CN109521106A

CN109521106A - 一种同时检测黄芪桂枝五物颗粒中四种成分含量的方法

Info

Publication number: CN109521106A
Application number: CN201811258699.6A
Authority: CN
Inventors: 朱立彬; 陈骞; 曾庆恢; 黄志军; 赵刚; 翟莉; 陈鹏; 李霞
Original assignee: Jianmin Pharmaceutical Groups Corp Ltd
Current assignee: Jianmin Pharmaceutical Groups Corp Ltd
Priority date: 2018-10-26
Filing date: 2018-10-26
Publication date: 2019-03-26

Abstract

本发明公开了一种同时检测黄芪桂枝五物颗粒中四种成分含量的方法，所述四种成分为芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、桂皮醛、6‑姜辣素，该方法包括将待测样品用提取溶剂30～80％甲醇提取，提取液过滤后直接上高效液相色谱仪进行检测的步骤。本发明能同时检测出黄芪桂枝五物颗粒中四种物质的含量，具有高效、准确等优点，使黄芪桂枝五物颗粒的质量更加可控。

Description

一种同时检测黄芪桂枝五物颗粒中四种成分含量的方法

技术领域

本发明涉及黄芪桂枝五物颗粒的含量测定方法，属于药物分析领域。

背景技术

黄芪桂枝五物颗粒，源自《金匮要略》中黄芪桂枝五物汤，由黄芪、桂枝、芍药、生姜、大枣五味中药材制成，原文记载功能主治：“血痹阴阳俱微，寸口关上微，尺中小紧，外证身体不仁，如风痹状，黄芪桂枝五物汤主之”。

药品质量关系着人类的生命安全，现有的中药质量主要通过鉴别或1～2种成分的含量测定来进行控制，然而，中药的疗效是通过多成分、多靶点综合作用的产生的，现有的中药质量控制存在很大的局限性，不能全面表征药物的质量，导致中药掺假、伪劣现象频发，不仅无法保证疗效，还严重威胁患者的用药安全。因此，有必要对中药中更多成分的含量进行测定以进一步严格控制药物质量。

目前，《中国药典》2015年版已分别收载黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、桂枝中桂皮醛、芍药中芍药苷、生姜中6-姜辣素的HPLC含量测定方法，但由于检测对象和HPLC条件不同，导致无法对黄芪桂枝五物颗粒中的四种成分进行检测。

发明内容

本发明的目的是针对上述缺陷，提供一种检测黄芪桂枝五物颗粒中四种成分含量的方法，该方法能在一个条件下同时检测出黄芪桂枝五物颗粒中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芍药苷、桂皮醛、6-姜辣素四种成分的含量，具有高效、准确等优点。

该方法包括将待测样品用提取溶剂30～80％甲醇提取，提取液过滤后直接上高效液相色谱仪进行检测的步骤，所述高效液相色谱仪含有紫外检测器，所述紫外检测器的设定检测波长为210～250nm，所述高效液相色谱仪的色谱柱为C18色谱柱，流动相为重量浓度为0.02～0.3％的磷酸水溶液与乙腈的混合液，采用梯度洗脱，柱温为20-40℃，理论板数按芍药苷峰计应不低于4000。

优选地，所述提取溶剂为50％甲醇。

进一步优选地，所述提取溶剂中还含0.5％体积的聚山梨酯80。

优选地，所述紫外检测器的设定检测波长为220nm。

优选地，所述流动相为重量浓度为0.1％的磷酸水溶液与乙腈的混合液。

优选地，所述梯度洗脱中，各时间段及流动相中乙腈所占的体积比分别为：0～15min，乙腈15～25％；15～40min，乙腈25～70％。

本发明中所涉及的甲醇浓度均为体积浓度，如50％甲醇指的是每100ml甲醇水溶液中含有甲醇50ml。

本发明的有益效果是：采用本发明提供的方法能同时检测出黄芪桂枝五物颗粒中四种物质的含量，检测效率高，速度快，费用低，所采用的色谱条件分离效果好，出峰时间短，检测结果重现性好，准确度高。采用该方法使黄芪桂枝五物颗粒的质量更加可控。

附图说明

图1采用最佳条件得到的高效液相色谱图。

图2实施例1中以50％甲醇为提取溶剂得到的高效液相色谱图。

图3实施例2中采用200nm检测波长得到的高效液相色谱图。

图4实施例2中采用230nm检测波长得到的高效液相色谱图。

图5实施例2中采用260nm检测波长得到的高效液相色谱图。

图6实施例2中采用280nm检测波长得到的高效液相色谱图。

图7实施例4中流动相梯度洗脱条件为(2)时得到的高效液相色谱图。

图8实施例4中流动相梯度洗脱条件为(3)时得到的高效液相色谱图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行详细地说明。各实施例中的试验对象黄芪桂枝五物颗粒均由黄芪、桂枝、白芍、生姜、大枣五味中药材制成，辅料是蔗糖与糊精，由健民药业集团股份有限公司提供。

