Xcharge柱(250×4.6mm,5μm)。
10.根据权利要求1.2所述柱温20~45℃,其特征在于优选柱温为40℃。
11.根据权利要求1.2所述流速为0.5~2mL·min-1,其特征在于优选1.0mL·min-1。
12.根据权利要求1.2所述检测波长为180~360nm,其特征在于优选270nm。
13.根据权利要求1.2所述进样量8-12μl,其特征在于优选10μL。
14.根据权利要求1.2所述流动相A为甲酸水,其特征在于是指流动项为0.1%甲酸水。
15.根据权利要求1.2所述流动相B为甲酸乙腈溶液,其特征在于是指0.1%甲醇乙腈溶液。
16.根据权利要求1.2所述梯度洗脱10-70min,其特征在于是指洗脱时间为0~10min时,甲酸乙腈浓度由10%上升为13%;10~13min时,甲酸乙腈浓度由13%上升为20%;13~15min时,甲酸乙腈浓度由20%上升为30%;15~25min时,甲酸乙腈浓度由30%上升至40%。
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