实施例1样品溶液制备方法的选择

在HPLC检测中，样品溶液制备主要是根据待测成分的极性、溶解性、稳定性等性质选择适当的提取溶剂和提取方法，将待测成分充分地从药物中提取出来，同时还要尽可能的除去杂质(包括其它中药成分以及辅料成分)，减少杂质对待测成分色谱峰的影响，因此，样品溶液制备对HPLC检测的灵敏度和准确度有至关重要的影响。

首先，我们比较了以水、不同浓度甲醇和乙醇作为提取溶剂对HPLC图谱的影响，结果发现以水或乙醇作为提取溶剂，图谱中杂质峰较多，特征峰面积小且分离度低，而以50％甲醇作为提取溶剂，杂质峰相对较少，特征峰面积相对较大且分离度相对更高。

接着，为进一步提高分离度和峰面积，我们比较了50％甲醇、含有表面活性剂的50％甲醇对图谱的影响，具体方法如下：

样品溶液制备：取黄芪桂枝五物颗粒，研细，取约0.5g，精密称定，置100ml具塞锥形瓶中，分别精密加入50％甲醇或含有0.5％(体积)聚山梨酯80的50％甲醇50ml作为提取溶剂，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。

仪器：Agilent1260型高效液相色谱仪系列(美国安捷伦科技公司，包括四元泵、自动进样器、柱温箱、紫外检测器、Open lab 2.0色谱工作站)

流动相：乙腈为流动相A，0.1％的磷酸溶液为流动相B。

梯度洗脱条件：

柱温：25℃；检测波长：220nm；进样量：10ul

结果：以50％甲醇(含0.5％聚山梨酯80)作为提取溶剂(图1)，图谱中杂质峰较少，四种待测成分的色谱峰峰形好、分离度高且峰面积较大。而以50％甲醇作为溶剂(图2)，明显可以看出保留时间为10.508min的毛蕊异黄酮葡萄糖苷有干扰，色谱峰未能完全分离，27.859min的桂皮醛峰面积减少，32.9min的6-姜辣素峰面积大幅减少。因此，向提取溶剂中加入聚山梨酯80能改善待测成分的峰形和分离度，提高峰面积，从而提高检测的灵敏度和准确度。

实施例2检测波长的选择

样品溶液制备：以50％甲醇(含0.5％聚山梨酯80)为提取溶剂，制备方法与实施例1中相同。

检测波长：200nm、220nm、230nm、260nm、280nm

其它条件与实施例1相同。

结果：波长为200nm时，基线发生漂移，毛蕊异黄酮葡萄糖苷的色谱峰未完全分离；波长为230nm时，各色谱峰响应值缩小，峰面积与220nm下相比下降，对含量测定的灵敏度会有一定的影响；波长为260nm时，6-姜辣素的色谱峰几乎不显示；波长为280nm时，8.707mim的芍药苷色谱峰面积急剧下降，故选择220nm作为最佳检测波长。

实施例3流动相的选择

(1)A为乙腈，B为0.1％磷酸水溶液

(2)A为乙腈，B为0.02％磷酸水溶液

(3)A为乙腈，B为0.3％磷酸水溶液

检测波长：220nm

其它条件与实施例1相同。

结果：条件(1)时，四种待测成分的峰形和峰分离度较好，基线平稳；条件(2)时，各色谱峰分离度不合格，峰形亦较差；条件(3)时，各色谱峰分离效果与条件(1)相同，但流动相磷酸含量较高，对色谱柱的寿命和环保均有负面影响。故选择乙腈和0.1％磷酸水溶液作为最佳流动相。

实施例4流动相梯度洗脱条件选择

流动相：A为乙腈，B为0.1％磷酸水溶液

柱温：25℃；检测波长：220nm；进样量：10ul

梯度洗脱条件：

结果：图7中，毛蕊异黄酮葡萄糖苷色谱峰未完全分离；图8中，各色谱峰峰形和峰分离度较好，但耗时过长。

实施例5方法验证

1.四种物质的定位与系统适应性试验

(1)试验方法

取黄芪桂枝五物颗粒，混匀，研细，取约0.5g，精密称定，置100ml具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇(含0.5％聚山梨酯80)50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。

流动相：乙腈为流动相A，0.1％的磷酸溶液为流动相B。

梯度洗脱条件：

柱温：25℃；检测波长：220nm；进样量：10ul

(2)计算方法：

W_i为各特定物质的百分含量

C_i对为各特定物质对照品溶液的浓度(mg/ml)

A_i对为各特定物质对照品溶液的峰面积

A_i样为各特定物质峰面积

W_样为样品称样量(g)

(3)分析方法验证

对照品溶液的配制：分别精密称取芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、桂皮醛、6-姜辣素的标准品适量，加甲醇制成每1ml分别含芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、桂皮醛、6-姜辣素各60ug、50ug、10ug、50ug的混合溶液。

供试品溶液的配制及测定方法：按上述实施案例中确立的样品溶液制备方法及液相色谱条件进样测定。

测定结果见表1。

表1四种物质的定位与系统适应性试验结果表

物质名称	保留时间	分离度
			芍药苷	8.897	2.39
毛蕊异黄酮葡萄糖苷	10.462	1.53
			桂皮醛	27.832	5.36
6-姜辣素	32.933	4.22

2.线性

在定量限浓度至各成分含量限度的150％内，在该范围内分别制备不同浓度的各对照品溶液，精密吸取10μl注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定，以峰积分面积对进样量进行线性回归，得四种成分回归方程，和相关系数r。结果表明，由相关系数r证实线性关系良好。

3.重复性

对同一批黄芪桂枝五物颗粒制备六份供试品溶液，按上述实施案例中确立的样品溶液制备方法及液相色谱条件进样测定。要求6次含量测定结果的相对标准差应不大于2.0％，结果表明：各成分的RSD值在要求范围内，表明检测方法的重复性结果良好。

4.准确度

通过加入已知量的各组分，再依法测定，用实测值与供试品中含有量之差，除以加入对照品量计算回收率。要求回收率在95.0％-105.0％之间，结果表明：该方法测定各物质的准确度良好。

实施例6样品测定

(1)供试品溶液的制备：取黄芪桂枝五物颗粒，混匀，研细，取约0.5g，精密称定，置100ml具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇(含0.5％聚山梨酯80)50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。

(2)对照品溶液的制备：分别精密称取芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、桂皮醛、6-姜辣素的标准品适量，配成每1ml分别含芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、桂皮醛、6-姜辣素各60ug、50ug、10ug、50ug的混合对照品溶液。

(3)色谱条件与系统适应性：仪器：Agilent1260型高效液相色谱仪系列(美国安捷伦科技公司，包括四元泵、自动进样器、柱温箱、紫外检测器、Open lab 2.0色谱工作站)

流动相：乙腈为流动相A，0.1％的磷酸溶液为流动相B。

梯度洗脱条件：

柱温：25℃；检测波长：220nm；进样量：10ul

(4)测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl注入液相色谱仪，测定。

(5)计算公式：见实施例5。

(6)结果：所测得的各物质的含量见表2。

表2 3批样品中四种物质的含量

批次	芍药苷	毛蕊异黄酮葡萄糖苷	桂皮醛	6-姜辣素
					181001	0.6105％	0.0068％	0.0375％	0.0236％
181002	0.5841％	0.0076％	0.0336％	0.0251％
					181003	0.6029％	0.0065％	0.0383％	0.0228％

Claims

1.一种同时检测黄芪桂枝五物颗粒中四种成分含量的方法，其特征在于：所述四种成分为芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、桂皮醛、6-姜辣素，该方法包括将待测样品用提取溶剂30～80％甲醇提取，提取液过滤后直接上高效液相色谱仪进行检测的步骤，所述高效液相色谱仪含有紫外检测器，所述紫外检测器的设定检测波长为210～250nm，所述高效液相色谱仪的色谱柱为C18色谱柱，流动相为重量浓度为0.02～0.3％的磷酸水溶液与乙腈的混合液，采用梯度洗脱，柱温为20-40℃，理论板数按芍药苷峰计应不低于4000。

2.如权利要求1所述同时检测黄芪桂枝五物颗粒中四种成分含量的方法，其特征在于：所述提取溶剂为50％甲醇。

3.如权利要求1所述同时检测黄芪桂枝五物颗粒中四种成分含量的方法，其特征在于：所述提取溶剂中还含0.5％体积的聚山梨酯80。

4.如权利要求1所述同时检测黄芪桂枝五物颗粒中四种成分含量的方法，其特征在于：所述紫外检测器的设定检测波长为220nm。

5.如权利要求1所述同时检测黄芪桂枝五物颗粒中四种成分含量的方法，其特征在于：所述流动相为重量浓度为0.1％的磷酸水溶液与乙腈的混合液。

6.如权利要求1所述同时检测黄芪桂枝五物颗粒中四种成分含量的方法，其特征在于：所述梯度洗脱中，各时间段及流动相中乙腈所占的体积比分别为：0～15min，乙腈15～25％；15～40min，乙腈25～70％。